博 士 （ 医 学 ） 中 村 明 枝 学 位 論 文 題 名

博 士 （ 医 学 ）    中 村 明 枝

学 位 論 文 題 名

Iolecular Genetics Analyses of the Cause of     Hypocalcemia and Hypercalcemia

     （カルシウム異常をきたす疾患の分子遺伝学的解析）

    学 位 論 文 内 容 の 要 旨 第 1章

Molecular ana工yslSOFtheGATA3geneinfiVeJapaneSepatlentSWithHDRSyndrome．

（ 日 本 人5人 の HDR症 候 群 に お け るGATA3遺 伝 子 の 分 子 遺 伝 学 的 解 析 ）

【 背 景 と 目 的 】HDR症候 群 は、 副甲 状腺 機 能低 下症(Hypoparathyroidism)、 感音 性 難聴 (sensorineural Deafness)、 腎奇 形(Renal dysplasia)を三主 徴とする常染色体優性遺伝 形 式を 示 す疾 患で 、そ の責 任 遺伝 子はGATA3で ある 。こ の 三主 徴が 揃う 症例 は約6割で、

同 一家 系 でも 表現 型― 遺伝 型が一致 しないことがある。HDR症候 群の患者で同定したGATA3 遺伝子 変異の機能を検討し、変異と 臨床症状を比較した。

【 対象 と 方法 】HDR症 候群 の患者と その家族に対し、GATA3遺伝 子解析を行い、同定した変 異の転 写活性や細胞内局在にっいて 解析した。

【 結果】HDR症候群の5名と低カルシ ウム血症を有する家族3名で 、新規変異(c. 1063delC、 R262G、C318S)、既報の変異(c. 432insG、c，1051→1G>T)を同 定した。全例で副甲状腺機能 低 下症 と 感音 性難 聴を 認め た が、 腎奇 形は3/8名で あった。同 一変異を有する家族例で、

発 端者 は 副甲 状腺 機能 低下 と感音性 難聴のみであったが、父は その他に水腎症を、姉は多 嚢胞腎 、尿管異所開口、膣閉鎖の合 併を認めた。しかし姉の血 清カルシウムは正常下限で、

発 端者 に 比べ 副甲 状腺 機能 低下症に 関しては軽症であった。稀 な合併症として重複子宮と 膣 閉鎖 を 合併 する 症例 が2例存 在し た 。機 能解 析で 変異体は野 生型に比べ転写活性能低下 を 認 め た 。 細 胞 内 局 在 はc． 432insGの み 細 胞 質 内 に 、 そ の 他 は 核 内 に 存 在 し た 。

【 考察】 同定されたGATA3変異の機能 喪失を証明した。ZnF2 (zing−finger domain)以降に 欠 失が あ るc． 1063delCで も転写活 性は低下し、C末端の欠失し ているアミノ酸もGATA3の 機 能に重 要であると考えられた。同 一変異の家族例で症状の多様 性が認められ、GATA3の標 的 遺伝 子 の多 型や その 発現 量の差に よって症状が異なる可能性 がある。今回、子宮・膣の 奇 形を 合 併す る症 例が2例 あり 、Mueller管 形成 にGATA3が関与 する可能性が示唆された。

【 結論 】 日本 人HDR症 候群 で、新規 変異を含む5つの変異を同定 し、機能喪失を証明した。

症状は 多様で、その機序を明らかに するには、GATA3の標的遺伝子の同定などが必須である。

ま たHDR症 候群 の患 者 では 、子 宮・ 膣 の奇 形の 検索 を考 慮 し、Muller管 形成 へのGATA3の 関与も 今後検討が必要である。

第2章

Identification，functional characterizat10n，  andtheeffeCtSOftheCalCimimetiCS NPSRー5680FnoVellOSSOfgainoFFunCtionmutationS0ftheealCium―SenSlngreCeptor．

