博 士 論 文 概 要

早稲田大学大学院 先進理工学研究科

博 士 論 文 概 要

論 文 題 目

細胞シート及び生体由来組織を用いた 立体心筋組織作製のための

血管網付与技術の開発

Vascularization for developing

three-dimensional cardiac tissues using cell sheets and explanted tissues

申 請 者

竹内 涼平 Ryohei TAKEUCHI

生命理工学専攻 医用機械工学研究

2015 年 12 月

（ 受 理 申 請 す る 研 究 科 運 営 委 員 会 開 催 年 月 を 記 入 ）

本 研 究 で は 、移 植 可 能 な 動 静 脈 付 き の 立 体 心 筋 組 織 を 作 製 す る た め に 、in v itro で 細 胞 シ ー ト に 血 管 網 を 付 与 す る 技 術 の 開 発 を 目 的 と し た 。

１ 章 で は 、 重 症 心 不 全 と 現 治 療 法 、 心 臓 の 再 生 医 療 の 現 状 と 課 題 、 研 究 目 的 、 本 研 究 の 成 果 に よ り 期 待 さ れ る こ と に つ い て 説 明 し 、 本 論 文 の 構 成 を 示 し た 。 こ れ ま で 、 重 症 な 心 不 全 患 者 に 対 し て は 、 心 臓 移 植 ま た は ブ リ ッ ジ と し て 適 用 さ れ る 補 助 人 工 心 臓 し か 治 療 法 が な か っ た 。 し か し 、 心 臓 移 植 は ド ナ ー 不 足 の 問 題 、 補 助 人 工 心 臓 は 移 植 後 の 感 染 管 理 、 血 栓 、 長 期 耐 久 性 に 課 題 が あ る 。 ま た 、 心 臓 移 植 や 補 助 人 工 心 臓 の 適 応 と な ら な い 患 者 も 多 い 。 そ う し た 課 題 に 対 し て 、 細 胞 や 組 織 を 用 い た 新 し い 治 療 法 で あ る 再 生 医 療 が 期 待 さ れ て い る 。心 臓 に お い て は 、 こ れ ま で に 様 々 な 細 胞 を 用 い た 臨 床 試 験 が 行 わ れ た が 、 結 果 は 一 様 で は な く 、 患 部 に 注 射 さ れ た 移 植 細 胞 が 生 着 し な い と い う 課 題 が 指 摘 さ れ て い る 。 そ の 課 題 を 解 決 す る 一 つ の 手 段 と し て 、 細 胞 シ ー ト を 用 い た 手 法 が あ る 。 細 胞 シ ー ト は 東 京 女 子 医 科 大 学 の 岡 野 ら に よ り 開 発 さ れ た 温 度 応 答 性 培 養 皿 を 用 い て 作 製 さ れ る 。 ト リ プ シ ン 等 の 酵 素 を 使 わ ず に 細 胞 を 剥 離 で き る た め 、 接 着 タ ン パ ク 質 を 保 持 し た 状 態 で 細 胞 を シ ー ト 状 に 回 収 で き 、 移 植 後 の 細 胞 の 生 着 が 良 い と い う 特 徴 が あ る 。既 に 骨 格 筋 芽 細 胞 シ ー ト を 用 い た 臨 床 試 験 が 日 本 で 行 わ れ 、20 1 5 年 9 月 に 世 界 で 初 め て 心 不 全 治 療 用 の 再 生 医 療 等 製 品 （ ハ ー ト シ ー ト 、 テ ル モ 株 式 会 社 ） と し て 承 認 さ れ た 。 し か し 、 細 胞 シ ー ト を 積 層 し て 移 植 し た と し て も 、 心 筋 細 胞 の 場 合 、最 大 で 厚 み 8 0 μ m ま で し か 生 存 し な い た め 、一 度 に 移 植 で き る 細 胞 数 に は 限 界 が あ る 。 そ の た め 、 心 臓 の 機 能 を 補 填 ま た は 代 替 す る よ う な 組 織 の 臨 床 応 用 に は 至 っ て い な い 。 非 臨 床 研 究 で は 、 こ れ ま で 、 清 水 ら が 細 胞 シ ー ト を ラ ッ ト 皮 下 組 織 に 繰 り 返 し 移 植 す る こ と で 、厚 さ 1 m m の 心 筋 組 織 の 構 築 に 成 功 し て い る 。 こ れ は 組 織 構 築 に 必 須 な 血 管 が 、 適 切 に 形 成 さ れ た こ と に よ り 達 成 さ れ て い る 。 臨 床 に 適 用 す る 場 合 、 患 者 自 身 の 皮 膚 を 繰 り 返 し 切 開 す る こ と は 、 侵 襲 性 が 高 く 現 実 的 な 手 法 で は な い 。 そ こ で 、 生 体 内 で は な く 、 生 体 外 で 組 織 を 構 築 す る 技 術 開 発 が 必 要 と な る 。 こ れ ま で 、 清 水 ら は 筋 肉 組 織 ま た は 流 路 付 き コ ラ ー ゲ ン を 足 場 と し て 、 バ イ オ リ ア ク タ ー を 用 い た 灌 流 培 養 を 行 い 、 生 体 外 で の 心 筋 組 織 構 築 に 成 功 し て い る 。 し か し 、 こ れ ら を 臨 床 応 用 す る 場 合 、 自 家 筋 肉 の 採 取 が 必 要 と な り 侵 襲 が 大 き い 、 移 植 す る た め の 吻 合 可 能 な 血 管 を 有 し て い な い 、 組 織 の 大 き さ が 足 り な い と い っ た 課 題 が あ る 。 こ れ ら の 課 題 を 解 決 す る た め 、 本 研 究 で は 、 移 植 可 能 な 動 静 脈 付 き の 立 体 心 筋 組 織 の 作 製 に お い て 、 生 体 組 織 を 用 い て in v itro で 細 胞 シ ー ト に 血 管 網 を 付 与 す る 技 術 の 構 築 を 目 指 し た 。

