博士（医学）福良嚴宏 学位論文題名
胆道癌の神経周囲浸潤に関する検討：
特 に GDNF ， RET と の 関 連 に つ い て 学位論文内容の要旨
背景と目的
膵 癌で は病 理組 織学 的に 認識 され る神 経周 囲浸 潤が 局所 再 発の 大き な要因とな っており重要 な 予 後 因 子 の1っと して 知ら れて いる が ，胆 道癌 でも 高率 に胆 管壁 外の 問質 内に 神経 周囲 浸潤 を き たす こと が知 られ てい る， 中脳 ドー パミ ン作 動性 神経 細 胞の 生存 に強カな効 果を持つ神経 栄養因子のーつであるGrial ceLl l:ine‑derived neurotrophic factor（以下GDNF)はバーキンソン病や 筋 萎 縮 性 側 索硬 化症(ALS)の よう な神 経 変性 疾患 にお いて その 治療 効果 が期 待さ れて いる が，
一 方 で 神 経 と 癌 細 胞 の 親 和 性 に 関 わ る 因 子 と し て も 注 目 さ れ ，GDNFが その レセ プタ ーRETを 発 現 し て い る 癌 細 胞 に 対 し て 浸 潤 誘 導 能 を も た ら す と の 報 告 が あ る．RETは，GDNFファ ミリ ー 分 子 を り ガ ン ド と し ，GDNFレ セ プ タ ー 凹 （ 以 下GFRQ ‑1)と 複 合 体 を 形 成 し て 生 理 的 に は 神 経 の 分 化 ，腎 の発 生に 関与 する こと が知 られ てい る． またRET遺 伝子 はそ の活 性型 変異 によ っ て 甲状 腺髄 様癌 ，副 腎褐 包細 胞腫 など を発 症す る多 発性 内 分泌 腫瘍 症を，また 不活性型変異 に よ ってHirschsprung病を 発症 する など ，複 数の 疾患 の原 因 遺伝 子で あることが 明らかとなっ て い る ． し か し な が ら 胆 道 癌 に お け るGDNF，RET，GFRa‐1の 役 割 は 明 ら か で な い ， 今 回 申 請 者 は胆 道癌 の神 経周 囲浸 潤と 予後 との 関係 を検 討し ，さ ら に神 経栄 養因 子の1つ であ るGDNFお よ び そ の レ セ プ タ ー で あ るRET，GFRa−1の 発 現 と 神 経 周 囲 浸 潤 と の 関 係 を 検 討 した。
方法
対 象 は1990年 よ り2001年 ま で の 間 に 北 大 第2外 科 で 切 除 さ れ た 胆 道 癌134症 例（ 肝 外胆 管 癌64症 例 ， 乳 頭 部 癌12症 例 ， 胆 嚢 癌39症 例 ， 肝 内 胆 管 癌19症 例 ） ， お よ び 非 癌胆 道 （正 常 胆 道） 組 織4症例 とし ，胆 道癌 全体 お よび 肝外 胆管 癌， 胆嚢 癌の 予後 と神 経周 囲浸 潤と の関連 をKaplan‑meier (Log‑rank)法を 用い調べた．統計学的解析はpく0.05をもって有意差ありとした．
次 に 全 症 例 の ホ ル マ リ ン 固 定 標 本 を 抗GDNF抗 体 ， 抗GFRa，1抗 体 ， 抗RET抗 体 を1次 抗 体 と し て 免 疫 組 織 化 学 的 に 染 色 し ， 胆 道 癌 全 体 お よ び 胆 道 癌 部 位 別 のGDNF，GFRQ・1，RETの
発 現 と 神経 周囲 浸潤 との 関連 を調 べた ．Fisher検定 法，Mann‑WhitneyのU検 定法 を用 い ，統 計 学 的 解 析 はpく0.05を も っ て 有 意 差 あ り と し た ．
結果
