博士論文概要書
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全文
(2) 本論文は、マイクロ・ナノ技術を用いた小型免疫センサシステムの高感度化、 及び反応／検出の短時間化の試みについて述べたものである。近年、生物化学研 究分野・医療分野において、小型装置を用いて短時間で高感度に生体分子の検出 を 行 う 技 術 に 対 す る ニ ー ズ が 高 ま っ て き て い る 。こ の ニ ー ズ の 解 決 の 手 法 と し て 、 マ イ ク ロ ・ ナ ノ 技 術 の 化 学 ・ 生 化 学 分 野 へ の 応 用 手 法 の 一 つ で あ る µ TA S （ M i c r o To t a l A n a l y s i s S y s t e m s ） の 技 術 を 用 い た マ イ ク ロ 分 析 デ バ イ ス の 構 築 が 有 効 で ある。 本 論 文 で は 、 上 述 し た µ TA S 技 術 を 応 用 し た 小 型 免 疫 セ ン サ シ ス テ ム の 、 従 来 にない高感度化、反応／検出の短時間化の実現を目的とし、新たな技術開発を行 った成果を述べている。具体的には、デバイスの小型化及び固定化抗体の高密度 化 に よ る 、免 疫 測 定 時 間 が 従 来 の 1 / 3 0 の 迅 速 化 技 術 、さ ら に 電 気 化 学 測 定 用 櫛 歯 電 極 の 3 次 元 化 と 磁 性 化 に よ る 従 来 比 10 倍 以 上 の 検 出 感 度 を 持 つ シ ス テ ム の 開 発 を 実 現 し た 。ま た 、コ ン パ ク ト デ ィ ス ク（ CD）免 疫 測 定 シ ス テ ム に お い て 、定 量用疎水バルブ、免疫反応用マイクロカラムを用いることで、微量サンプル量で pM レ ベ ル の AFP の 高 感 度 免 疫 測 定 を 可 能 と し た 既 存 シ ス テ ム の 評 価 と 、評 価 結 果から抽出した問題点を解決するための新規システムを提案した。以上、３種類 の新規小型免疫センサシステムの技術開発の成果を述べている。 本論文は全７章から構成されている。以下、各章の内容について概説する。 第 1 章「序論」では、臨床検査分野において用いられている高感度分析方法の １つである免疫測定法の歴史および特徴について述べている。特に、免疫反応を マ イ ク ロ 環 境 で 実 現 さ せ た と き の 利 点 を 明 確 化 し 、 次 章 以 降 で 述 べ る µ TA S 技 術 応用のキーポイントについて論じている。. 第 2 章「免疫測定の高速化・高感度化のための要素技術の抽出」では、第 3 章 以降で述べる応用アプリケーションのためのキーテクノロジーを抽出し、考察を 加えている。これは下記の 2 点である。①免疫反応の迅速化に必要な要素技術と して、対象物質の拡散距離と固相抗体濃度に関する理論的考察、②検出原理の高 感度化に必要な要素技術として、蛍光測定法及び電気化学測定法における検出原 理 と そ の 高 感 度 化 法 の 理 論 的 背 景 。こ れ に よ り 、マ イ ク ロ デ バ イ ス を 用 い た 迅 速 、 高感度免疫測定系の実現のための要素技術を明らかにした。. 第 ３ 章 「 フ ロ ー 蛍 光 免 疫 反 応 の 高 速 化 ・ 高 感 度 化 」で は 、デ バ イ ス の 小 型 化 及 び固定化抗体の高密度化による、免疫反応の高速化、高感度化について論じてい 1.