2 章 で は 、 立 体 心 筋 組 織 作 製 に 用 い る 細 胞 シ ー ト に つ い て 、 生 存 及 び 血 管 新 生 す る 能 力 を 生 体 内 に て 評 価 し た 。 具 体 的 に は 、 ラ ッ ト 背 部 皮 下 組 織 に 移 植 し た 新 生 仔 ラ ッ ト 心 筋 細 胞 シ ー ト に 対 し て 、 組 織 学 、 生 体 イ メ ー ジ ン グ 、 遺 伝 子 学 を 用 い た 細 胞 生 存 の 定 量 評 価 及 び 細 胞 シ ー ト 内 の 血 管 形 成 の 挙 動 に つ い て 評 価 を 行 っ た 。 細 胞 生 存 評 価 の 結 果 、 細 胞 シ ー ト は 移 植 直 後 、1 日 後 、3 日 後 ま で の ア ポ ト

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ー シ ス （T U N E L 陽 性 ） を 示 す 細 胞 が イ ン ジ ェ ク シ ョ ン に 比 べ て 少 な く 、 ル シ フ ェ ラ ー ゼ 遺 伝 子 を 導 入 し た 細 胞 を 移 植 し て 行 っ た in v ivo 発 光 イ メ ー ジ ン グ に よ る 評 価 で は 、1 年 以 上 の 長 期 に わ た り 生 着 す る こ と が わ か っ た 。 ま た 、GF P 陽 性 細 胞 を 移 植 し て 行 っ た in v iv o 蛍 光 イ メ ー ジ ン グ に よ る 評 価 で は 、 移 植 後 6 時 間 で 細 胞 シ ー ト 内 で の 血 管 新 生 を 認 め 、1 2 時 間 に は 形 成 さ れ た 血 管 に 血 流 を 認 め 、 3 日 で 内 皮 細 胞 マ ー カ ー で あ る C D 3 1 陽 性 の 血 管 数 は ピ ー ク を 迎 え 、7 日 の 間 に N G 2 陽 性 の 周 皮 細 胞 を 有 す る 成 熟 し た 血 管 を 構 築 す る こ と が わ か っ た 。こ の 早 期 の 血 管 新 生 及 び 成 熟 の 過 程 を リ ア ル タ イ ム PC R で 解 析 し た 結 果 、 移 植 後 1 日 ま で は 血 管 の 新 生 に 関 わ る V E GF や b F G F、 等 が 高 発 現 し 、3 日 目 以 降 は 血 管 の 成 熟 に 関 わ る P D G F や An g１ 等 が 高 発 現 す る こ と が わ か っ た 。以 上 の 結 果 か ら 、細 胞 シ ー ト に よ り 血 管 新 生 及 び 成 熟 に 係 る サ イ ト カ イ ン が 最 適 な タ イ ミ ン グ で 産 生 さ れ 、 早 期 に 十 分 な 血 管 新 生 及 び 成 熟 が 起 こ り 、 長 期 の 生 着 に つ な が っ て い る こ と が 示 唆 さ れ た 。 こ れ ら の 結 果 は 、 細 胞 シ ー ト が 血 管 新 生 及 び 生 存 に つ い て 高 い ポ テ ン シ ャ ル が あ る こ と を 示 め す と と も に 、 生 体 外 に お い て も 血 管 新 生 及 び 成 熟 に 係 る サ イ ト カ イ ン を 経 時 的 に 調 整 す る こ と で 、よ り 生 体 環 境 に 近 い 培 養 が で き 、 豊 富 で 成 熟 し た 血 管 網 を 有 す る 心 筋 組 織 を 構 築 で き る 可 能 性 が 示 さ れ た 。

