博 士 （ 水 産 学 ） 井尻 成 保 学 位 論 文 題 名
Studies on the steroidogenic enzyme system for the ovarian estrogen biosynthesis of Japanese eel, Anguilla Japonica
（ニホンウナギの卵巣のエストロゲン合成に関与する ス テ ロ イ ド 合 成 酵 素 系 に 関 す る 研 究 ）
学位論文内容の要旨
ニホンウナギ(Anguilla japonica)は水産養殖業において重要な対象魚で あるが、その種苗は完全に天然のシラスウナギの漁獲のみに依存しているた め、種苗生産技術の確立が待ち望まれている。降海時の下ルウナギの卵巣卵 の多くは、卵黄形成初期にまで発達しているが、これ以上に成熟段階の進ん だ卵巣卵を持つニホンウナギは天然では採補されていない。このため、ウナ ギの成熟卵、．および孵化稚魚を得るために、古くから下ルウナギへのサケ脳 下垂体 懸濁物(SPH)等のホルモン投与が試みられてきたが、安定した成果 は得られていない。ウナギの人為催熟技術を確立するためには、卵濾胞の発 達を制御する内分泌機構を正確に把握することが必要である。また、これま での過去の人為催熟の試みには、ほとんどの場合下ルウナギが使用されてき たが、近年のその入手困難さもあり、最近では養殖ウナギあるいはエストラ ジオール‑17[3 (E2)投与により人為的に雌化された養殖ウナギ（雌化ウナ ギ）も使用されている。しかし、人為催熟に対する卵巣発達の促進効果はこ れ ら3種のウ ナギで異な っており、 また、その 理由も明ら かではない 。 一般に、卵母細胞の成長および最終成熟は卵濾胞組織で合成されるステロ イドホルモンの働きに制御されているが、ウナギでも、E2が卵黄形成に、
17a，20[3‑ジヒドロキシ‑4‑プレグネン‑3‑オン(DHP)が卵母細胞の最終成熟に 関与していると考えられている。これらステロイドホルモンの産生量の変化 一・897−
は様々なステロイド合成酵素の活性の変化に依存している。ステロイド合成 酵素の活性変化はその遺伝子の発現によって調節されていると考えられてい る。その中 でも、アロ マターゼ(P450arom)はE2産生を直接制御する律速 酵素であり、それ故、その遺伝子の発現変化を解明することは卵黄形成の内 分泌制御を理解する上で極めて重要である。本研究は、ニホンウナギ雌の成 熟過程におけるステロイドホルモンの産生能の変化を、遺伝子レベ渺で詳細 に調べることを目的として行われた。
最初に、下ルウナギ、養殖ウナギ、および雌化ウナギの人為催熟前の卵巣 の発達段階と、処理による卵巣の発達過程の関係を調べた。処理前の卵巣 は、下ルウナギが最も発達しており、生殖腺体指数(GSI)の平均は2.5％、最 大卵群の卵 径は214‑329ymの 範囲で、平 均は266ymであった。次いで、雌 化ウ ナ ギのGSIは1.2％、卵径は169‑255ymの範囲 で、平均は217 ymで あ った 。 養殖 ウ ナギ のGSIは111％、 卵 径 は149‑215 ymの範囲で 、平均は 177ymで、最 も未発達であったが、他の群に比べて個体間の幅が大きかっ た。SPH（20Vg/g‑体重）処理により、下ルウナギでは平均10.2週で100％ の個体の卵母細胞が核移動期に達したのに対し、雌化ウナギでは平均16.6週 で71％が 、 養 殖ウ ナ ギで は 平均18.6週 でわずか29％であった 。以上か ら、SPH処理による卵巣の発達は、処理前の卵巣中の最大卵群の発達段階に 依存していることが示唆された。また、処理前の卵径が少なくとも199 ym あればSPH処理により卵母細胞を最終成熟期にまで発達促進させ得ることが 明らかとなった。