胆 道癌 全体 お よび 肝外 胆管 癌， 胆嚢 癌の 予後 と神 経周 囲浸 潤と の関 連 では 肝外 胆管癌，胆嚢 癌 に お い て 有 意 差 を 認 め た ． 胆 道 癌 全 体 で も 同 様 に 有 意 差 を 認 め た ．GDNF，GFRa・1，RET の 免 疫 組 織 化 学 的 発 現 に つ い て はGDNF，GFRa．1，RETの い ず れ も が 正 常 胆 管 お よ び 胆 嚢 上 皮 細 胞 の 胞 体 内 に 顆 粒 状 の 陽 性 所 見 を 示 し ， いず れも 強陽 性で あっ た． 一方 胆道 癌に お いて もGDNF，GFRQ―1，RETの 発 現 が 認 め ら れ た が ， そ の 強 度tま 様 々 で あ っ た ．GDNF, GFRQ− 1，RETの 発 現 強 度 と 神 経 周 囲 浸 潤 と の 関 連 に つ い て はIGDNFに 関 し て は 肝 外 胆 管 癌 に て 染 色の強度が強いほど神経周囲浸潤が有意に増した， GFRQ，1に関しては乳頭部癌にて染色の強 度 が 強 い ほ ど 神 経 周囲 浸潤 が有 意に 増し た．RETに 関し ては 肝外 胆管 癌， 胆嚢 癌， 肝内 胆 管癌 に て 染 色 の 強 度 が 弱く なる ほど 神経 周囲 浸潤 が有 意に 増し た ．胆 道癌 全体 ではRETに関 し て染 色の強度が弱くなるほど神経周囲浸 潤が有意に増した．
考 察と まと め
胆道 癌の 神経 周囲 浸潤 と予 後の 検討 にお い て神 経周 囲浸 潤が 胆道 癌の 予後 因子 のーつである こ と が 確 認 さ れ た ． 今 回 申 請 者 は 神 経 栄 養 因 子 の ー つ で あ るGDNF， そ の 受 容 体 で あ るGFRa
・1，RETに 注目 し， これ らが ，胆 道癌 にお け る神 経周 囲浸 潤に 何ら かの 影響 を与 えているので は な い か と 考 え 免 疫 組 織 化 学 的 検 討 を 行 っ た ． 正 常 例 で はGDNF，GFRa−1，RETは す べ て の 胆 管 ま た は 胆 嚢 上 皮 細 胞 の 胞 体 に 局 在 し 発 現 し て い た ， 胆 道 癌 に お い て はGDNF，GFRa―1， RETは 発 現 を 認 め た が ， そ の 強 度 は 様 々 で あ っ た ． 胆 道 癌 は そ の 組 織 型 から 発生 母地 が 腺管 上 皮 と 考 え ら れ る が ， 腺 管 上 皮 が 癌 化 し て も 癌 細 胞 がGDNF，GFR 01‑1，RETを発 現さ せ る形 質 を 残 し て い る も のと 考え られ た， しか し免 疫組 織化 学的 解 析の 結果 から みる と特 にRETにお い ては 神経 周囲 浸潤 が進 行し た症 例で 有意 に その 発現 が減 弱し てい た， 正常 例で はすべての症 例 でRETの 発 現 が 強 陽 性 で あ っ た こ と か ら 推 測 す る と ， 癌 化 し た 細 胞 に お い てRETを 発 現 さ せ る遺 伝子 が不 活性 型変 異を 起し ，そ の変 異 によ り何 らか の機 序が 加わ り神 経周 囲浸潤が起こ り やす くな るこ とが 示唆 され た。 一方 ，GDNFに関 して は肝 タ糊 旦管 癌に て染 色の 強度が強いほ ど 神経 周囲 浸潤 が有 意に 増し たが ，正 常組 織 の染 色の 強度 がす べて 強陽 性で あっ たことを考え る と神経周囲浸潤を来し た癌細胞には著明な変化は起こっていないものと思われ た． GFRa．1 に 関 し て は 乳 頭 部 癌 に て 染 色 の 強 度 が 強 い ほ ど神 経周 囲浸 潤が 有意 に増 し，GDNFと同 様 のこ と が考 えら れた が症 例数 が少 なく 今後 の検 討 が必 要で ある ，
