博 士 （ 水 産 学 ） 清水 宗 敬 学 位 論 文 題 名
ImmunochemiCalandBiOChemiCalStudieSOnPreCurSOrSOf ViteuineEnVelopeProteinSinSerumofSakhalinT甜men旧むCカDウ￠門ツ砂 （ イ ト ウ 血 清 中 の 卵 膜 蛋 白 前駆 物 質に 関 す る免 疫 生化 学 的 研究 ）
学位論文内容の要旨
硬 骨魚類の 卵は、胚 体を外部 環境から保 護する役 目を持っ た卵膜(vitelline envelope，VE)に包 ま れて いる。こ れまで卵 膜を構成 する蛋白は 卵巣内で 産生 さ れると考 えられて いた。最 近、メダカ を用いた 一連の研 究により 、本種の卵 膜 蛋 白 はエ ス トラ ジ オ ール‑17p (E2)の作 用により 肝臓で合成 、された 後、血 流 を介して 卵巣に運 ばれるこ とが明らか となり、 この血中 卵膜蛋白 前駆物質を コ リ オ ゲニ ン と呼 ぶ こ とが 提 唱さ れ た(Yamagami，1996)。サケ科魚 類におい て も、卵膜 蛋白が卵 巣外由来 であること が示唆さ れている が、この 蛋白に関し て は未解明 な点が多い。本研究は、肝臓一血液．卵巣を経路とするサケ科魚類の 卵 膜形成機 構を明ら かにする ことを目的 とし、免 疫生化学 的手法を 用いてイト ウ(llucho perryi)の卵膜蛋 白前駆物 質の検索と精製を行い、さらにE2処理およ び成熟に伴う血清中の動態を調べた。
供 試魚は、 北大水産 学部附属 七飯養魚実 習施設で 飼育中の イトウを 用いた。
孵 化 直 後に 得 た卵 膜 を 抗原 と して 家 兎 に免 疫 し 、抗 卵膜血清(a‑VE)を作製し た 。a‑VEを用い て卵膜抽 出液、雌 雄成熟魚の 血清と肝 抽出液お よびE2処理魚の 血 清と肝抽 出液をオ クタロニ ー法により 解析した ところ、 雄成熟魚 を除いて免 疫 沈降反応 が観察さ れた。ま た、免疫電 気泳動法により雌血清中にはaーVEと反 応する卵膜関連蛋白(vitelline envelope‑related protein，VERP)が少なくとも2成 分 存在する ことが明 らかとな った。これ らの結果 から、イ トウにお いても卵膜
蛋 白 が 肝 臓 で 合 成 さ れ 、 血 中 に 分 泌 さ れ る こ と が 示 唆 さ れ た 。 SDS‑PAGE で の分 子量か ら2 つ の VERP をそ れぞ れ hVERP およびlVERP (high and low molecular weight VERP) と名付け、これら2 成分の精製を試みた。卵黄 形成期の雌魚血清を50% 飽和硫安により塩析し、沈殿画分を陰イオン交換クロ マトグラフイー (DE52) に供した。hVERP を含む素通り画分を、吸着クロマト グラフイー（ / ヽイドロキシルアノヾ夕イト）に添加し、0.04M リン酸カリウム (KP) 溶 出 画 分 を得た 。さ らに 陰イ オン交 換ク ロマ トグ ラフイ ー (Mono Q) で分画し、0.05MNaCl 溶出画分をSuperdex 75 カラムを用いたゲル濾過に供した。
分子量 83 kDa の主ピークを得、精製hVERP とした。一方、陰イオン交換クロマ トグラフイーにおいて0.05MNaCl で溶出されたNERP 画分を吸着クロマトグラ フイーで分画し、0.16MKP 溶出画分を得た。この画分をゲル濾過に供し、分 子量56 kDa のピークを再度ゲル濾過をすることによりNERP を精製した。精製 蛋 白を非 還元 下で SDS‑PAGE に 供し た結 果、hVERP では 48 kDa 、NERP では42 kDa と35 kDa （フラグメント）のバンドのみが認められた。精製hVERP はゲル 濾過では分子量約83 kDa であり、SDS −PAGE においては非還元下で48 kDa 、還 元下で54 kDa であった。一方、精製/VERP はゲル濾過で約56 kDa 、SDS −PAGE で は非還元下42 kDa 、還元下46 kDa であった。これらの結果から、hVERP は2 量体、
IVERP は単量体でそれぞれ血中に存在する可能性が示唆された。また、アミノ 酸組成はhVERP ではグルタミン酸（13.76 ％）とプロリン（15.86 070) の含有率が 高く、 IVERP ではグルタミン酸（10.77 ％）とアスパラギン酸（10.53 昵）が高 かった。これらの組成は、メダカのコリオゲニン H およびコリオゲニンL とそ れぞれ類似しており、卵膜という構造蛋白の特徴を反映していると考えられた。