3 章 及 び 4 章 で は 、 移 植 可 能 な 血 管 付 き 立 体 心 筋 組 織 の 構 築 に お い て 、 細 胞 シ ー ト に 血 管 網 を 付 与 す る た め 、 動 静 脈 付 き の 生 体 組 織 を 血 管 床 と し て 活 用 で き る か を 評 価 し た 。3 章 で は 、 筋 肉 に 比 べ て 低 侵 襲 に 摘 出 可 能 で あ る 脂 肪 組 織 を 用 い て 、 生 体 内 で の 脂 肪 血 管 床 の 作 製 、 細 胞 シ ー ト へ の 血 管 網 付 与 の 検 討 を 行 っ た 。 脂 肪 組 織 は 筋 肉 に 比 べ て 血 管 数 が 少 な い た め 、 ラ ッ ト 生 体 内 に て 血 管 網 を 増 加 さ せ る た め 一 定 期 間 生 体 内 に 静 置 し た 。 腹 部 の 脂 肪 を 大 腿 動 静 脈 付 き で 直 径 3 c m 程 度 に ト リ ミ ン グ し 、 そ の 他 の 分 枝 を 結 紮 す る こ と で 、 血 管 床 の み に 血 流 が 行 く よ う に し た 。 そ の 後 、 生 体 内 に 0 日 、1 日 、1 週 、2 週 、3 週 、4 週 間 静 置 し た 後 に 摘 出 し た 。血 管 網 の 増 加 を 評 価 す る た め 、動 脈 か ら 造 影 剤 を 投 与 し て μ C T に よ る 解 析 を 行 っ た 。 そ の 結 果 、 静 置 な し に 比 べ て 静 置 期 間 が 長 く な る ほ ど 血 管 網 が 徐 々 に 発 達 す る こ と が わ か っ た 。 続 い て 、 生 体 の 静 置 期 間 2 週 、3 週 、4 週 間 の 脂 肪 血 管 床 を 摘 出 し 、 新 生 仔 ラ ッ ト 心 筋 細 胞 シ ー ト を 血 管 床 に 移 植 し 、 生 体 外 で バ イ オ リ ア ク タ ー （37℃ 、5 % C O2） を 用 い て 灌 流 培 養 を 行 っ た 。 そ し て 、 細 胞 シ ー ト 内 の 血 管 形 成 を 確 認 す る た め 、 動 脈 か ら 墨 汁 を 流 し 、 組 織 切 片 を A za n 染 色 し た 結 果 、2 8 日 間 の 脂 肪 血 管 床 を 用 い て 培 養 し た 細 胞 シ ー ト 内 に 墨 汁 が 一 部 確 認 さ れ 、 血 管 が 構 築 さ れ て い る こ と が 示 唆 さ れ た 。 し か し 、 管 腔 様 の 構 造 は わ ず か で あ り 、 生 体 内 の 静 置 に よ り 血 管 網 を 発 達 さ せ て も 、 脂 肪 組 織 は 血 管 網 付 与 の 足 場 と し て は 不 向 き で あ る と 考 え ら れ た 。 こ の 理 由 と し て は 、 血 管 床 の 表 面 近 傍 の 血 管 数 が 、 筋 肉 と 比 べ て 脂 肪 は 少 な か っ た た め と 考 え ら れ る 。 流 路 付 き コ ラ ー ゲ ン を 用 い た 坂 口 ら の 検 討 で は 、 細 胞 シ ー ト と 流 路 の 距 離 が 長 い ほ ど 、 細 胞 シ ー ト 内 の 細 胞 の 生 存 、 血 管 形 成 、 流 路 へ の 細 胞 の 遊 走 が 少 な く な る こ と が 確 認 さ れ て

