博士（歯学） 阿部圭吾 学位論文題名
Effects of bisphosphonates on osteoclastogenesisin RAW264 ．7cells
（各種ビスフオスフォネート製剤のRAW264.7 細胞における破骨細胞分化 誘導系に与える影響）
学位論文内容の要旨
【 緒 言 】
ビ ス フ オ ス フ ォ ネ ー ト(BP)製 剤 は 、 ピ ロ リ ン 酸 のP‑O−P構 造 の0をCで 置 換 し た 化 合 物 で あ る 。 全 て のBP製 剤 はP−C―P構 造 が 基 本 骨 格 と な っ て い て 、 そ の 側 鎖 に 様 々 な 構 造 を 持 た せ る こ と で 各 種BP製 剤 が 作 ら れ て い る 。 臨 床 に お い て は 、 骨 吸 収 抑 制 作 用 が 注 目 さ れ 骨 組 鬆 症 、 責 ペ ー ジ ェ ッ ト 病 な ど の 骨 疾 患 治 療 へ と 用 い ら れ 、 さ ら に は が ん 責 転 移 予 防 な ど 、 が ん 治 療 の 場 に お い て も 重 要 な 位 置 を 占 め る よ う に な っ て い る 。 し か し 、BP系 薬 剤 関 連 顎 骨 壊 死 な ど の 重 篤 な 副 作 用 も 報 告 さ れ て い る 。 生 体 内 に お い て は 骨 組 織 に 特 異 的 に 取 り 込 ま れ 、 骨 吸 収 時 に 破 骨 細 胞 に 直 接 作 用 す る こ と で 破 骨 細 胞 の 融 合 （ 多 核 化 な ら び に 巨 大 化 ） を 促 進 す る が 、 責 吸 収 能 を 抑 制 し 、 ア ポ ト ― シ ス を 誘 導 す る と 言 わ れ て い る 。 し か し 、BP製 剤 に よ る 破 骨 細 胞 の 融 合 や ア ポ ト ー シ ス 誘 導 作 用 、 骨 吸 収 抑 制 作 用 は 異 な る メ カ ニ ズ ム に よ る 可 能 性 が 示 唆 さ れ て お り 、 そ の 詳 細 は 未 だ 明 ら か に な っ て い な い 。 そ こ で 、 本 研 究 で はRAW264.7(RAW)細 胞 に お け る 破 骨 細 胞 分 化 誘 導 系 に 対 す るBP製 剤 の 直 接 的 な 影 響 に つ い て 検 討 し た 。
【 材 料 と 方 法 】
RANKL添 加 培 養 液 を 用 い てRAW細 胞 を3〜8日 問 培 養 し 、 破 骨 細 胞 数 お よ び 巨 大 破 骨 細 胞
（8核 以 上 ） 数 を 求 め た 。 そ の 結 果 に よ り 培 養 期 間 を6日 問 と し 、 各 種BP製 剤 （ 窒 素 非 含 有 ： エ チ ド ロ ネ ー ト 、TRK‑530、 窒 素 含 有 ： ア レ ン ド 口 ネ ー ト 、 リ セ ド ロ ネ ー ト 、 ゾ レ ド ロ ネ ー ト ） 存 在 下 でRAW細 胞 を 培 養 し 、 破 骨 細 胞 数 お よ び 巨 大 破 骨 細 胞 数 を 求 め た 。BP製 剤 は 異 な る 作 用 時 間 （1、3、5日 ） な ら び に 最 終 濃 度(0. 01〜10ロM） で 作 用 さ せ た 。 破 骨 細 胞 へ の 作 用 がBP製 剤 のRAW細 胞 へ の 細 胞 毒 性 に よ る も の か 調 査 す る た め 細 胞 毒 性 試 験 を 行 っ た 。 現 在 商 品 化 さ れ て い るBP製 剤 の 中 で 最 も 骨 吸 収 抑 制 作 用 が 強 い と さ れ る 窒 素 含 有 の ゾ レ ド 口 ネ ― ト と 現 在 新 規 に 開 発 さ れ て い る 窒 素 非 含 有 のTRK―530を 用 い て 、 さ ら な る 破 骨 細 胞 分 化 誘 導 系 に 対 す る 影 響 を 検 索 し た 。pit assayを 用 い て 骨 吸 収 能 へ の 影 響 を 調 査 し た 。 BP製 剤 を 培 養3日 目 、5日 目 に 投 与 し1、3、6、12、24時 間 後 にRNAを 回 収 しreal time PCR 法 を 用 い て 破 骨 細 胞 分 化 関 連 遺 伝 子 な ら び に ア ポ ト ー シ ス 関 連 因 子 に つ い て 調 査 し た 。 さ ら に DNAフ ラ グ メ ン テ ー シ ョ ン 解 析 法 な ら び に Caspase3/7活 性 測 定 を 行 っ た 。
【 結 果 】
