博士（医学）林 宏恵 学位論文題名
JC ウイルス初期転写領域の腫瘍原性の解析 及びヒト髄芽腫との関連に関する検討
学位論文内容の要旨
［目的と背景］
JC virusくJCV)は ヒ ト 脳の脱 髄性疾 患であ る進行 性多巣 性白質 脳症progressive multifocal leukoencephalopathy (PML)の 原 因virusで ある ．JCVは 同属 のpolyomavirusで あ るsimian virus 40 (SV40)，BK virus (BKV)と同様に 実験的 に新生 仔hamster脳に腫瘍原性がある事が示 さ れ てお り ， 脳 腫瘍 と の 関連性 が示唆 されてい るが， 未だそ の詳細 な機構 にっい ては解 明さ れ て い な い ．Polyomavirusのtransform能 の 解 析 では ， 現 在 まで にSV40で の 研 究が 詳 細 に 行 わ れ て き て い る ． JCVはSV40とDNA全 体 で69％ のhomologyを 有 し ， かつ 腫 瘍 化 に関 連 す るLargeT(LT)遺 伝 子 で は72％ のhomologyを 持 つ ． 現 在 ま で の 報 告 で は ，JCVのLT抗 原 （ 蛋白 ） のtransform誘 導 能 はSV40のLT抗 原 のtransform誘 導 能よ り 著 しく低 いとレ ゝう 結 果 が発 表 さ れ てい る ． しかし 通常LTとsmallt (st)とは 同じframeから翻訳 される ため，LT 単 独 の機 能 は 不 明で あ っ た ．そ こ で 著 者ら は ，JCVのLTの み を発 現 す るplasmidを構 築し，
NIH3T3細 胞を 用 い てstable transformantを 作製 し ，腫瘍 原性の有 無を解 析し， その強 度を SV40，BKVと 比較 検 討 し た． ま た 最 近、JCVが ヒ トmedulloblastomaの発 生 に 関 連し て い る と い う報 告 が あ り， 再 びJCVとヒ ト 脳 腫 瘍と の 関 連性 が注目を 集めて きてい る，そ こで． ヒ トmedulloblastomaの 手 術 材 料 を 用 い てJCVのLT遺 伝 子 と そ の 蛋 白 の 有 無 を 検 討 し た ．
［対象と方法］
1． Mouse線 維 芽 細 胞 で あ るNIH3T3細 胞 にJCV，SV40，BKVのLT遺 伝 子 の み を 単 独 で 発 現さ せるplasmids，すな わちJCLT, SV40LT, BIく工Tを構築し，それらをPCXN2―Flag vectorに 組 み 込 みLTのtransform能 をcolony formation assay， 細 胞 増 殖 能 の 検 討 に 用 い た ． 2． LTとstを判 別する 為に，JC virus smallt (JCst)に対する抗体の作製を試みた．JCstは172 個 のamino acid残 基 か ら な り ，688個 のJCLTとN末 端 の81残 基 が 同 じframeか ら 翻 訳 さ れ ， そ の 後splicingに よ り 異な っ た 蛋 白と し て 作 られ る ． そ こでJCLTと 交 差 し ないC末 端 の16残基を抗原として抗体を作製した，
3． ヒ ト 脳 腫瘍 とJCLTの 関 連性 を 調 ぺ る為 に ヒ ト 小脳 に 発 生 したmedulloblastomaの手術材 料を用いてJCV遺伝子の有無をPCR，genomic Southern blotting，in situ hybridization (ISH)法，
および免疫染色法にて検討を行った．
一417―
［結果］
1） Transform能の解析：NIH3T3を 用いてJCLT, SV40LTおよびBKLTをstableに発現する cloneをそれぞれ3cloneずつ樹立した．Colony formation assayの結果，JCLTを組み込んだ NIH3T3細 胞はSV40LT，BKLTを組 み込 んだNJJ‑13T3細胞よりはやや低いものの，これら とほぼ同等のtransform能を誘導する事が判明した．さらに細胞増殖能とtransform能が比例 していた．
2） JCst抗体 の検討：JCLTと交差しないJCstのC末端の16残基を抗原として抗体を作製 し，抗体の感度と特異性をJCV持続感染細胞(JCI)およびJCV transformed hamster cell line (Med‑l)を用いて調べたところ，感染細胞及び腫瘍化細胞のいずれにおいても予想される分 子量の位置にstが発現していることが判明した．非感染 細胞のIMR‑32は陰性であり，抗 体が特異的であると思われた．またヒトPML脳においてはJCV感染oligodendrogliaの核内 に陽性となった。
3） ヒ トmedulloblastomaとJCV genomeと の 関 連 ： ヒ ト 小 脳 に 発 生 し た8例 の medulloblastoma（6例の凍結手術材料と3例のparaffin‑embedded tissue)を用レュてJCV感染 の有無をPCR，genomic Southern blotting，ISH，免疫染色にて検討を行った．その結果8例の ヒト のmedulloblastomaではいずれ の方法においてもJCV genomeは検出されなかった．
［考察］
現在までのRat2細胞を用いた実験ではJCLTのtransform能がないと報告されているが，今 回JCstを欠いたJCLTでNIH3T3細胞に高い腫瘍原性を示し た．このことは，我々の実験で 使用したPCXN2‑Flag vectorのpromoterがJCVの野生型promoterより非常に強カな機能を 持つ 事と ，mouseの培 養細 胞 に対 して 高い 活性 を持 つ特 徴を 有す る為と考えられた．
JCstの抗体が作られ，これを用いた解析で，JCVによってtransformレた細胞とJCVに感 染した細胞の両方にJCstが発現していることが明らかとなった，
ヒトのmedulloblastomaの検索で，いずれの方法でも陰性であった。我々は凍結保存材料 からDNAを抽出して検討して おり，報告された論文に比してより正確な結果が得られたも のと考えられた，1症例のVP領域にて増幅されるbandが出現したが，PCRによる非特異的 増幅産物であった．
［結語］