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い る 。 こ の よ う に 、 脂 肪 組 織 は 、 臨 床 上 は 自 家 組 織 の 採 取 の ハ ー ド ル は 低 く 、 生 体 内 で 血 管 網 を 増 加 さ せ ら れ る が 、 細 胞 シ ー ト へ の 血 管 網 付 与 に 寄 与 で き る 血 管 が 少 な い た め に 、 組 織 構 築 の 足 場 と し て 不 向 き で あ っ た 。

4 章 で は 、3 章 で 明 ら か と な っ た 課 題 に 対 し て 、 細 胞 シ ー ト を 移 植 す る 表 面 近 傍 に 血 管 が 存 在 す る 腸 管 及 び 腸 間 膜 を 用 い て 、 血 管 床 の 作 製 、 細 胞 シ ー ト へ の 血 管 網 付 与 を 検 討 し た 。腸 管 の 場 合 、自 家 で の 採 取 は 侵 襲 が 高 く 現 実 的 で な い た め 、 他 家 ま た は 異 種 で の 使 用 と な る 。 こ の 場 合 、 拒 絶 反 応 の 問 題 が あ る た め 、 抗 原 と な る 細 胞 を 除 去 し て 足 場 の み に 処 理 で き る 脱 細 胞 と い う 手 法 を 適 用 し た 。ま ず は 、 よ り 血 管 と の 距 離 が 近 い と 考 え ら れ る 腸 間 膜 で の 培 養 が 可 能 で あ る か 、 未 処 理 の 組 織 で 確 認 し た 。 空 腸 と 回 腸 及 び 腸 間 膜 を 上 腸 間 膜 動 静 脈 付 き で 、 空 腸 と 回 腸 を 栄 養 す る 血 管 以 外 を 結 紮 し て 摘 出 し た 。 そ の 組 織 を 生 理 食 塩 水 で 洗 浄 し た 後 、 動 脈 か ら バ イ オ リ ア ク タ ー を 用 い て 心 筋 培 地 を 灌 流 し 、 腸 間 膜 に 移 植 し た 細 胞 シ ー ト の 培 養 を 行 っ た 。 墨 汁 を 動 脈 か ら 流 し た 後 の H E 染 色 の 結 果 、 腸 間 膜 上 で 細 胞 シ ー ト は 維 持 で き た も の の 、細 胞 シ ー ト 内 へ の 血 管 網 の 付 与 は 認 め ら れ な か っ た 。 こ れ は 、 血 管 の 距 離 は 近 い も の の 腸 間 膜 内 の 血 管 の 数 が 少 な い こ と に 起 因 し て い る と 考 え ら れ た 。 そ こ で 、 脱 細 胞 組 織 で の 検 討 で は 、 筋 肉 層 を 有 し 、 腸 内 か ら の 栄 養 の 取 り 込 み の た め に 血 管 網 が 豊 富 で あ る 腸 管 を 用 い て 、 細 胞 シ ー ト へ の 血 管 網 付 与 の 検 討 を 行 っ た 。 ま ず 、 腸 管 組 織 を 界 面 活 性 剤 の デ オ キ シ コ ー ル 酸 Na と D N A を 断 片 化 す る D Na s e を 用 い て 灌 流 し て 脱 細 胞 化 し た 。処 理 さ れ た 血 管 床 を 、 D N A 定 量 及 び H E 染 色 し た 。そ の 結 果 、組 織 か ら 細 胞 核 が 抜 け て い る こ と が 確 認 さ れ 、D N A 量 は 安 全 性 上 の 目 安 と な る 50 n g / m g 以 下 と な っ た 。 