（カルシウム受容体の機能 獲得型変異、機能喪失型変異 の同定と機能解析、カルシミメティ ックスNPSR―568の変異カル シウム受容体機能への効果 について）

【背景と目的】CASR（カルシウム感知受容体）1ま副甲状腺や腎尿細管に発現し、血清カルシ ウムがヒ昇すると、PTH分泌を抑制、尿細管での カルシウム再吸収を抑制して 尿中カルシウ ム排 泄量 を 増加 させ、血清カルシウム を一定に保つ役割を果たす。 しかし、CASRの機能獲

得 型 変 異 で は 、 血 清 カ ル シ ウ ム が 低 い に も 関 わ ら ずPTH分 泌 が 抑 制 さ れ た ま ま と な り 、 尿 細 管 で の カ ル シ ウ ム 再 吸 収 は 抑 制 さ れ 尿 中 カ ル シ ウ ム 排 泄 が 高 値 と な るADH（ 常 染 色 体 優 性 低 カ ル シ ウ ム 血 症 ） を 発 症 す る 。 逆 に 、CASRの 機 能 喪 失 型 変 異 で は 、 血 清 カ ル シ ウ ム 高 値 に も 関 わ ら ず 、PTH分 泌 は 抑 制 さ れ ず 、 腎 尿 細 管 で の カ ル シ ウ ム 再 吸 収 は 抑 制 さ れ ず 、 高 カ ル シ ウ ム 血 症 、 相 対 的 低 カ ル シ ウ ム 尿 症 を 来 す 。 機 能 獲 得 型 変 異 の へ テ ロ 接 合 体 で は 軽 度 の 高 カ ル シ ウ ム 血 症 を 来 すFHH（ 家 族 性 低 カ ル シ ウ ム 尿 性 高 カ ル シ ウ ム 血 症 ） 、 ホ モ 接 合 体 で 、 新 生 児 期 に 重 篤 な 高 カ ル シ ウ ム 血 症 を 呈 す るNSHPT（ 新 生 児 重 症 副 甲 状 腺 機 能 低 ・ ド 症 ） を 発 症 す る 。 今 回 、ADH、FHH症 例 で 、CASR遺 伝 子 解 析 を 行 い 、 変 異CASRの 機 能 解 析 を 施 行 し た 。 更 に 、CASRの 正 の ア ロ ス テ リ ッ ク モ デ ュ レ ー タ ー （ カ ル シ ミ メ テ ィ ク ス ） で あ るNPS R− 568に よ る 変 異 CASRの 機 能 ・ 細 胞 膜 発 現 量 の 変 化 に つ い て も 検 討 し た 。

【 対 象 と 方 法 】ADHと 診 断 し た 患 者3名 と そ の 家 族 、FHHと 診 断 し た 患 者2名 で 、CASR遺 伝 子 解 析 を 行 っ た 。 さ ら に 変 異CASRの 機 能 解 析 をHEK293細 胞 に 野 生 型 、 変 異CASR発 現 ベ ク タ ー を 遺 伝 子 導 入 し 、Gi―MAPK経 路 とGq―IP3経 路 の ニ つ の シ グ ナ ル 伝 達 を ル シ フ ェ ラ ー ゼ レ ポ ー タ ー シ ス テ ム で 解 析 し た 。 細 胞 膜 表 面 の 発 現 は ウ エ ス タ ン ブ 口 ッ ト 、 螢 光 免 疫 染 色 、 フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー で 観 察 し た 。 さ ら にNPSR―568投 与 後 の 変 異CASRの 機 能 回 復 の 有 無 を 検 討 し た 。