次に、油球期から核移動期までの全ての発達段階の卵濾胞が採取できる養 殖ウナギを用いて、卵巣成熟に伴う血中ステロイドホルモン量の変動、およ ぴ卵濾胞の発達に伴うステロイド合成能の変化を調べた。血中E2量は卵黄 形成中低値 を示し、卵 黄形成の終 了後に急増 した。血中テストステロン (T)量は 、卵黄形成 中血中E2量よりも高値を示し、卵黄形成終了後にさら に上昇した 。血中DHPは催熟の全期間を通して全く検出されなかった。一 方、催熟の期間を通して様々な発達段階の卵濾胞を用いた生体外実験では、
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ステロイド 基質を含ま ない対照群でのEっ、T、およびDHPの産生量は極め て少なかった。プレグネノロン(Preg)、17Q．ハイドロキシプロゲステロン （17a‑OHP)、またはTからのE2合成能は卵黄形成中の卵濾胞では極めて 少なかったが、続く核移動期（最終成熟期）では増加した。Preg、または 17a‑OHPからのT合成能 は卵黄形成 の進行に伴 い徐々に上昇し、続く核移 動期ではさ らに高まる か、または若干減少した。Preg、または17a‑OHPか らのDHP合 成能は卵黄 形成の進行に伴い急上昇し、核移動期ではさらに上 昇するか、または減少した。以上の結果から以下のことが明らかになった。・
血中E2量 の 変化 とP450arom (TをE2に転 換する酵素 ）活性との 間には良 好 な 相 関 関 係が 認 めら れ た。 卵 濾胞 のE2産 生 はT産 生能 カ より もP450 arom活 性に大きく 依存してい る。一方、T産生 は明らかにSPHの刺激によ るPreg産生に大き く依存しており、また同時に、PregからのT合成を制御 するステロイド合成酵素の活性化に依存している。fた、卵濾胞が強い20[3‑
HSD（17a‑OHPをDHPに転換 する酵素） 活性を持っ ているにも 関わらず血 中にDHPが 検出されな いのは、お そらくDHP合成を制御する最も重要な制 限要因は20 [3‑HSDの活性化ではなく17a‑OHPの産生である。さらには、卵 黄形成終了後の血中E2量の急上昇、っまりこの時期の卵濾胞でのP450arom 活性の上昇が、DHP産生、ならびにそれに続く自発的な最終成熟および排卵 を阻害していることが示唆された。
最 後 に 、ウ ナ ギP450arom cDNAのク ロ ーニ ン グ を行 い 、ウ ナ ギP450 aromの 一次構造を 明らかにし た。また、 このクロー ン化したP450aromを プローブに用いて、卵巣成熟，に伴う卵巣のP450arom mRNAの発現量の変化 を調べた。併せて、他の組織におけるP4．50arom mRNAの発現について検討 した。P450arom cDNAの クローニングにあたって、まず他の動物種で明ら かにされているP450aromの保存配列を基にプライマーを合成し、核移動期 のウ ナ ギの 卵 巣由 来 のcDNAを 鋳 型にPCR反 応を 行い、P450arom cDNA断 片を得た。次に、これをプローブに用い、cDNAライブラリーをスクリーニ ングした。 その結果、 夕ンパク質翻訳領域の全体を含むP450arom cDNAが ー899―
得られ、その塩基配列を決定した。ウナギP450aromはアミノ酸にして511 残基からなる蛋白質をコードしていた。そのアミノ酸配列は、ニジマスおよ びchannel catfishのP450aromとそれぞれ65および59％の相同性を示し、
哺乳類（ヒト、マウス、ラット）およびニワトりと50‑54％の相同性を示し た。中でも、P450aromの機能に関与すると考えられている領域では特に高 い相同性を示し、全動物種を通して非常に高度に保存されている領域の存在 が認 められ た。 これ らの ことから、今回得られたcDNAがウナギP450arom をコードし、ていると結論された。次に、得られたP450arom cDNAをプロー ブとしてノーザンブロットを行った結果、卵黄形成初期の卵巣では反応はほ とんど認められなかったが、核移動期に達した卵巣では約2.1 kbの特異的な ノヾンドが認められた。卵巣の発達に伴うP450arom遺伝子の発現変化は卵濾 胞のP450arom活 性の 変化 をほぼ反映していた。このことから、卵濾胞の P450arom活性｜まその遺伝子の発現レベルから調節されていることが示唆さ れた。他の組織では、催熟中のウナギの脳内でのみ卵巣同様約2．lkbの特異 的なノヾンドが認められた。この発現がウナギの回遊、および生殖行動に関与 し て い る こ と も 考 え ら れ 、 今 後 検 討 す べ き 課 題 と し て 残 さ れ た 。