1． JCVSV40，BKVのLTのみを発現するNIH3T3細胞株を樹立し，colony formation assayを 行った結果，SV40やBKVと同 様にJCLTもrodent cellをtransformさせることが判明レた．
ま た い ず れ のtransformantで も 細 胞 増 殖 能 の 増 加 が 見 ら れ た ． そ の 活 性 は SV40LT>B1:く工T>JCLTの順であった．
2． JCstに対する抗体を作製し，JCstがJCV感染細胞および腫瘍化細胞で発現していることを 明らかにした．
3．ヒトmedulloblastoma8例についてPCR法，genomic Southern blotting，ISH法，および免疫 染色法で検討したが，いずれの方法においてもJCV genomeの存在は認められなかった．
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学位論文審査の要旨
学 位 論 文 題 名
JC ウイルス初期転写領域の腫瘍原性の解析 及びヒト髄芽腫との関連に関する検討
JC virus (JCV)はヒト脳の脱髄性疾患である進行性多巣性白質脳症progressive multifocal leukoencephalopathy (PML)の原因virusである。JCVは同属のpolyomavirusであるSV40， BKVと同様、 実験的に新生仔ハムスター脳に腫瘍原性がある事が示されており、脳腫瘍と の関連性が示唆されているが、未だその詳細な機構については解明されていない。最近、
JCVがヒト髄 芽腫の発生に関連しているという報告があり、再びJCVとヒト脳腫瘍との関 連性が注目を集めてきている。一方、トランスフオーム能の解析では、現在までにSV40で の研究が詳細に行われてきている。JCVはSV40とDNA組成で69 010の相同性を有し、かつ 腫瘍化に関連するする大型T抗原遺伝子では720/0の相同性があり、JCVの腫瘍化機構の解 析が興味の対象となってきている。現在 までの報告では，JCVの大型T抗原蛋白のトラン スフオーム誘導能はSV40の大型T抗原蛋白のトランスフオーム誘導能より著しく低いとい う結果が発表されている。しかし通常大 型T抗原と小型t抗原とは同じフレームから翻訳 され るた め、 大型T抗原単独の機能は不明であった 。そこで著者らは、JCVの大 型T抗原 のみを発現するプラスミドを構築し、NIH3T3細胞を用いてク口一ン化細胞を作製し、腫瘍 原性の有無を解析し、その強度をSV40，BKVと比較検討した。又、注目されているヒト髄 芽腫との関連に関しては、ヒト手術材料 を用いてJCVの大型T抗原遺伝子とその蛋白の有 無を解析した。その結果、以下の4点が明らかとなった：
11 Transform能の 解析 ：NIH3T3を 用い てJCLT, SV40LTおよびBKLTをstableに発現する cloneをそれぞれ3cloneずっ樹立した，Colony formation assayの結果，JCLTを組み込んだ NIH3T3細 胞 はSV40LT，BKLTを 組み 込ん だNIH3T3細 胞よ りは やや 低い もの の， これ ら とほぼ同等のtransform能を誘導する事が判明した．さらに細胞増殖能とtransform能が比例 していた．
2、 JCst抗体 の検 討：JCLTと交差しないJCstのC末 端の16残基を抗原として抗体を作製 し．抗体の感度と特異性をJCV持続感染細胞(JCDおよびJCV transformed hamster cell line
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郎 敬
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授 授
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教 教
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査 査
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主 副
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(Med‑l)を用いて調べたところ，感染細胞及び腫瘍化細胞のいずれにおいても予想される分 子量の位置にstが発現している ことが判明した，非感染細胞のIMR−32は陰性であり，抗 体が特異的であると思われた． またヒトPML脳においてはJCV感染oligodendrogliaの核内 に陽性となった。
3） ヒ 卜medulloblastomaとJCV genomeと の 関 連 ： ヒ ト 小 脳 に 発 生 し た8例 の medulloblastoma（6例の凍結手術材料と3例のparaffin‑embedded tissue)を用いてJCV感染 の有無をPCR，genomic Southern blotting，ISH，免疫染色にて検討を行った．その結果8例の ヒト のmedulloblastomaではいずれの方法においてもJCV genomeは検出されなか った。
口 頭 発表 にあたり、副査の古木教授から、1） NIH3T3細胞以外でJCVによるト ランス フ オ ー ム 能の 報告 につ いて 、2） 大型T抗 原 と小 型t抗原 の局 在に つい て 、31小型t抗 原遺伝子の機能につしゝて、4） 1999年発表のProc Natl Acad SciUSAの報告との差異に関 しての質問があった。続いて副査の守内教授から、1） PCR assayの結果について、2）この 論文のまとめ方について。更に主査の長嶋から、1） JCLTがNLH3T3細胞強卜ランスフオー ム能を示した点、2） smallt抗体でmedulloblastomaを検討したかについての質問を行った。
これらの質問に対して発表者は 豊富な知識と文献例を引用し、ほぼ妥当な解答をした。
こ の 論文 は、JCVの大 型T抗 原が 単独 でNIH3T3細胞のトランスフオーム誘導能 を有す ることを明らかにした。さらに、JCVはヒト髄芽腫には直接関係していないことを示した。
審査員一同は、これらの成果を高く評価し、申請者が博士（医学）の学位を受けるのに充分 な資格を有するものと判定した。
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