(3) る。免疫測定用マイクロフローセルにおいて、①抗体固定化技術としてシリコン チップ上への高密度固定化技術、②フロー免疫反応によりサンプル中の測定物質 がチャネル表面に固定化されている抗体へ到達するための拡散時間を大幅に減少 させる方法、の 2 点について新規に検討した。この結果、従来のプレートによる 免 疫 測 定 方 法 に 比 較 し て 1 / 3 0 、マ イ ク ロ チ ッ プ 上 に 液 滴 サ ン プ ル を 反 応 さ せ る 場 合 に 比 較 し て も 1/5 以 下 の 反 応 時 間 と い う 、 従 来 技 術 で は な し 得 な か っ た 高 速 な 免疫測定を実現した。 第４章「3 次元櫛歯電極による免疫反応の高速化・高感度化」では、電気化学 測定用櫛歯電極の 3 次元化と磁性化による高感度化、及びシステム化について論 じている。高アスペクト比 3 次元マイクロ構造体作製方法の基本技術となる裏面 露光法と、微細電析技術を用いることで、3 次元櫛歯電極構造を持つ電気化学免 疫 測 定 用 マ イ ク ロ チ ッ プ を 作 製 し 、 従 来 の 類 似 構 造 に 比 較 し 10 倍 以 上 の 高 感 度 化に初 めて 成功 し た。こ れは 電極 を Z 軸方向 に立 体化 さ せるこ とに より 、微小な 隙間を持つ電極間に酸化還元物質を閉じ込めることで、酸化還元反応の増幅を図 るコンセプトをデバイスに組み入れたものであり、このようなコンセプトの電気 化学測定用の電極は世界で初めての試みである。また、3 次元櫛歯電極の作製材 料 を 磁 性 体 材 料 に 変 え る こ と で 、更 に 2 倍 以 上 の 高 感 度 化 に も 成 功 し た 。こ れ は 、 硬磁性 体材 料で 作 製した 3 次元 櫛歯 電極表 面に 、抗 体 を固定 化さ せた 磁 性粒子 を トラップさせることで、電極表面近くでおこる酵素反応を高効率化し、超高感度 な電気化学免疫測定を可能にしたものである。さらに、チャネル内流速を制御す ることで磁性微粒子の電極表面への吸着・解離をコントロールすることも可能と し、磁性体を材料とした立体櫛歯電極によるフロー免疫反応のシステム化にも世 界で初めて成功した。 第 5 章「 コ ン パ ク ト デ ィ ク ス 型 免 疫 測 定 デ バ イ ス の 評 価 と 新 規 開 発 」で は 、遠 心 力 と 疎 水 バ ル ブ を 原 理 と し た 既 存 コ ン パ ク ト デ ィ ス ク (CD) 型 蛍 光 免 疫 測 定 シ ステムの評価を行うことでその問題点を抽出し、高感度化・迅速化を実現する新 規 シ ス テ ム の 提 案 を 行 っ た 。 既 存 シ ス テ ム の 利 点 と し て 、 CD 型 の プ ラ ス チ ッ ク デバイスに形成したマイクロチャネル中に微小粒子を充填し、遠心力と疎水バル ブを使うことで正確な微量溶液の定量と効率的な蛍光免疫反応が実現できること を確認した。一方問題点として、①蛍光検出のバックグラウンドノイズが再現性 を低下させている、②検出感度が臨床検査における要求感度に達していない、③ 免疫反応時間が迅速検査システムとしては長い、の３点を明らかにした。これら 2.