学位論文審査の要旨 主 査 教 授 山 内 晧 平 副 査 教 授 山 崎 文 雄 副 査 教 授 原 彰 彦 副査 助教授 上田 宏 副査 助教授 足立伸次
学 位 論 文 題 名
Studies on the steroidogenic enzyme system for the ovarian estrogen biosynthesis of Japanese eel, Anguilla Japonica
（ ニ ホン ウ ナ ギの 卵巣の エストロ ゲン合成 に関与す る ス テ ロ イ ド 合 成 酵 素 系 に 関 す る 研 究 ）
ニ ホ ン ウナ ギ は水 産 養殖業に おいて重 要な対象 魚であるが 、その種 苗は完全 に 天然 の シ ラス ウ ナギ の漁獲 のみに依 存してい るため、種 苗生産技 術の確立 が 待 ち 望 ま れて い る。 こ の ため 、 古く か ら 下ル ウ ナギ へ の サケ 脳 下 垂体 懸 濁物 (SPH)等 の ホル モ ン投 与 に よる 人 為催 熟 が 試み ら れ てきたが、 安定した 成果は 得 られ て い ない 。 ウナ ギの人 為催熟技 術を確立 するために は、卵濾 胞の発達 を 制 御す る 内 分泌 機 構を 正確に 把握する ことが必 要である。 一般に、 卵母細胞 の 成 長お よ び 最終 成 熟は 卵濾胞 組織で合 成される ステロイド ホルモン の働きに 制 御 され て い るが 、 ウナ ギ で も、 エ スト ラ ジ オー ル‑17p(E2）が卵 黄形成に 、17 a，20p・ジ ヒドロキ シ‑4‑プレグ ネン‑3‑オン(DHP)が卵母細胞 の最終成 熟に関与 し てい る と 考え ら れて いる。 これらス テロイド ホルモンの 産生量の 変化は様 々 な ステ ロ イ ド合 成 酵素 の活性 の変化に 依存して いる。本研 究は、ニ ホンウナ ギ 雌 の成 熟 過 程に お ける ステロ イドホル モンの産 生能の変化 を、遺伝 子レベル で 詳細に 調べるこ とを目的 として行 われた。
最 初 に 、下 ル ウナ ギ 、養殖ウ ナギ、お よび雌化 ウナギの人 為催熟前 の卵巣の 発 達段 階 と 、処 理 によ る卵巣 の発達過 程の関係 を調べた。 処理前の 卵巣は、 下 ルウナ ギ、雌化 ウナギ、 次いで養 殖ウナギの 順で発達 していた 。SPH（20pLg/g‑
体 重 ） 処 理 に よ り 、 下 ル ウ ナ ギ で は 平均10.5週 で100％ の 個体 の 卵 母細 胞 が 核 移 動 期 に達 し たの に 対 し、 雌 化ウ ナ ギ では 平 均16.8週 で72.3％ が、 養 殖ウ ナ ギ で は 平 均18.6週 で わ ず か26.3％ であ っ た 。以 上 から 、SPH処理 に よる 卵 巣 の発 達 は 、処 理 前の 卵巣中 の最大卵 群の発達 段階に依存 している ことが示 唆 さ れた 。 ま た、 処 理前 の 卵 径が 少 なく と も199 !.tmあ ればSPH処理に より卵母 細 胞 を 最 終 成 熟 期 に ま で 発 達 促 進 さ せ 得 る こ と が 明 ら か と な っ た 。 次 に 、 油球 期 から 核 移動期ま での全て の発達段 階の卵濾胞 が採取で きる養殖 ウ ナギ を 用 いて 、 卵巣 成熟に 伴う血中 ステロイ ドホルモン 量の変化 、および 卵 一901―
