ア ン チ セ ン ス核 酸 工 学 に よ る リ ン ゴ 果 実 の 完 熟 抑 制 に 関 す る研 究

ア ン チ セ ン ス核 酸 工 学 に よ る リ ン ゴ 果 実 の 完 熟 抑 制 に 関 す る研 究

:

0 7 6 6 0 0 0 3 )

平成7年度〜平成 8年度科学研究

費補助金 基盤研究

( C)

( 2)

平 成

9

3

アンチセ ンス核酸工学 による リンゴ果実の 完熟抑制 に関す る研究

研究組織

研究代表者 :原 田竹雄 (弘 前大学農学部助教授 ) 研究分担者 :な し

研究経 費

平成

7

1 , 700

8

6 0 0

計

2, 300

研究発表等 (1)学会誌等

Ge no mi cnuc l e ot i d es e q ue n c eofar l pe nl n g‑ r e l a t e d1 ‑ a mi noc yc l opr o pa ne ‑ 1 ‑ c a r boxyl a t es ynt ha s ege n e( Md ACS‑ 1 )i na ppl e . Ha r a daT

Su na k oT

Sa kur a ba W

Got oS

Se n d aM

ka d aS

I s hi ka waR

a ndNi i z e kiM ( 1 997 )Pl a ntPhys i o

( i mpr e s s )

( 2)

原 田竹雄 ･砂子智美 ･千 田峰 生 ･石川隆二 ･赤 田辰治 ･新 関稔 リンゴの ライ ブニ ング型

ACC

日本育種学会

9 0

1 99 5

1 0

吹

Ⅰ

1‑2

Ⅲ.

ACS

3‑7

Ⅲ . リン ゴ

ACS

入

8 ‑1 3

Ⅳ.

ACS

1 4‑1 7

V.

1 8‑1 9

摘 要 ‑‑‑‑‑ ‑‑‑･‑ ‑‑‑‑‑‑ ‑‑‑‑ ‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑ ‑‑‑24

参 考 資 料 ‑ ‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑ ‑ ‑‑‑‑‑‑ ‑‑‑ ‑‑‑‑‑‑‑‑

38

l. は じめに

リンゴは栽培の歴史 も古 く､多 くの国で栽培 されている｡我が国では生産額の約半分は 青森県で 占め られてお り､ この リンゴ産業 を支える様々な試験研究が県立 りん ご試験場や 弘前大学などで行われている｡リンゴの育種 においては､主として食味､耐病性､多収穫､

栗色 に加えて､熟期や貯蔵性が常 に関心がは らわれてきた｡ これは､晩熟巣 は貯蔵性が高 く､ しか も気温の低下 と伴 に､熟度 の進み方 も緩慢 となる ことに関係する｡すなわち､貯 蔵性のある品種 は､販売期間が長 い ことにな り､出荷の調整が容易であるという大 きな利 点を有す るか らである^｡

ライブニ ングは果実 の肥大生長が止 まってか らの有機酸の消失､細胞 の軟弱化な どの生 理現象過程 をいう^｡ リンゴの成熟 はライブニ ングに伴 って呼吸量が急激 に上昇す るク リマ

クテ リック型であ り､他の このタイ プの果物 と同様､植物ホルモ ンであるエチ レンが ライ ブニング過程へのプログラムスイ ッチであることが判 っている^｡ この ことか ら､ リンゴの 成熟や貯蔵性 はエチ レンの生合成 と密接な関修 にある｡ もし､エチ レンの生合成 を リンゴ 果実内で制御す る ことが可能 となれば､ トマ トでの成功例 と同様､果実のライブニ ングを 抑制す る ことに繋が り､その経済的な価値 は極めて大きな ものとなろう｡また､エチ レン はス トレス応答 に関わ る植物ホルモ ンとして も古 くか ら知 られている｡すなわち､物理的 傷害､病原菌の感染､湛水な どの様 々な ス トレスを受けると一過性 のエチ レン 生成の増 加が起 こり､ このエチ レン増加 に伴 い生理的あるいは生化学的な応答反応が引き起 こされ る｡また､花弁の萎凋､茎葉の老化 に対するエチ レンの影響 は､作物の栽培管理や生産 物の流通上極めて重要な問題であ り､その生合成の制御機構 を解明す ることはライブニ ン