胆 道 癌 の 神 経 周 囲 浸 潤 に は ， 神 経 栄 養 因 子 の ひ と つ で あ るGDNFの レ セ プ タ ーRETが 何 ら か の 形 で 関 与 し ， 胆 道 癌 の 予 後 に 強 く 影 響 を 与 え て い る こ と が 示 唆 さ れ た ．
学位論文審査の要旨
学 位 論 文 題 名
胆道癌の神経周囲浸潤に関する検討：
特 に GDNF ， RET と の 関 連 につ い て
膵 癌で は病 理組 織学 的に 認識 され る神 経 周囲 浸潤 が局 所再 発の 大き な要 因と なっており重要 な 予 後 因 子 の1っ とし て知 られ てい るが ，胆 道癌 でも 高 率に 胆管 壁外 の問 質内 に神 経周 囲浸 潤 をき たす こと が知 られ てい る． 中脳 ドー バ ミン 作動 性神 経細 胞の 生存 に強 カな 効果を持つ神経 栄養因子のーつであるGrial cell line‑derived neurotrophic factor（以下GDNF)はノヾーキンソン病や 筋 萎 縮 性 側 索硬 化症(ALS)のよ うな 神経 変性 疾患 にお い てそ の治 療効 果が 期待 され てい るが ， 一 方 で 神 経 と 癌 細 胞 の 親 和 性 に 関 わ る 因 子 と し て も 注 目 さ れ ，GDNFが その レセ プ ターRETを 発 現 し て い る 癌 細 胞 に 対 し て 浸 潤 誘 導 能 を も た ら す と の 報 告 が あ る．RETは ，GDNFフ ァミ リ ー 分 子 を り ガ ン ド と し ，GDNFレ セ プ タ ーQ（ 以 下GFRa ‑1)と 複 合 体 を 形 成 し て 生 理 的 に は 神 経 の 分 化 ，腎 の発 生に 関 与す るこ とが 知ら れて いる ．ま たRET遺伝 子は その 活性 型変 異に よ って 甲状 腺髄 様癌 ，副 腎褐 色細 胞腫 など を 発症 する 多発 性内 分泌 腫瘍 症を ，ま た不活性型変異 によ ってHirschsprung病を 発症 する など ， 複数 の疾 患の 原因 遺伝 子で ある こと が明らかとなっ て し ゝ る ． し か し な が ら 胆 道 癌 に お け るGDNF，RET，GFRa‐1の 役 割 は 明 ら か で な い ． 今 回 申 請 者 は胆 道癌 の神 経 周囲 浸潤 と予 後と の関 係を 検討 し， さら に神 経栄 養因 子 の1つで あ るGDNFお よ び そ の レ セ プ タ ー で あ るRET，GFRa‐1の 発 現 と 神 経 周 囲 浸 潤 と の 関 係 を 検 討 した。
対 象 は1990年 よ り2001年 ま で の 間 に 北 大 第2外 科 で 切 除 さ れ た 胆 道 癌134症 例 （ 肝 外 胆 管 癌64症 例 ， 乳 頭 部 癌12症 例 ， 胆 嚢 癌39症 例 ， 肝 内 胆 管 癌19症 例 ） ， お よ び 非 癌 胆 道 （ 正 常 胆道 ）組 織4症 例と し， 胆道 癌全 体お よび8干外 胆管 癌， 胆嚢 癌の 予後 と神 経周 囲浸潤との関連 をKaplan‑meier (Log−rank）法を用い調べた，統計学的解析はpく0．05をもって有意差ありとした．