(4) の技術的な問題点を解決するため、①検出原理を酵素発光測定にすることによる バックグラウンドノイズの低減と検出シグナルの向上、②サンプル量増大による 検出シグナルの向上、③固相用微粒子の表面積の増大、という特徴を持つＣＤ型 免 疫 反 応 デ バ イ ス を 新 た に 考 案 し た 。 こ れ に よ り P O C T ( P o n t o f C a r e Te s t i n g ) 臨床検査分野に適用可能な超迅速・超高感度免疫測定システムを世界に先駆けて 実現するための道筋を示した。 第 6 章「高効率フロー型蛍光免疫測定用マイクロチップの開発」では、新しく開 発したパッシブバルブ付きのマイクロチャネル構造体を利用した免疫分析用マイ クロチップの開発について論じている。マイクロバルブの構造的な特徴を利用す ることにより、サンプル中の測定物質（抗原）がチャネル表面に固定化されてい る抗体へ到達時間を大幅に短縮できることを、流体シミュレーションで確かめ、 試作デバイスにおいて実証した。 第 7 章では、以上を総括し、結論と今後の展望を述べている。 以 上 、 本 論 文 に お い て 著 者 は 、 µ TA S 技 術 の 応 用 に よ り 、 従 来 技 術 で は な し え なかったデバイスの小型化及び固定化抗体の高密度化による免疫測定時間の迅速 化、電気化学測定用櫛歯電極の 3 次元化と磁性化による免疫測定の高感度化、既 存 CD 免 疫 測 定 シ ス テ ム の 問 題 点 の 抽 出 と 技 術 的 課 題 の 考 察 に よ る 高 機 能 新 規 発 光ＣＤ免疫測定システムの提案を行い、超小型イムノセンシングシステムの将来 展開について道筋を示した。. 3.
(5) 研 究 業 績 種 類 別 論文. 題名、. ○ 1.. 発表・発行掲載誌名、. N.Honda,. U . Li n d b e rg ,. 発表・発行年月、. P. A n d e r s s o n ,. 連名者（申請者含む）. S . H o ff m a n n ,. H . Ta k e i ,. “Simultaneous multiple immunoassays in a CD-shaped microfluidic d e v i c e b a s e d o n c e n t r i f u g a l f o r c e . C l i n i c a l c h e m i s t r y” , C l i n i c a l C h e m i s t r y, 5 1 , ( 2 0 0 5 ) p p 1 9 5 5 - 1 9 6 1 . ○ 2.. N.Honda,. T. O s a k a ,. M . In a b a ,. M.Saito,. electrochemical Biosensors. T. K a t a g i r i ,. J.Mizuno. immuno. and. and. sensors. S.Shoji, Y. Wa d a , using. B i o e l e c t r o n i c s , Vo l . 2 0 ,. 3D. H.Sato,. T. H o m m a ,. “High. e ff i c i e n c y. comb. electrodes,. Is s u e. 11 ,. (2005). pp2306-2309. 国際学会 （論文）. ○ 1 . N . H o n d a , T. K a t a g i r i , M . I n a b a , Y. Ya m a g u c h i , S . S h o j i , H . S a t o , T. H o m m a , T. O s a k a , “ H i g h E f f i c i e n c y F l o w E l e c t r o c h e m i c a l Immuno Sensors Using 3-D Comb Electrodes Made of Magnetic A l l o y ” , 5 t h IE E C o n f e r e n c e o n N a n o t e c h n o l o g y 2 0 0 5 , N a g o ya ,. (2005) PS-TU8-5 ○ 2 . N . H o n d a , K . E m i , T. K a t a g i r i , T. I r i t a , S . S h o j i , H . S a t o , T. H o m m a , T. O s a k a , M . S a i t o , J . M i z u n o , Y. Wa d a , “ 3 - D c o m b e l e c t r o d e s f o r a m p e r o m e t r i c i m m u n o s e n s o r s ” , 1 2 t h In t . C o n f . O n S o l i d - S t a t e S e n s o r s , A c t u a t o r s a n d M i c r o s y s t e m s : Tr a n s d u c e r s ’ 0 3 , Vo l . 2 , B o s t o n , ( 2 0 0 3 ) p p 11 3 2 - 11 3 5 . ○ 3 . N . H o n d a , S . S h o j i , M . Is o m u r a , Y. A s h i h a r a , K . A k a h o r i , H . S a t o , “ F a b r i c a t i o n o f M i c r o F l o w C e l l f o r M u l t i - A n a l yt e S a n d w i c h I m m u n o a s s a y, U s i n g Te f l o n M i c r o C h e c k Va l v e s ” , P r o c . M i c r o To t a l A n a l ys i s S ys t e m s 2 0 0 1 : µTA S 2 0 0 1 , ( 2 0 0 1 ) p p 4 0 3 - 4 0 4 . 