グの制御 のみな らず､様々な農学的観点か らも大きな意義 を持つ ことになる｡

高等植物では､エチ レンは メチオニ ン‑

S‑

( SAM)

1‑

( ACC)

( Ya nge ta

1 984

SA

ACC

ACC

S‑ a de nos yl ‑ L‑ me

i oni n e me t ^h yl t hi oa de nos i ne ‑

ya s

,EC4. 4. 1. 14

ACC

ACC

関与 しているが､

ACC

ACC

ACC

ACC

ACC

( ACS)

1 989

Sa t oe ta

.( 1 989)

ACS

( 01 s one ta

.1991,Rot t ma nne ta

.1 991)

( Ky e ta

‑ 1 I

1 992)

Li a nge ta l .1 992

Va nDe rSt r a e t e ne ta l .1 992)で分子 レベルの解

ACS

ACS

ACS

ACC合成酵素遺伝子 の発現 をアンチセ ンス R NA

( Oe l l e re ta l .1 991 )､ ク リマクテ リック 型果実 とエチ レンの関係

そ こで本研究では､アンチセ ンス 核酸工学 (横 山

1 994)

ACS

ACS

c DNA

( Do nge ta l .1 991;

Ay‑ Ye ea nd Kni ght on1 995)が報告 されて いるが､ACS

ACC合成酵素遺

の存在 とそれ らの特徴 について得 られた知見 を報告す る^｡

l l . リンゴ ACS 遺伝子族 の構成比較

ACS

( Li nc ol ne ta

.1 993)

( Hua nge ta

.1 991 )

ス

( Abe le ta

･1 995)

( Za r e mbi ns kia nd

he ol ogi s1 993)

ACS

とか ら

( Kondoe ta

.1 991 )

1 98 5)

ACC合成酵素は エチ レンの生合成 を司る重要な酵素であ り､品種 によ り

ACS

DNA

RFLP分析 を行

材 料 お よび方 法 1.供試材料

リンゴ栽培種 (M

a l u sd o me s t l ' c a L.Bor kh)1 4

( M.hu pe he DS l ' s Re hde r )

ら分譲 して頂 いた｡

2.DNA

Va r a da r a j a ne ta

.( 1 991 )の方法 に従 って成葉 よ り調製 した｡すなわち 1g

( 1 00mM Tr i s ‑ HClpH8. 0

C

1 % 2

‑}ルカプ トエタノール､1

. 6 % SDS)

1 5

85 ℃

⁵

5, 000 r pm

孤 )

2 0

8 5℃

1 0

4℃､14, 500r pmで 20

TE ( 50

MTr i s ‑ HCI pH8. 0

0mMEDTA)

4, 500 r pm

1 0

4, 500 r pm

1

TE ( 1 0mM Tr i s ‑ HC

‑ 3‑

mM EDTA)緩衝液 に溶解後 ､Cs C1 2 ‑ Et Br

DNA

3.PCR反応および増幅断片のクローニ ング

リンゴ

ACS

c DNA

( Donge ta l ･1 991)

DNA

PCR反応 を行 った｡ すなわち､1 0ng

25〟

PCR反応液 ( 1 0

M Tr i s ‑ HCIpH8･ 9

5mM MgC1 2

00L LM dNTPs

25〟M

0. 625Uni t sTt

DNAポ リメラーゼ) 中で､94℃

50℃､1

72℃

ACS

DNA

TA

I n vi t r oge n)

pCRTM

C1 2

ょ り大腸菌 に導入 して クロー ン化 を行 ったo

4.

クロー ン 化 した増幅

DNA

oRe a dSe que nc i ngK it ( Pha r ma c i aBi o t e c h)

AL･ F･ DNASe que nc e r

( Pha ‑ a c i d Bi ot e c h)

na ge r TM ( Ve r s i on 2･ 21 Pha r ma c i aBi ot e c h)

5.RFLP

1 0〟g

DNA

50uni t s

1 00ul

0･ 5

0･ 8

6Vで 1 8

( 0･ 4 M Na OH)

DNA

( Hy bond‑

N+)上に固定 した｡次にクロー ン化 した増幅 DNA

ECLdi r e c tn uc l e i ca c i dl a be l l i nga nd de t e c t i o ns ys t e m ( A me r s ha m)