次に、精製品を抗原として家兎に免疫し、特異抗体を作製した。hVERP およ ぴ IVERP に対する各特異抗体は、ウエスタンブロットにおいて雌血清および卵 膜抽出液中の 48 kDa および42 kDa のバンドをそれぞれ特異的に認めた。また、
免疫組織化学的観察においては、両抗体は卵黄球期の卵膜を特異的に認める一
方、hVERP 抗体は周辺仁期の卵母細胞の細胞質を、lVERP 抗体は周辺仁期の卵
―941 ―
の 小 顆 粒を そ れぞ れ 特 異的 に 染色 し た 。こ れ ら の結 果 から 、 イトウ のVERPは 一 旦 卵母細胞 に取り込 まれ、何ら かの分子 変化を受 けた後に 卵母細胞 表面に卵 膜 と して沈着 する可能 性があると 考えられ た。他方 、作製し た各特異 抗体はア メ マス、プ ラウント ラウトおよびサクラマスの成熟雌血清と免疫交叉性を示し、
他 の サ ケ 科 魚 類 に お け るVERPの 検 索 に 有 用 で あ るこ と が 明ら か とな っ た 。 次 に 、Singleraidalimmunodiffusion (SRID)お よ びEnzyme‑linked lmmunosorbentaSsay（EuSA） に よ る轟VERPお よびNERPの 測 定系を 確立した 。 EuSAの 測定限界 はハ厄RPでは15．8ng/ml、〜ERPでは47．4ng/Inlであった。これ ら を用いてl三2処理お よび成熟期の血中量を測定した。E2処理したイトウ未熟魚 の 血清肌電RPおよび′ 、色RPを定量した結果、E2の単一処理（2mg瓜g体重）では 24hr後に轟VEIい（O．3ug／ml）およびf、厄RP（1．6ug/ml）が検出された。一方、
＆の投与量の違い（l一1，Oooいg瓜g体重）により、各VERPの検出に差違が認めら れ た 。 一般 に イト ウ は6歳 の春 に 初回産卵 を行う。3年魚から6年魚まで の雌血 清 中 のVERP量を 測 定し た 結 果、 んVERPと肌RPは共 に3年 魚の9月 において 検出 さ れ 、 卵膜 形 成が こ の 時期 に すで に開始 している ことが示 唆された 。5年魚に お い て は 、 産 卵 前 年 の9月 か ら 血 中 量 は 増 加 し て1月 に 最 大 値 を 示 し た が
（ハ′ERP179土25．lug／，ml，WERP291土52．8ug／・m1）、その後産卵期の5月まで 減 少 した。こ れらの変 化は、血中 レベルに 差はある もののビ テロゲニ ンと概ね 一致していた。
以上 、本研究 ではイト ウの卵膜蛋 白が卵巣 外由来で あること を示し、 サケ科 魚 類 で は初 め て2成分 の 卵 膜蛋 白 前駆物質 、轟VERPおよ び肌RPを精 製し、コ リ オ ゲ ニンと同 定した。 さらに各成 分の測定 系を確立 し、E2処理 および成 熟に伴 う 血 中 量の 動 態を 明 ら かに し た。 一 方 、ハ 厄RPと 肌RPの 合 成調 節、取り 込み および卵膜構築過程の詳細は今後の課題として残された。
学位論文審査の要旨
学 位 論 文 題 名
Immunochemical and Biochemical Studies on Precursors of Vitelline Envelope Proteins in Serum ofSakhむnT甜men（．胤c轟Dpピル尠 （ イ ト ウ 血 清 中 の 卵 膜 蛋 白 前駆 物 質 に関 す る免 疫 生 化学 的 研究 ）
イトウ(llucho perryi)はサケ科イ トウ属に 属し、北海道をはじめ沿海州、サ ハリ ン、南千島 などに分 布する。 近年、そ の個体群 は河川環 境の悪化お よび乱 獲のた め減少して おり、系統群の保護ならびに増養殖の必要性が叫ばれている。
増養 殖を行う上 で健全な 卵を得る ことは重 要である が、それ には親魚の 卵形成 過程を理解する必要がある。
一 般 に 硬 骨 魚 類 の 卵 は 胚 体 を 外 部 環 境 か ら 保 護 す る 役 目 を 持 っ た 卵 膜 (vitelline envelope，VE)に包まれている。これまで卵膜を構成する蛋白は卵巣 内で 産生される と考えら れていた 。最近、 メダカを 用いた一 連の研究に より、