国 際 学 会 ○ 1 . N . H o n d a , U . L i n d b e r g , P. A n d e r s s o n , S . H o f f m a n n , H . Ta k e i , （講演） “Simultaneous multiple immunoassays in a CD-shaped microfluidic device based on centrifugal force”, 37th Annual Oak Ridge Conference, Baltimore,（ 2005） abstruct36. ○ 2 . N . H o n d a , T. K a t a g i r i , M . In a b a , Y. Ya m a g u c h i , S . S h o j i , H . S a t o , T. H o m m a , T. O s a k a , “ F l o w t yp e e l e c t r o c h e m i c a l i m m u n o s e n s o r s using. 3D. comb. electrodes”,. 2004. In t .. Microprocess. &. N a n o t e c h n o l o gy C o n f e r e n c e : M N C 2 0 0 4 , O s a k a , ( 2 0 0 4 ) p p 2 4 2 - 2 4 3 . ○ 3. N.Honda, T Katagiri, S Shoji, H Sato, T Homma, T Osaka, “ Im p r o v e m e n t o n s e n s i t i v i t y o f t h e a m p e r o m e t r i c i m m u n o s e n s o r s 5.
(6) u s i n g 3 - D c o m b e l e c t r o d e s ” , 8 t h Wo r l d C o n g r e s s o n B i o s e n s o r s 2004,Gradana, (2004) BS590. ○ 4 . N . H o n d a , T. K a t a g i r i , M . I n a b a , S . S h o j i ， H . S a t o , T. H o m m a , T. O s a k a , “ F a b r i c a t i o n o f 3 D C o m b E l e c t r o d e s U s i n g M a g n e t i c A l l o y f o r H i g h E f f i c i e n c y Im m u n o S e n s o r s ” , 2 0 5 t h M e e t i n g o f E l e c t r o c h e m i c a l S o c . , S an A n t o n i o , U S A ( 2 0 0 4 ) p p 9 0 9 . ○ 5 . N . H o n d a , K . E m i , T. K a t a g i r i , S . K a w a k a m i , T. Ir i t a , S . S h o j i , H . S a t o , T. H o n m a , T. O s a k a , , “ F a b r i c a t i o n a n d E v a l u a t i o n o f Amperometric Sensors for Micro Flow Cell using 3-D Comb Electrodes”, Dig. Int. Microprocesses and Nanotechnology Conf.; M N C 2 0 0 2 , To k yo , ( 2 0 0 2 ) p p 2 9 0 - 2 9 1 . ○. 6. N.Honda,. S.Shoji,. M . Is o m u r a ,. Y. A s h i h a r a ,. K . Ta s h i r o ,. H . S a t o , ” M i c r o F l o w C e l l f o r S e q u e n t i a l S a n d w i t c h Im m u n o a s s a y Using. Passive. Microvalves”,. The. 7th. Wo r l d. Congress. on. B i o s e n s o r s , B i o s e n s o r s 2 0 0 2 ( 2 0 0 2 ) A 2 . 11 . ○ 7 . N . H o n d a , S . S h o j i , M . Is o m u r a , Y. A s h i h a r a , K . A k a h o r i , H . S a t o , “ P r o t o t yp e. of. Micro. Flow. Cell. for. Multi-Anal yte. Sandwich. I m m u n o a s s a y” , P r o c . M i c r o p r o c e s s & N a n o t e c h n o l o g y C o n f e r e n c e : MNC2001, (2001) pp24-25. 8. S . S h o j i ,. H.Sato,. M.Kanai,. M . Is h i z u k a ,. N.Honda,. T. H o m m a ,. T. F u n a t s u , T. O s a k a , “ M i c r o / n a n o f l o w d e v i c e s a n d s ys t e m s f o r bio-applications”, 3rd Sino-Japanese Joint Seminar on Separation Science, Dalian, 2004.4.2-4, (2004) pp82-87. 