ま た 血 管 構 造 を H E 染 色 と 墨 汁 で 確 認 し た 結 果 、 血 管 網 が 維 持 さ れ て い る こ と が 確 認 で き た 。 そ こ で 、 血 管 床 に 細 胞 シ ー ト を 移 植 し 、 バ イ オ リ ア ク タ ー を 用 い た 灌 流 培 養 に よ る 評 価 を 行 っ た 。HE 染 色 の 結 果 、 細 胞 シ ー ト が 維 持 さ れ 、 シ ー ト 内 に 血 管 様 の 管 腔 が 多 数 認 め ら れ 、 内 皮 細 胞 マ ー カ ー で あ る C D 31 陽 性 の 血 管 ネ ッ ト ワ ー ク の 構 造 が 見 ら れ 、 細 胞 シ ー ト 内 に 墨 汁 も 確 認 で き た 。 こ の よ う に 、 本 検 討 に よ り 、 血 管 構 造 を 有 す る 脱 細 胞 組 織 を ラ ッ ト 小 腸 か ら 得 る こ と が で き 、 作 製 し た 脱 細 胞 腸 管 血 管 床 を 用 い て 生 体 外 で 心 筋 細 胞 シ ー ト に 血 管 網 を 導 入 し 、 血 管 付 き 心 筋 組 織 を 構 築 で き る 可 能 性 が 示 さ れ た 。

今 後 、適 切 な サ イ ト カ イ ン を 添 加 し た 培 地 及 び 繰 り 返 し 移 植 を 適 用 す る こ と で 、 組 織 の 成 熟 化 と 大 型 化 が 可 能 と 考 え ら れ る 。 ま た 、i P S 細 胞 の 大 量 培 養 及 び 心 筋 細 胞 へ の 分 化 誘 導 が 研 究 さ れ て お り 、i PS 由 来 心 筋 細 胞 シ ー ト の 作 製 に 成 功 し て い る た め 、 血 管 床 と 合 わ せ て H LA ホ モ の ヒ ト i P S 細 胞 を 用 い る こ と で 細 胞 の 面 で も 移 植 可 能 な 組 織 を 構 築 で き る 。こ の よ う な 移 植 可 能 な 立 体 組 織 の 構 築 技 術 は 、 重 症 心 不 全 患 者 の 新 た な 治 療 選 択 肢 の ひ と つ を 提 供 す る だ け で な く 、 心 臓 以 外 の 組 織 や 臓 器 、 三 次 元 組 織 を 用 い た 薬 剤 ス ク リ ー ニ ン グ に 有 用 と 考 え ら れ る 。

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Ｎｏ.1

早稲田大学 博士（工学） 学位申請 研究業績書

氏 名 印

（2015 年 11 月 現在）

種 類 別 題名、 発表・発行掲載誌名、 発表・発行年月、 連名者（申請者含む）

○論文

○論文

総説

講演

講演

講演

講演

著書

(特許)

(特許)

Takeuchi R, Kuruma Y, Sekine H, Dobashi I, Yamato M, Umezu M, Shimizu T and Okano T. In vivo vascularization of cell sheets provided better long-term tissue survival than injection of cell suspension. J Tissue Eng Regen Med 2014 January 28, doi:10.1002/term.1854.