【 結 果 】ADH3名 でS122C、P569H、I839T、FHH2名 でAllOT、R172Gの ミ ス セ ン ス 変 異 を へ テ ロ 接 合 性 に 同 定 し た 。 機 能 獲 得 型 変 異 で は 、Gi一MAPK、Gq―IP3両 経 路 の 解 析 で 、 カ ル シ ウ ム 用 量 反 応 曲 線 の 左 方 偏 位 、EC50低 下 、 最 大 反 応 上 昇 を 認 め た 。 し か し 、 細 胞 膜 表 面 の 発 現 量 は 野 生 型 と ほ ぼ 同 等 で あ っ た 。 機 能 喪 失 型 変 異 で は 、 同 様 に 両 経 路 の 解 析 で カ ル シ ウ ム 用 量 反 応 曲 線 の 右 方 偏 位 、EC50上 昇 を 認 め た 。 ま た 細 胞 膜 表 面 の 発 現 量 は 野 生 型 よ り や や 増 加 傾 向 が み ら れ た 。 更 に 、NSPR―568添 加 に よ り 機 能 喪 失 型 変 異 の 両 シ グ ナ ル 伝 達 経 路 の 活 性 化 は い ず れ も 野 生 型 と 同 程 度 ま で 回 復 を 認 め た が 、 細 胞 膜 表 面 の 発 現 量 に 変 化 は な か っ た 。

【 考 察 】 今 回 の 検 討 で は 機 能 獲 得 変 異 、 機 能 喪 失 変 異 で そ れ ぞ れGi−MAPK、Gq−IP3の 両 経 路 の 機 能 亢 進 、 機 能 低 下 を 認 め 、 今 回 同 定 し た 変 異 部 位 は 、 機 能 選 択 性 に 影 響 を 与 え な ぃ こ と が 示 さ れ た 。 機 能 喪 失 型 変 異 は 、 過 去 の 報 告 で 、 そ の 約 半 数 が 膜 表 面 発 現 量 の 低 下 が あ る と さ れ る が 、 今 回 の 変 異 で は 細 胞 膜 表 面 の 発 現 量 低 下 は 見 ら れ ず 、 リ ガ ン ド 結 合 能 の 低 下 又 は 立 体 構 造 の 変 化 に よ る シ グ ナ ル 伝 達 へ の 影 響 が 想 定 さ れ た 。 同 定 し た 機 能 喪 失 型 変 異 に 対 し て 、NPSR−568投 与 に よ り そ の 受 容 体 機 能 の 正 常 化 が 可 能 で あ り 、 今 後FHHや NSHPTに 対 す る カ ル シ ミ メ テ ィ ク ス の 臨 床 応 用 も 考 慮 で き る 。

【 結 論 】 同 定 し た 変 異CASRは 機 能 獲 得 型 変 異 、 機 能 喪 失 型 変 異 で あ る こ と が 証 明 さ れ た 。 ま た 機 能 喪 失 型 変 異 で はNPS R‑568に よ り 機 能 の 正 常 化 が 得 ら れ る こ と か ら 、 今 後 、 臨 床 応 用 へ の 発 展 が 期 待 さ れ る 。