ションに当たっては､フィル ター をあ らか じめ

ECLd i r e c tnu c l e i ca c i dl a be l l ‑ i nga ndd e t e c t i o n s ys t e m

42℃

らに

1 2

6M

0･ 4 % sDS

× SSC

42℃

2 0

2

2 × SSCで室温･ 5

間ずつ

2

pe rf i l m

1

結果お よび考察

1.PCR法 による リンゴ ACS

pcR法 によ りACS

ACC合成酵素の c DNA

( Donge ta

･1 991)がすでに報告 されて

いることか ら､その配列 を基 に遺伝子特異的なプライマー を合成 した｡セ ンスプライマー には

c DNA

64bp‑8 3bp

[ 5' ‑ TACCATGAGGTCCTCAACAC‑ 3' ]

324bp‑305bpまでの相補配列 [ 5' ‑ GGTGAGCACTAAGTGG

rGG

‑ 3'

PCR反応を行 った ところ､51 4bpの DNA

( Fi g.1 )

DNAの大 きさが予想 され るサイズ ( 261bp)

2

DNA上にはない未知の

1 21bpあ り､c DNA

1 20bp目と 1 21bp目の間に､ も

う

1

1 32bp

DNA

253bp

これ らの境界 にはスプライス部位 の共通配列

( 5' J GTイ ン トロン AGJ3' )が存在 してい

2

ト

( Li nc ol ne ta

.1 993)

Hua nge ta

.1 991 )

Ab e le ta

.1 995)

( Za r e mbi ns kia ndThe ol ogi s1 993)

も裏付 け られる^｡

また､塩基配列 を決定 した結果､増幅

DNA

Do nge ta

.( 1 991)

c DNAの塩基配列 との間に 2

DNAの 274 bp目が Aであるのに対 し､我 々の結果では Gであった｡ これ はコ ドンの 1

る塩基であ り､uni

ve r s a l c ode

Dong ( 1 991 )

ACC合成酵

( Donge ta

.1 991 )､我々の結

c DNAの 278bp目が T

C

Dongetal . ( 1 991 )

の読み とりミス と考 えていたが､I

Ay‑ Ye ea ndKni ght o n( 1 995)

c DNAの配列 と我々

DNA

ACS

DNA

して用 いた｡

2.RFLP分析

‑ 5 ‑

リンゴ

ACS

1 4

1

( Ta bl el )

DNA

RF LP

PCR

ACS

51 4b p)である

Fi g.2.

Ta bl el

RF LP

Ta bl e1.Re s t r i c t i onf r a gme ntl e ngt hpol ymor phi s msde t e c t e di na ppl ec ul t i va r sa nd onewi l ds pe c i e s . Fr a gme nts i z e sa r ei ndi c a t e di nkbp.

Cul t i va r s De t e c t e df r a gme nt skbp

p

^of a nds pe c i e s 9･ 8 6･ 6 4･ 0 3･ 5 3･ 3 b

^at

er

M D o me sl J ' c a l n d o Ori n

J o n at ha n

G ol d e nDel i ci o u s St a r ki n gDel i ci o u s G o r d e nMel o n

T s u g a r u D el i ci o u s T o k o

W hi t eWi nt erp e a r mai n M ut s u

R al l sJ a n et S e ns yu Fuj i

M h u pe h e D S i s

I I I I I I l I I I I I I I V l I l I I I I I I I I I I I l I I

Hi n d

RFLP

3. 3kb

Ty pe

3. 3kb

3. 5kb

王林 ､

7

Ty pe

3. 5kb

3

Ty pe

4. Okbの バ ン ドが検 出され るもの ( M･hu pe he DS I s; Ty pel V)

4

Fi g.3

b l el )