9. S . S h o j i ,. H.Sato,. M.Kanai,. M.Ishizuka,. N.Honda,. T. H o m m a ,. T. F u n a t s u , T. O s a k a , “ M i c r o / n a n o d e v i c e s f o r m i c r o t o t a l a n a l y s i s s y s t e m s ” , 1 s t I n t . Wo r k s h o p o n N e t w o r k e d S e n s i n g S y s t e m s : I N S S 2 0 0 4 , To k y o , ( 2 0 0 4 ) p p 7 - 11 .. 10. S h u i c h i S h o j i , N . H o n d a , H . S a t o , M . K a n a i , M . I s h i z u k a , T. Funatsu,. “Micro. Handling. in. Flow. Micro. Devices/Systems. Flow. Channels”,. 1st. and Int.. Biomolecules Meeting. on. M i c r o s e n s o r s & M i c r o s y s t e m s , J a n u a r y 1 2 - 1 4 , Ta i n a n , ( 2 0 0 3 ) pp17-23. 6.
(7) 1 1 . S . S h o j i , K . Ta s h i r o , T. S e k i g u c h i , H . S a t o , N . H o n d a , T. F u n a t u , “Particles and molecules handling in micro channels”, L a b - o n - a - c h i p , M i n i a t u r i e s S ys t e m s f o r ( B i o ) C h e m i c a l A n a ys i s a n d S yn t h e s i s , E l s e v i e r B . V. , A m s t e r d a m , ( 2 0 0 3 ) p p 2 0 5 - 2 1 4 . A a a a 12. S . S h o j i ,. J.S.. Go,. H.Sato,. N.Honda,. M.. Is h i z u k a ,. M.Kanai,. T. F u n a t s u , T. H o n m a , T. O h s a k a , “ M i c r o f l o w d e v i c e s a n d s y s t e m s for chemical/biochemical applications using MEMS technologies”, 1 s t K o r e a - J a p a n S ym p . O n M i c r o s ys t e m s f o r Li f e S c i e n c e a n d C h e m i s t r y:. 1st. K J S M LC ,. K A I S T,. Daejeon,. Korea,. (2003-10). pp58-60. 13. S . S h o j i , H . S a t o , M . Is h i z u k a , N . H o n d a , T. I r i t a , T. F u n a t s u , T. H o m m a , T. O h s a k a , “ M i c r o f l o w d e v i c e / e l e m e n t s a n d a micro. bio-molecules. Japan-European. handling. Wo r k s h o p. on. systems”, Chemical. 1st Micro. Mechatronics Systems and Biochips, February 19, Paris, (2003) 14. S . S h o j i ,. N . H o n d a , H . S a t o , K . Ta s h i r o , T. S e k i g u c h i , T. F u n a t s u ,. “Micro Flow Devices and Biomoleculer Handling in Micro Flow Channels”,. Proc.. 1st. In t .. S ymp.. On. Ultramicrochemical. P r o c e s s : IS U P 2 0 0 2 , ( 2 0 0 2 ) p p 8 3 - 8 9 . 1 5 . S . S h o j i , K . A k a h o r i , K . Ta s h i r o , H . S a t o , N . H o n d a , “ D e s i g n and fabrication of micromachined chemical/biochemical s y s t e m s ” , 1 s t J a p a n - S w i t z e r l a n d B i l a t e r a l Wo r k s h o p o n S c i e n c e & Te c h n o l o g y i n M i c r o / N a n o S c a l e , R i k e n S y m p . , ( 2 0 0 0 - 11 ) 16.S.Shoji, K.Akahori, S.Kondo, E.Shinohara, H.Sato, N . H o n d a , ” 8 x 1 2 a r r a y m i c r o r e a c t o r s r e a l i z i n g e ff i e n t b i o c h e m i c a l r e a c t i o n s ” , 2 n d I n t . Wo r k s h o p o n M i c r o f a c t o r i e s , F r i b o u rg , ( 2 0 0 0 - 1 0 ) p p 1 0 7 - 11 0 . 国内（招待 1. 本 多 信 雄 , マイクロデバイスを用いた免疫測定技術の研究 , 講演） 第 9 回学術シンポジウム 免 疫 化 学 測 定 法 研 究 会 年 報 、第 9 号 ( 2 0 0 4 ) pp46‑47.. 7.