Takeuchi R, Fukumori K, Sakaguchi K, Terajima Y, Shimizu T, Okano T, Umezu M. Novel device for transplantation of cell sheet and evaluation of thin polymer films by atomic force microscopy. Micro-Nano Mechatronics and Human Science (MHS), 2011 International Symposium 2011 November 6-9, doi: 10.1109/MHS.2011.6102201.

竹内涼平、清水達也、特集 異分野融合のためのバイオマテリアルの基礎 PART6 動物：動 物を用いた生体材料、バイオマテリアル-生体材料-、27 巻 第 4 号 2009 年 10 月、229-237

Takeuchi R, Sekine H, Shimizu T, Sameshima T, Matsuura K, Yamato M, Kobayashi E, Hagiwara N, Okano T. Cardiac Cell Sheets Have High Viability In Vivo Compared to Cell Suspensions. 2^nd World Congress of Tissue Engineering and Regenerative Medicine International Conference. Lotte Hotel World, Seoul, South Korea. August 31 - September 3, 2009. Chair: Jung-Man Kim, MD, PhD

竹内涼平、関根秀一、清水達也、鮫島正、松浦勝久、大和雅之、小林英司、萩原誠久、

岡野光夫、In vivo 発光イメージングを用いた細胞シートの生存評価と血管新生、第 31 回日本バイオマテリアル学会大会、京都、2009 年 11 月、 大会長 岩田 博夫

Takeuchi R, Fukumori K, Sakaguchi K, Terajima Y, Shimizu T, Okano T, Umezu M. Novel Device for Transplantation of Cell Sheet and Evaluation of Thin Polymer Films by Atomic Force Microscopy. 22nd MHS2011 & Micro-Nano Global COE. Nagoya University, Nagoya, Japan. November 6 – 9. General Co-Chair: Toshio Fukuda, PhD, Tatsuo Arai, PhD.

Takeuchi R, Kuruma Y, Sekine H, Shimizu T, Dobashi I, Matsuura K, Hagiwara N, Kobayashi E, Umezu M, Okano T. Dynamics of Engraftment of Cardiac Cell Sheets in vivo and Their Angiogenic Potential. 3rd World Congress of Tissue Engineering and Regenerative Medicine International Conference. Hofburg Congress Center, Vienna, Austria. September 5-8, 2012. Conference Chair: Heinz Redl, PhD.

竹内涼平、バイオマテリアルの基礎 5 章 5-3-4「組織学と顕微鏡」、5-3-5「生体イメ ージング」、日本医学館、2010 年

竹内涼平、坂口勝久、清水達也、「膜状組織移送器具及び膜状組織移送方法」、特願 2011-184760（国内）、2011 年 8 月

竹内涼平、坂口勝久、清水達也、「膜状組織移送器具及び膜状組織移送方法」、Application No./Patent No. 12175916.1 – 2310（欧州）、2012 年 3 月

Ｎｏ.2

早稲田大学 博士（工学） 学位申請 研究業績書

種 類 別 題名、 発表・発行掲載誌名、 発表・発行年月、 連名者（申請者含む）

(特許)

(特許)

竹内涼平、坂口勝久、清水達也、「膜状組織移送器具及び膜状組織移送方法」、Application No. 13/470,271（米国）、2011 年 5 月

竹内涼平、坂口勝久、清水達也、「膜状組織移送器具及び膜状組織移送方法」、申請号 201210123445.X（中国）、2012 年 4 月