さらに､ これ らの

RFLP

Ty pe

Ty pe

Type H

そ こで

Ty pe

に Ty pe

度 'を掛 け合わせた品種 ̀甘錦 'につ いて も同様 にゲ ノミックサザ ン 分析 を行 った とこ ろ､ ̀甘錦 'は

Ty pe

( Fi g.3)｡ この結果か ら､Ty pe

Ty pe

Ty pe

RFLPは Ty pe

pe

2

( Ty pe

また､野生種 の

M･hu pe he DS l ' S

Ty pe

3. 3kb

ACS

最後 に､ これ らの多型 と貯蔵性 との関係について も検討 したが､た とえば貯蔵性が

1

RFLPのみで品種間の貯蔵性の差 を説

今後 はさ らに多 くの栽培品種および野生種 を供試す ると同時 に､複数の制限酵素を用 いたよ り詳細な

RFLP分析 を行 う必要がある｡

‑ 7‑

日 . リンゴ ACS 遺伝子 を含む 入 ファー ジクロー ン の解析

ACS 遺伝子 は多重遺伝子族 を構成 してお り､ これ まで に トマ トで 6 つ ( Rot t ma nne t a

.1 991 ; Mor ia ndl ma s e ki 1 99 4) カボチ ャで 2 つ ( Hua nge ta

.1 991) ､ア ラ ビ ドピシス で 5 つ ( Li a n ge ta l . 1 992) ､イネで 3 つ ( Za r e mbi ns kia nd T he ol ogi s 1 993) の遺伝子 が ある と報 告 されて いる｡一方 ､ リンゴで は ライ ブニ ング時 に発現す る遺伝子 ( hy‑ Ye ea nd

ni gh t o n 1 9 95; Ros e nf i e l de ta

.1 996) と､オーキ シン によ り誘導 され る遺伝子 ( Donge ta

.1 991

m e t a

.1 992) の 2 つが報告 されて いるのみで､遺伝子族 の構 成 に関 して の知見 はほ と ん ど得 られて いな い｡

また､前述 したよ うに､ リンゴ 栽培 品種 間お よび種 間で ACS 遺伝子 領域 の一部 をプ ロー ブ に用 いた場合 RFLPが検 出 されたが､ この成 因の特 定や ､実 際 これ らの構造変 異 が ACC合成酵 素 の機能やそ の遺伝子発現 に及 ぼす影響 を知 るた め には､個 々の ACS 遺伝 子 の構造解 析 が必要で ある｡ また､将来 ､エチ レン 生成 を司 る ACS 遺伝子 の ア ンチセ ン スN A を ライ ブニ ング 時 のみ発現 させ る ことによ って 同酵 素遺伝子 の働 き を抑制 し､

長期保存 の可能 な リンゴ果実 を作 出す るため には､ トマ トの場合 と同様 に ライ ブニ ング 時 に発現す る ACS 遺伝子 を単離 し､そ の プ ロモー ター領域 を含 む遺伝子全領域 を詳細 に 解 析す る必要が ある｡ しか しなが ら､ リンゴ の場合 ライ ブニ ング時 に発現す る同酵 素遺 伝子 の c DNA配列 は 3 種報告 されて いる ものの ( I Ay‑ Ye ea nd

ni ght on 1 995; Ros e nf i e l de ta

1 996) ､プ ロモー ター領域 を含 む遺伝子 全領域 につ いて は全 く知見 が得 られて いな いのが 現 状で ある｡

したが って ､ これ らの解 析 を行 う上で リンゴ の ACS 遺 伝子族 を構成す る個 々の遺伝子 全領域 の ク ロー ン化 な らび に塩基配列 レベル の解 析が必要 とな って くる

そ こで､ リン ゴACS 遺伝子族 を構成す る個 々の遺伝子 全領域 を ク ロー ン化す る 目的で ､栽培 品種

̀ ゴールデ ンデ リシャス 'を用 いて ゲ ノミ ックサザ ン解析 を行 い､ リンゴ ACC合成酵 素 遺伝子族 の構 成 を明 らか に した｡ さ らに､ゲ ノミ ック ライ ブ ラ リー を作製 し､そ こか ら同 酵素遺伝子族 の遺伝子 を含 む 入フ ァー ジクロー ンをス ク リーニ ング して個 々の遺伝子 ク

ロー ンを単離 し､制限酵 素地 図 によ る構 造解 析 を行 った｡

材料および方法

1.供試材料

本実験 には栽培 品種 ̀ゴールデ ンデ リシャス 'を供試 した｡ゲ ノミ ックDNA の調製お よび ゲ ノミ ックサザ ン解 析 は､ I lに述 べた方 法 によった｡