BP製 剤 を 作 用 さ せ ず 、 破 骨 細 胞 を 培 養 し た 場 合 、 破 骨 細 胞 数 お よ び 巨 大 破 責 細 胞 数 は 共 に 培 養6日 目 を ピ ー ク に そ の 後 減 少 し た 。 そ の た め 、 以 降 の 破 骨 細 胞 数 を 求 め る 実 験 で は 培 養 期 間 を6日 間 と し て 行 っ た 。 全 て のBP襲 剤 に よ っ て 破 骨 細 胞 数 な ら び に 巨 大 破 骨 細 胞 数 は 濃 度 か つ 作 用 時 間 依 存 的 に 有 意 に 滅 少 し た 。 窒 素 含 有 のBP製 剤 はRANKL非 添 加RAW細 胞 に 対 し 毒 性 を 認 め 、 窒 素 非 含 有 のBP製 剤 で は 認 め ら れ な か っ た 。 破 責 細 胞 へ の 作 用 を 確 認 す る た め 同 様 の 細 胞 毒 性 試 験 をRANKL添 加 し て 行 う と 、 窒 素 含 有 のBP製 剤 な ら び に 非 含 有 のBP製 剤 共 に 破 骨 細 胞 に 対 し 大 き く 毒 性 を 示 し 、 窒 素 含 有 のBP製 剤 は 、RANKL非 添 加 RAW細 胞 よ り も 破 骨 細 胞 へ の 毒 性 が 大 き か っ た 。 窒 素 含 有 と 非 含 有BP製 剤 で 異 な っ た 結 果 が 得 ら れ た こ と か ら 、 窒 素 含 有 の ゾ レ ド ロ ネ ー ト と 窒 素 非 含 有 のTRK−530に 対 し 、 以 下 の 実 験 を 行 っ た 。pit assayに お い て コ ン ト ロ ー ル 群 で は 骨 吸 収 窩 が56%で あ っ た の に 対 し 、 ゾ レ ド ロ ネ ― ト 投 与 群 で は0%、TRK―530投 与 群 で は0．5％ で あ っ た 。real time PCR法 に お い て 、NFATclの 発 現 は 、 両 群 と も3日 目 投 与 で は 有 意 な 差 を 認 め な か っ た が 、5日 目 投 与 で は 時 闇 依 存 的 に 発 現 が 減 少 し た 。DC−STAAIPの 発 現 は 、 両 群 と も3日 目 投 与 の1時 間 後 、 24時 間 後 で コ ン ト ロ ー ル に 対 し 有 意 な 差 が 認 め ら れ な か っ た が 、 そ の 他 の 時 間 で は 発 現 が 減 少 し た 。TRAPの 発 現 は 、 両 群 と も3日 目 投 与 で は 、1時 間 後 、3時 間 後 で 発 現 が 減 少 し 、 5日 目 投 与 で は 投 与 後 か ら 減 少 し た 。Fasの 発 現 は 、 両 群 と も3日 目 投 与 並 び に5日 目 投 与 の1時 間 後 、3時 間 後 で 著 し く 発 現 が 増 加 し た 。Caspase3の 発 現 は 、 両 群 と も3日 目 投 与 で は 有 意 な 差 を 認 め な か っ た が 、5日 目 投 与 でIまFasと 同 様 に 投 与 後3時 間 後 で 発 現 が 増 加 し た 。Caspase8の 発 現 は 、 両 群 と も5日 目 投 与 で 有 意 な 差 を 認 め な か っ た が 、3日 目 投 与 で は 投 与 後12時 間 後 に 発 現 が 増 加 し た 。Bcl―xLの 発 現 は 、 両 群 と も3日 目 投 与 で は 投 与 後 6時 間 で 発 現 が 滅 少 し 、5日 目 投 与 で は 投 与 後 に 時 間 依 存 的 に 減 少 し た 。DNAフ ラ グ メ ン テ ー シ ョ ン 解 析 法 に お い て は 両 群 に の みDNAラ ダ ― が 確 認 さ れ 、Caspase3/7活 性 も コ ン ト ロ ー ル に 対 し 両 群 で 有 意 な 活 性 の 上 昇 を 認 め た 。
【 考 察 】
BP製 剤 は 、 濃 度 な ら び に 作 用 時 間 依 存 的 に 破 骨 細 胞 数 を 有 意 に 減 少 さ せ た 。 窒 素 非 含 有 BP製 剤 はRAW細 胞 の よ う な 免 疫 系 の 細 胞 に 対 し て 毒 性 を 示 さ ず 、 破 骨 細 胞 に の み 作 用 し た た め 、 破 骨 細 胞 に 特 異 的 に 作 用 す る こ と が 示 唆 さ れ た 。 窒 素 含 有BP製 剤 は 破 骨 細 胞 へ の 作 用 だ け で は な く 、RAW細 胞 に 対 し て 毒 性 を 示 し た が 、 破 骨 細 胞 へ の 影 響 が よ り 大 き い こ と が 確 認 さ れ た 。pit assayで は 、BP製 剤 投 与 群 で 責 吸 収 窩 が 著 し く 滅 少 し た 。 