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学位論文 審査の要旨 主査 副査

副査 副査

教授 教授 教授 教授

水 上 野 々村 清 水 有 賀

学 位 論 文 題 名

尚典 克也     宏     正

IVIolecular Genetics Analyses of the Cause of Hypocalcemia and Hypercalcemia

（ カ ル シ ウ ム 異 常 を き た す 疾 患 の 分 子 遺 伝 学 的 解 析 ）

  本 研 究 は 、 カ ル シ ウ ム 異 常 症 の 原 因 と な る 、GATA3遺 伝 子 異 常 に よ るHDR症 候 群 、 カ ル シ ウ ム 感 知 受 容 体 （ 以 下CASR)異 常 によ る 常 染 色 体優 性 低 カ ル シウ ム 血 症 （ 以 下ADH)、家 族 性 低 カ ル シ ウ ム 尿 性 高 カ ル シ ウ ム 血 症 （ 以 下FHH)に つ い て 、 患 者 よ り 変 異 を 同 定 し、 伽 灯troに て 変 異 体 の 機 能 解 析 を 行 っ た も の で あ る 。CASRで は 、 ア 口 ス テ リッ ク モ デ ュ レ 一夕 一 に よ る 変異 受 容 体 の 効 果 に つ い て 検 討 し 、 将 来 的 な 治 療 薬 と し て の 発 展 性 を 検 討 し た 。   発 表 終了 後 、 清 水 教授 よ り 、c． 1043deICでは 起 こ っ て い ない と 推 定 さ れる が 、c．432insGの 変 異 で はNMD (nonsense―mediated mRNA decay)を 来 し、 生 体 内 で はタ ン バ ク 質 と して 発 現 さ れ な い の で は な い か と い う 質 問 が あ っ た 。 今 回 の 検 討 で は 、NMDが 起 き ず に 変 異GATA3が 発 現 し て い る と 想 定 し 機 能 解 析 を 行 っ た が 、 そ の 可 能 性 はあ り 得 る と 返答 し た 。 ま た 、CASRのへ テ 口 接 合 体 の 機 能 喪 失 型 変 異 で は 自 覚 症 状 を 伴 わ な い 軽度 の 高 カ ル シウ ム 血 症 を 来 す事 も あ る と の こ と で 、 実 際 に 報 告 さ れ て い る 症 例 よ り 多 く 変 異 を有 す る の で はな い か と の 指 摘が あ り 、 今 後 の 検 討 課 題 で あ る と 返 答 し た 。

  有 賀 教 授 よ り 、GATA3は 胸 腺 に 発 現 を 認 め 、T細 胞 の 機 能 に も 重 要 で あ る が 、HDR症 候 群 にお い て 免 疫 異 常 を 合 併 す る と い う 報 告 は な い か と い う 質 問 が あ っ た 。 現 在 ま で 、HDR症 候 群で 免 疫 異 常 を 合 併 す る と い う 報 告 は な く 、 内 耳 、 副 甲 状 腺 、 腎 臓 で は 、GATA3の ハ プ 口 不 全に よ り 症 状 が 出 現 す る が 、 免 疫 細 胞 な ど で は 、 一 つ の ア リ ル よ り の 正 常 なGATA3の 発 現 に よ り、 機 能 が 保 た れ る の で は な い か と 返 答 し た 。 ま た 、HDR症 候 群 に お いて 、GATA3の 胎 生 期で の 発 現 が そ れ ぞ れ の 臓 器 形 成 に 重 要 で あ る 場 合 、 副 甲 状 腺 や 内耳 な ど に お いて 画 像 な ど で 低形 成 な ど の 所 見 を 認 め る の か と い う 質 問 が あ り 、 感 音 性 難 聴 に 関 し て は 、 内 耳 神 経 の 発 達 にGATA3の発 現 が 重 要 で あ り 特 に 内 耳 の 構 造 異 常 と い う 報 告 は な い 、ま た 、 副 甲 状腺 に 関 し て は 画像 で 評 価 す る こ と は 困 難 で あ り 、 低 形 成 を 明 ら か に し た 報 告 は な い と 返 答 し た 。