次 に 全 症 例 の ホ ル マ リ ン 固 定 標 本 を 抗GDNF抗 体 ， 抗GFRa・1抗 体 ， 抗RET抗 体 を1次 抗 体 と し て 免 疫 組 織 化 学 的 に 染 色 しt胆 道 癌 全 体 お よ び 胆 道 癌 部 位 別 のGDNF，GFRば ‐1，RETの 発現 と神 経周 囲浸 潤と の関 連を調べた．Mann‐WMmeyのU検定法 を用い，統計学的解析はpく0．05 をもって有意差ありとした．
之
郎 彦
紘
和 敏
藤 嶋
永
加 長
岩
授 授
授
教 教
教
査 査
査
主 副
副
胆道癌全体および肝外胆管癌，胆嚢癌の予後と神経周囲浸潤との関連では肝外胆管癌，胆嚢 癌 にお いて有 意差 を認めた．胆道癌全体でも同様に有意差を認めた．GDNF，GFRa‐1，RET の 免疫 組織化 学的 発現についてはGDNF，GFR01‑1, RETのいずれもが正常胆管および胆嚢上 皮細胞の胞体内に顆粒状の陽性所見を示し，いずれも強陽性であった．一方胆道癌において もGDNF，GFRQ‐1，RETの発 現が 認め られ たが ，そ の強 度は 様々 であっ た．GDNF，GFRa ‑ 1，RETの発現強度と神経周囲浸潤との関連については，RETに関しては肝外胆管癌，胆嚢癌，
肝内胆管癌にて染色の強度が弱くなるほど神経周囲浸潤が有意に増した，胆道癌全体ではRET に関して染色の強度が弱くなるほど神経周囲浸潤が有意に増した．
胆道癌の神経周囲浸潤と予後の検討において神経周囲浸潤が胆道癌の予後因子のーつである こ とが 確認さ れた ．今回申請者は神経栄養因子のーつであるGDNF，その受容体であるGFRa
・1，RETに注目し，これらが，胆道癌における神経周囲浸潤に何らかの影響を与えているので は ない かと考 え免 疫組織化学的検討を行った，正常例ではGDNF，GFRdー1，RETはすべての 胆管または胆嚢上皮細胞の胞体に局在し発現していた．胆道癌においてはGDNF，GFRd・1， RETは発現を認めたが，その強度は様々であった．胆道癌はその組織型から発生母地が腺管 上 皮と 考えら れる が，腺管上皮が癌化しても癌細胞がGDNF，GFRa．1，RETを発現させる形 質を残しているものと考えられた．しかし免疫組織化学的解析の結果からみると特にRETにお いては神経周囲浸潤が進行した症例で有意にその発現が減弱していた．正常例ではすべての症 例 でRETの発 現が 強陽性であったことから推測すると，癌化した細胞においてRETが低発現 となり，それにより何らかの機序が加わり神経周囲浸潤が起こりやすくなることが示唆された。
以上より胆道癌の神経周囲浸潤には，神経栄養因子のひとつであるGDNFのレセプターRET が 何 ら か の 形 で 関 与 し ， 胆 道 癌 の 予 後 に 強 く 影 響を 与 え て い る こ と が 示 唆 さ れ た ， 口頭発表にあたって岩永教授から腹腔神経節をpositive controlとしたときに染まる部位につ いて，CSAキットの感度について，浸潤された神経束について，元来存在していたものなのか 外から入って来た神経束なのかなどの質問がなされた．長嶋教授からは，GFRa・1，RETレセ ブ ター の違い ，染 色の 違い につ いて ，RETが胆 管の付属腺で染まっていたがGDNFではどう で あっ たか，SAB法とCSA法 の違 いは なに か，RETの低発現により神経周囲浸潤が多くなる ことの解釈についての質問がなされた．最後に加藤教授から今回の研究を通して外科的治療方 針についての考えについて，今後の研究の展開についての質問がなされた．申請者はおおむね 妥当な回答をした．
胆道癌の神経浸潤に関しRETとの関連を明らかにした上で予後の予測、治療への応用の可能 性を示唆した本研究の意義は大きく、審査員一同協議の結果、本論文は博士（医学）の学位授 与に値するものと判定した，