本 種 の 卵 膜 蛋 白 はエ ス ト ラジ オ ール‑17p (E2)の 作 用 によ り 肝臓 で 合 成さ れ た後 、血流を介 して卵巣 に運ばれ ることが 明らかと なり、こ の血中卵膜 蛋白前 駆 物質 を コリ オ ゲ ニン と 呼ぶ こ と が提 唱 され た(Yamagami，1996)。サケ科 魚 類に おいても、 卵膜蛋白 が卵巣外 由来であ ることが 示唆され ているが、 この蛋 白に関しては未解明な点が多い。
本研究 は、肝臓‐ 血液・卵巣を経路とするサケ科魚類の卵膜形成機構を明らか にす ることを目 的とし、 免疫生化 学的手法 を用いて イトウの 卵膜蛋白前 駆物質 の検 索と精製を 行い、さ らにE2処理 および成 熟に伴う 血清中の 動態を調べ た。
孵 化 直後 に 得 た卵 膜 を抗 原 と して 家 兎 に免 疫 し、 抗 卵 膜血 清(a‑VE)を作製 した 。a‑VEを用いた 免疫電気 泳動法の 結果から 雌血清中 にはa‑VEと反 応する卵 膜関連蛋白(vitelline envelope―related protein，VERP)が少なくとも2成分存在す ることが明らかとなった。
SDS‑PAGEで の 分 子 量 か ら2つ のVERPを そ れ ぞ れhVERPお よ びNERP (high and low moeCularWeightVERP） と名付け、 これら2成 分の精製 を試みた 。成熟 雌血 清から陰イ オン交換 クロマト グラフイ ー、吸着 クロマト グラフイー およぴ
二 彦
雄 平
健
彰
春
晧
崎
城
内
島
原
小
山
授
授
授
授
教
教
教
教
査
査
査
査
主
副
副
副
ゲル濾過によルhVERPおよび/VERPをそれぞれ精製した。ゲル濾過およびSDS‑
PAGEの結果から、hVERPは2量体、IVERPは単量体でそれぞれ血中に存在する 可能性が示唆された。また、hVERPとlVERPのアミノ酸組成は、メダカのコリ オゲニンHおよびコリオゲニンLとそれぞれ類似しており、卵膜という構造蛋 白の特徴を反映していると考えられた。
次に、hVERPおよぴIVERPを抗原として家兎に免疫し、特異抗体を作製した。
各特異抗体は、ウエスタンブロットにおいて雌血清および卵膜抽出液中の48 kDaおよぴ42 kDaのバンドをそれぞれ特異的に認めた。免疫組織化学的観察で は、両抗体は卵黄球期の卵母細胞の卵膜を特異的に認めた。以上の結果から、
VERPはイトウの卵膜蛋白前駆物質すなわちコリオゲニンであると同定した。
また、hVERP抗体は周辺仁期後期の卵母細胞においては細胞質全体を、IVERP 抗体 は細胞質縁 辺部の小顆 粒をそれぞれ特異的に染色した。このことから VERPは一旦卵母細胞質に取り込まれ、何らかの分子変化を受けた後に卵母細 胞表面に卵膜として沈着する可能性があると考えられた。他方、作製した各特 異抗体はアメマス、プラウントラウトおよびサクラマスの成熟雌血清と免疫交 叉性を示し、他のサケ科魚類におけるVERPの検索に有用であることが明らか となった。
さら に、Singleraidalimmunodiffusion（SRID）お よびEnzyme‐limにd inlmunoso慨ntaSsり（EuSA）によるんVERPおよび肌RPの測定系を確立した。
ELISAの測定限界は轟VERPでは15．8ng/m1、WERPでは47．4ng/mlであった。これ らを用いて＆処理および成熟期の血中量を測定した。E2処理したイトウ未熟魚 の血清ハ但RPおよびNERPを定量した結果、E2の単一処理（2mひ（g体重）では 24hr後に轟VERPおよぴWERPが検出された。一般にイトウは6歳の春に初回産 卵を行う。成熟に伴う雌血清中のVERP量を測定した結果、産卵前年の9月から 血中量は増加して1月に最大値を示したが、その後産卵期の5月まで減少した。
これらの変化は、血中レベルに差はあるもののビテ口ゲニンと概ね一致してい た。
以上のように本研究では、サケ科魚類で初めて2種類の卵膜蛋白前駆物質を 精製し、それぞれに対する特異抗体を作製した。これらの特異抗体を用いて測 定系を確立し、血中量の定量を可能とした。以上の成果は、．卵巣外由来と考え られるサケ科魚類の卵膜形成機構の解明に重要な知見をもたらしたものと高く 評価され、本論文が博士（水産学）の学位請求論文として相当の業績であると 認定した。