  野 々 村 教 授 よ り 、CASRで は 、 カ ル シ ウ ム 結 合 に よ ル シグ ナ ル 伝 達 系は 同 じ よ う に活 性 化 す る

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の か と の 質 問 が あ っ た 。G夕 ン バ ク 共 役 受 容 体 で は 、 一 つ の 受 容 体 に 複 数 のG夕 ン バ ク が 共 役 し て お り 、 以 前 は ル ガ ン ド が 結 合 す る と 、 同時 に 複 数 の シ グナ ル 伝 達 系 が活 性 化 す る と考 え ら れ て い た 。 し か し 現 在 はG夕 ン バ ク 共 役 受 容 体 の 機 能 選 択 性 と い う 点 が 注目 さ れ て い る。 っ ま り 、 リ ガ ン ド 結 合 後 、 必 ず し も 全 て の シ グ ナル 伝 達 系 が 同 時に 同 程 度 に 活性 化 さ れ な いと い う 事 象 で あ る 。 今 回 、各 変 異 でGi−MAPK系 とGq―IP3系 が 異な っ た 活 性 化 、不 活 化 が 起 きな い か を 検 討 す る た め 、 二 つ の 情 報 伝 達 系 に つ い て 検討 を 行 っ た 。 また 、 ア 口 ス テリ ッ ク モ デ ュレ ー タ ー も 情 報 伝 達 系 に 異 な っ た 作 用 を 発 揮 す る かど う か を 観 察 した 。 そ の 結 果全 て の 変 異 で、 二 つ の 情 報 伝 達 に 関 し て 差 異 は 認 め ず 、 機 能 選 択性 と い う メ カ ニズ ム に つ い ては 明 ら か に する こ と は で き な かっ た と 返 答 し た。

  水 上 教 授 よ り 、 今 回 検 討 を 行 っ たFHH症 例 は い ず れ も 自 覚 症 状 がな か っ た が 、何 ら か の 症 状 を 呈 し て 見 っ か るFHH症 例 で は ど の よ う な 症 状 が あ る の か と い う 質 問が あ り 、 新 生 児期 に 重 篤 な 高 カ ル シ ウ ム 血 症 を 呈 す る 新 生 児 重 症 副 甲状 腺 機 能 亢 進 症で は 脱 水 、 哺乳 不 良 、 意 識障 害 な ど の 症 状 が 出 現 す る が 、 高 カ ル シ ウ ム 血 症 の程 度 が 軽 度 で ある 場 合 に は 、易 疲 労 感 、 情緒 不 安 定 、 多 飲 な ど の 症 状 が 出 現 す る 可 能 性 が あ り、 合 併 症 と し て、 胆 石 や 膵 炎が 報 告 さ れ てい る と 返 答 し た 。 ま た 、 治 療 薬 と し て は 、 臨 床 上 、カ ル シ ミ メ テ ィク ス と カ ル シリ テ ィ ク ス のい ず れ が 重 要 か と の 質 問 が あ り 、 い ず れ も 重 要 だ が 、FHHは 程 度 が 軽 く 治 療の 必 要 な い 症 例も 多 く 、 カ ル シ ミ ヌ テ ィ ク ス は す で に 臨 床 応 用 さ れ てい る シ ナ カ ル セト が あ る が 、カ ル シ リ テ ィク ス に 関 し て は 、 ま だ 、 臨床 応 用 さ れ てい る 薬 物 は な く、 臨 床 適 応 され る カ ル シ ｜Jテ ィ ク ス の開 発 が よ り 重 要 では な い か と 返 答し た 。

  HDR症 候 群 に 関す る 論 文は 、Endocrine Journal，2011，58（2），123−130に掲 載され てお り、こ の 知 見 はHDR症 候 群 で の 新 た な 臨 床 所 見 の 合 併 の 可 能 性 に つ い て 、 ま た 、Mueller管 形 成 に お け るGATA3の 関 与 の 可 能 性に つ い て 言 及し て い る 。 ま た、 カ ル シ ウ ム感 知 受 容 体 の機 能 解 析 は 、 今 後 、 受 容 体 の シ グ ナ ル 伝 達 の 機 序 解 明 に 重要 で あ り 、 ア 口ス テ リ ッ ク モデ ュ レ ー タ ーの 変 異 受 容 体 の 機 能 変 化 の 成 果 は 、 CASR異 常 症 の 新 た な 治 療 法 と し て 期 待 さ れ る 。   審 査 員 一 同 は 、 こ れ ら の 成 果 を 高 く 評 価し 、 大 学 院 課程 に お け る 研鑽 や 単 位 取 得 など も 併 せ 申 請 者 が 博 士 （ 医 学 ） の 学 位 を 受 け る の に 充 分 な 資 格 を 有 す る も の と 判 定 し た 。

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