濾胞の発達に伴うステロイド合成能の変化を調べた。血中Eっ量は卵黄形成中低 値を示し、卵黄形成の終了後に急増した。血中テストステロン(T)量は、卵黄 形成中血中E2量よりも高値を示し、卵黄形成終了後にさらに上昇した。血中 DHPは催熟の全期間を通して全く検出されなかった。
一方、催熟の期間を通して様々な発達段階の卵濾胞を用いた生体外実験で は、ステロイド基質を含まない対照群でのE2｀T、およびDHPの産生量は極め て少なかった。プレグネノロン(Preg)、17a‑ハイドロキシプロゲステロン（1 7a‑OHP)、 またはTから のE2合成能は卵黄形成中の卵濾胞では極めて少なか ったが、続く核移動期（最終成熟期）では増加した。Preg、または17a‑OHPか らのT合成能は卵黄形成の進行に伴い徐々に上昇し、続く核移動期ではさらに 高 まるか 、ま たは 若干 減少した。Preg、または17a‑OHPからのDHP合成能は 卵黄形成の進行に伴い急上昇し、核移動期ではさらに上昇するか、または減少 した。以上の結果から以下のことが明らかになった。血中E2量の変化とP450 arom（TをE2に転換する酵素）活性との間には良好な相関関係が認められた。
卵 濾胞のE2産 生はT産 生能 カよ りもP450arom活 性に 大きく依存している。
一 方、T産 生は明 らか にSPHの刺激によるPreg産生に大きく依存している。
ま た、卵 濾胞 が強 い20(3‑HSD（17a‑OHPをDHPに転換する酵素）活性を持つ て いるに も関 わら ず血 中にDHPが検出されないのは、おそらく17a‑OHPが産 生されないことに起因すると考えられた。
最後に 、ウ ナギP450arom cDNAのク 口ー ニン グを 行い、ウナギP450arom の一次構造を明らかにした。まずP450aromの保存配列を基にプライマーを合 成 し、核 移動 期の ウナ ギの卵 巣由 来のcDNAを 鋳型 にPCR反応を行い、P450 arom cDNA断片を得た。次に、これをプローブに用い、cDNAライブラリーを スクリーニングした。その結果、蛋白質翻訳領域の全体を含むP450arom cDNA が得られ、その塩基配列を決定した。ウナギP450aromはアミノ酸にして511 残基からなる蛋白質をコードしていた。そのアミノ酸配列は、ニジマスおよぴ channel catfishのP450aromとそれぞれ65および59％の相同性を示し、喃乳 類（ヒト、マウス、ラッ上）およぴニワト1Jと50‑54％の相同性を示した。中 でも、P450aromの機能に関与すると考えられている領域では特に高い相同性を 示し、全動物種を通して非常に高度に保存されている領域の存在が認められ た 。これ らの こと から 、今回得られたcDNAがウナギP450aromをコードして いると結論された。
次に、得られたP450arom cDNAをプローブとしてノーザンブロットを行つ た結果、卵黄形成初期の卵巣では反応はほとんど認められなかったが、核移動 期に達した卵巣では約2.1 kbの特異的なノヾンドが認められた。卵巣の発達に伴 うP450arom遺 伝子 の発 現変化は卵濾胞のP450arom活性の変化をほぼ反映し ていた。このことから、卵濾胞のP450arom活性はその遺伝子の発現レベルか ら調節されていることが示唆された。
上述のように、本研究では、人為催熟によって性成熟の誘導が可能なウナギ の基準を示した。また、催熟後は、核移動期における血中Eワ量の急増が、ウナ ギの自然な最終成熟を阻害している可能性あるとぃう問題点を明らかにし、さ ら に、こ のE2産生 は、 卵濾胞のアロマターゼのmRNAの転写レベルから制御 されていることを明らかにした。これらの結果は、ウナギの人為催熟の問題点 を、内分泌的な側面から明らかにし、今後、催熟法を改良するうえで極めて重 要な知見を提供したものとして高く評価され、本論文が博士（水産学）の学位 請求論文として相当の業績であると認定した。