2. ゲ ノミック ライ ブ ラ リー の構築お よびス ク リー ニ ング

ゲ ノミック DNA を制 限酵 素 Sa u3 A

で部分分解 した後 ､パ ー シャル フィルイ ン 処理 を し､ 入 FI X ‖/ Xho

Pa r t i a lf i l 1 ‑ i nVe c t orK it( STRATAGENE) の 入 FI X

lベ クター 中の Xho

サイ トに連結 した｡Gi ga pa c k

Gol dPa c ka gi ngEx t r a c t( STRATAGENE) を用 いて パ ッケイ ジ ング 後 ､大腸 菌 XL 1 ‑ Bl ue M RA ( P2)株 に感染 させ ､NZYMM 培地 ( 1 % NZ ア ミン､0. 5 % 酵母抽 出液 ､0. 5 % Na C l ､1 0mM Mg S O4 ､0. 2 % マル トース) を用 いて ､ 37℃ ､一晩培養 しプ ラー ク を形成 させ た｡ プ ラー ク を ナイ ロンメ ンブ レン上 に プ ロ ッ

トし､ メンブ ランを アル カ リ変性液 ( 0. 5M Na OH ､1 . 5M Na C l )で変性処理後 ､ 中和処 理 を施 し､8 0℃ ､2 時 間ベーキ ング を行 った｡次 に前章 に述べ た方 法 によ って ク ロー ン 化 した増幅 DNA を DI GDNAhbe l l i nga ndDe t e c t i o nK it( Boe h r i nge rMa n n he i mBi o c he m ic a)

を用 いて標識 し､DNA プ ロー ブ とした｡ プ ラー クハ イプ リダイゼイ シ ョン は､ メ ンブ ラ ン をあ らか じめ ハ イ ブ リダイゼー シ ョン 緩衝液 ( 30 % ホルム ア ミ ド､5× SSC ､2×ブ ロッキ ング 溶液 ､0. 1 % L う ク リルザ ル コシ ン酸 ､0. 02 % SDS) 中で､42℃ ､1 時 間保温 した後 ､ DNA プ ロー ブ を加 え､ さ らに 1 2 時 間保温 した｡ 1 回 目のス ク リーニ ング で は ハイ ブ リダイゼー シ ョン 後 ､ メンブ ランを 2× SSC と 0. 1 % SDS の混合液 で室温 ､5 分 間ずつ 2 回洗 浄 し､ さ らに 0. 1× SSC と 0. 1 % SDSの混合液で 68℃ ､1 5 分 間ず つ 2 回洗 浄 した｡2 回 目のス ク リー ニ ング で は､2× SSC と 0. 1 % SDSの混合液 で室温 ､5 分 間ず つ 2 回洗浄 し､ さ らに 0. 2× SSC と 0. 1 % SDSの混合液で室温 ､5 分 間ず つ 2 回､ 0. 1×

SSC と 0. 1 % SDSの混合液 で 42℃ ､1 5 分 間ず つ 2 回洗浄 した｡洗浄後 ､発光 反応 を行 い､

Hype rf i l m 上でそれぞれ 2 時 間感光 させ た｡

3. フ ァー ジ DNA の調製

ス ク リー ニ ングによ り得 られた フ ァー ジ を大腸 菌 XL1 ‑ Bl ue

A ( P2)株 に感染 させ ､ NZYM ( NZY ､1 0mM MgSO4) 液体 培地 中で､37℃､8‑ 1 2 時 間振 とう培養 した｡Na Cl

( 終濃度 1M ) とク ロロホルム を加 え､ さ らに 1 0 分間振 とう培養 した後 ､1 0, 000 ^r pm で 1 0 分間遠心 し､上清 に ポ リエチ レング リコール ( 終濃度 1 0 %) を加 え､1 時間氷 冷 した｡

‑ 9 ‑

1 2, 000 r pm

20

( 50

M Tr i s ‑ HC1

0mM Na C

1 0mM MgC 1 2)

2

STE ( 8 0

MTr i s ‑ HCIpH7･ 5

K

1m

/ ml )

℃､1

5

4.

ファージDNAとプラス ミ ド

Bl ue s c r i pt KS

切断 したプラス ミ ドについてはあ らか じめ アルカ リフォスフアタ‑ゼ

( BAP)

5‑

末端 を脱 リン 酸化処理 した｡次 にファージ

DNAの制限酵素断片 とプラスミ ドDNA

DNAuga t i onKi t( Ta Ka Ra )

1 6℃､一晩連結反応 を行 った後､被感染能 を賦与 し

J M1 09

c o l iPul s e r( BI O‑ RAD)

2 ×Y

. 6

酵母抽出液､

0. 5%Na Cl )

37℃

50L

/ ml )

Ga l(

200L

/ ml )

PTG

200L

/ ml )

2

×Y

( 2 ×Y

8

37℃

5.