破 骨 細 胞 数 の 減 少 に 比 べ 、 骨 吸 収 窩 が 大 き く 減 少 し た た め 、BP製 剤 は 破 骨 細 胞 の 骨 吸 収 能 を 低 下 す る こ と が 示 唆 さ れ た 。real time PCR法 に お い て 、 破 骨 細 胞 分 化 ・ 融 合 の 過 程 で のBP製 剤 の 影 響 を 確 認 す る た めBP製 剤 を 培 養3日 目 に 投 与 す る 群 と 、 成 熟 破 骨 細 胞 へ の 影 響 を 確 認 す る た めBP製 剤 を 培 養5日 目 に 投 与 す る 群 に 分 類 し 、RNAを 回 収 し た 。 検 討 し た 遺 伝 子 は 破 骨 細 胞 分 化 の マ ス タ ー レ ギ ュ レ ― シ ョ ン で あ るNFATcl、 破 骨 細 胞 の 融 合 に 関 与 す るDCーSTAMP、
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破骨細胞のマ―カ―である TRAP などの破骨細胞の分化関連遺伝子とした。また、アポトー シス関 連因子としてはアポトーシス促進因子であるFas 、Caspase3 、Caspase8 とアポトー シス抑 制因子である Bcl − xL とした。 3 日目投与群ならびに5 日目投与群において破骨細胞 の分化関連遺伝子の発現が減少したため、 BP 製剤による破骨細胞分化・融合の抑制が示唆 された。また、アポト―シス促進因子の発現は増加し、アポトーシス抑制因子の発現が減 少した 。さらに 、BP 製剤 投与群に のみDNA ラダ― が確認さ れ、 Caspase3/7 活性もBP 製剤 投与群に有意な活性の上昇を認めたため、 BP 製剤による破責細胞のアポト―シス誘導が示 唆された。
【結諭】
BP 製剤は破骨細胞分化誘導系において、濃度ならびに作用時間依存的に破骨細胞数を減
少させ、骨吸収能を低下させることが示唆された。また、アポト―シスの誘導だけではな
く、破骨細胞の分化ならびに融合の抑制も示唆された。窒素非含有のBP 製剤であるTRK − 530
は破骨細胞数を大きく減少させ、破骨細胞の骨吸収能も大きく低下させた。また、窒素含
学位論文審査の要旨 主 査 教 授 北 川 善政 副 査 教 授 鈴 木 邦明 副 査 教 授 進 藤 正信
学 位 論 文 題 名
Effects of bisphosphonates on osteoclastogenesisln RAW264 ． 7cells
（ 各 種 ビ ス フ オ ス フ ォ ネ ー ト 製 剤 の RAW264.7 細胞 に おけ る 破 骨細 胞 分化 誘 導 系 に 与 え る 影 響 ）
審査は、審査委員全員の出席の下に口頭試問の形式により行われた。申請者に対して 提出論文とそれに関連した学科目について試問を行った。審査論文の概要は以下の通り である。
【緒言】
ビスフオスフォネート(BP) 製剤は、ピロリン酸のP − 0 一P 構造の 0 を C で置換した化 合物である。全てのBP 製剤はP ーC − P 構造が基本骨格となっていて、その側鎖に様々な 構造を持たせることで各種BP 製剤が作られている BP 製剤は骨粗鬆症の治療薬としてだ けではなく、がん診療の場においても重要な位置を占めるようになった。生体内におい ては骨組織に特異的に取り込まれ、骨吸収時に破骨細胞に直接作用することで破骨細胞 の融合（多核化ならびに巨大化）を促進するが、骨吸収能を抑制し、アポトーシスを誘 導すると言われている。しかし、BP 製剤による破骨細胞の融合やアポトーシス誘導作 用、骨吸収抑制作用は異なるメカニズムによる可能性が示唆されており、その詳細は未 だ明らかになっていない。そこで、本研究ではBP 製剤の破骨細胞分化誘導系に対する 影響について検討した。
【材料と方法】
RANKL 添加培養液を用いてRAW264.7 細胞を各種BP 製剤（窒素非含有：エチドロネー ト、TRK ―530 、窒素含有：アレンドロネート、リセドロネート、ゾレドロネート）存在 下で培養し破骨細胞数および巨大破骨細胞（8 核以上）数を求めた。BP 製剤は異なる作用 時間（1 、 3 、 5 日）ならびに最終濃度(0. 01 〜10pM ）で作用させた。破骨細胞への作 用がBP 製剤のRAW 細胞への細胞毒性によるものか調査するため細胞毒性試験を行った。
窒素含有のゾレドロネートと現在新規に開発されている窒素非含有のTRK −530 を用い て、さらなる破骨細胞分化誘導系に対する影響を検索した。pit assay を用いて骨吸収 能への影響を調査し、real time PCR 法を用いて破骨細胞分化関連遺伝子ならびにアポ
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