(8) 国内 （講演）. 1. 片 桐 崇 史 ,佐 藤 裕 嵩 ,本 多 信 雄 ,本 間 敬 之 ,庄 子 習 一 ,逢 坂 哲 彌 , 体櫛歯電極を用いたマイクロイムノセンサーの開発. 立. , 第 8 回化学. と マ イ ク ロ ･ナ ノ シ ス テ ム 研 究 会 (東 京 都 ), 2003.11.19. 2. 佐 藤 裕 嵩 , 片 桐 崇 史 , 恵 美 健 一 , 本 多 信 雄 , 本 間 敬 之 , 逢 坂 哲 彌 , 庄 子 習一,. 電 解 ･無 電 解 析 出 法 に よ る 立 体 型 微 小 櫛 歯 電 極 の 作 製 お よ. び評価. ,日 本 化 学 会 第 83 春 季 年 会 (東 京 都 ), 2003.03.18.. 3. 赤 堀 光 希 , 関 口 哲 史 , 本 多 信 雄 , 庄 子 習 一 , PDMS マ イ ク ロ 構 造 体 の 製 作. Metal 構 造 埋 め 込 み. , 第 5 回化学とマイクロシステム研. 究 会 (京 都 府 ), 2002.03.15. 4. 本 多 信 雄 ,赤 堀 光 希 ,佐 藤 寛 暢 ,庄 子 習 一 ,. 蛍光免疫測定法を用い. たフロー型マイクロデバイスの開発 〜フローデバイスの試作と抗 体固定化方法の検討〜. , 第 3 回化学とマイクロシステム研究会,. 2001.05.07. 5. 本 多 信 雄 ,赤 堀 光 希 ,庄 子 習 一 , スチック構造体の試作 チャネルの製作〜. 機能性マイクロ素子埋め込みプラ. 〜 光 学 検 出 用 ガ ラ ス 窓 を 埋 め 込 ん だ PDMS. , 第 2 回化学とマイクロシステム研究会（兵. 庫 県 ） , 2000.9.29, P15. 特許. 1. 特 開 2 0 0 4 ‑ 0 9 3 4 0 6 ， 本 多 信 雄 ， 庄 子 習 一 ， 本 間 敬 之 ， 佐 藤 裕 崇 ， 溶 液 測 定 用 微 小 電 極 ，電 気 化 学 測 定 装 置 ，電 極 の 製 造 方 法 ，及 び 溶 液 測 定 法 ， 富 士 レ ビ オ （ 株 ）（ 2 0 0 2 . 8 . 3 0 出 願 、 2 0 0 4 . 3 . 2 5 公 開 ） 2 . 特許 3470936, 磯 村 光 男 , 本 多 信 雄 , 芦 原 義 弘 , 測定試薬. 3.. , 富 士 レ ビ オ （ 株 ）（ 1 9 9 6 . 9 . 6 出 願 、 1 9 9 8 . 3 . 3 1 公 開 ）. 特許 3269401, 磯 村 光 男 , 本 多 信 雄 , 芦 原 義 弘 , 定試薬. 免疫測定方法及びその. 免疫測定方法及びその測. , 富 士 レ ビ オ （ 株 ） (1996.9.6 出 願 、 1998.3.31 公 開 ）. 8.
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