白色 コロニーを

2 × Y

50L Lg / ml

37℃

000 r p m

5

( 50

i s ‑ HClpH8. 0

0mM EDTA)で懸濁 した｡2

SDS

( 0. 2M Na OH

( pH4. 8)溶液で中和後､氷 中でさらに 1 0

1 5, 000 r pm

1 5

‑ 2 0℃

2 0

5, 000 r pm

1 5

T

C1 2 ‑ Et Br

DNA

結果 お よび考 察

1.ゲ ノミックサザ ン解析

リンゴ

ACS

シャス'の成葉か ら調製 した ゲ ノミックDNAを

5

( Bg川

0R

E0 0RV､Hi ndl l l

c

RFLP

ACS

その結果､Hi

ndH

9. 8

6. 6

5

3. 3kb

4

Bgll l

5. 0

0. 5

2kb

3

0R l

3. 7

0

5kb

3

0RV

1 0. 5

8

8

5kbの 4

cl

2 1 . 0

Okb

2

( Fi g.4)

DNA塩基配列上にはこ

ACS

4

ACS

( Rot t ma nne ta

.1 991 )や

( Li a nge ta l .1 992)な どで明 らかにされている

いることが示唆されただけでな く､今 まで リンゴで報告 されているライブニ ング 時に発 現す るもの

( Do ng et a

.1 991 )

K im et a

.1 99 2)の他

ACS

2. ACS

ゲ ノミックサザ ン 解析の結果､ リンゴ

ACS

4

ACS

ACS

5. 0

1 05

6

AP1 ‑ 1

人AP

‑ 2

AP1 ‑ 5

AP2‑ 2

AP2‑ 4

AP31 2

これ らの 入ファージクロー ンについて制限酵素の

Apa

AP1 ‑ 1

AP1 ‑ 2

AP1 ‑ 5

AP2‑ 2

AP2‑ 4

AP3‑ 2

Fi g.5)

AP2‑ 4と 入 AP3‑ 2

APl ‑ 2と 入 AP2‑ 2

ACS

AP l ‑ 2と 入 AP2 ‑ 2

‑ F ) F iL

は遺伝子の全商域 を含んでいる可能性が高いと判断 された｡

さ らに､ 入

AP2‑ 4

AP3‑ 2

低 ス トリンジェンシー条件下で もう一度 スク リーニ ング を行 った｡その結果､さらに

7

AP1 ‑ 6

人

AP2‑ 1

AP21 3

AP2‑ 5

AP3‑ 3

AP41

AP5‑ 2と命名 した)

AP1 ‑ 2と 入 AP21 2

Ec oR

Hi nd

AP1 1 6と 入 AP2‑ 5

AP4‑ 1

AP1 ‑ 2

AP2‑ 2と異なる シグナルが得 られた.そ こで これ らの 入ファー ジクロー

Apa

AP1 ‑ 6

人AP3‑ 2と同一の制限酵素部位がマ ップ

A P1 ‑ 6

( Fi g.5)

AP2‑ 5

AP4‑ 1

ファー ジクロー ンとは異なる制限酵素部位 を有 していたが､遺伝子商域 は末端部 に位置 し ていた｡

( Fi g.5)

2

ACS

6

ノム領域 を クロー ン化できた.

次 に､ ライブニ ング 時 に発現す る

ACS

6

AP1 ‑ 2と 入AP 1 ‑ 6

AP2‑ 2

8. Okbの Apal断片 をそれぞれサ ブクローニ ングし (

pAP1 1 2

‑ 6

2と命名)､c DNA上 に サイ トが存在す る Ec oR

ndl l l

Sa c

lを用 いて制限酵素地図を作製 した

( Fi g.6)

AP1 ‑ 2

AP1 ‑ 6

c DNA

2

DNA上 に存在す

る

Xhol､Ec oR

ndl l l

Sa clの制限酵素 サイ トの うち､Xholおよび E0 0R l

Hi ndH

Sa cl

5'

pAPl ‑ 2と同

( Fi g.6)

pAP21 2

ACS

また､ これ らの クロー ンについて制限酵素地図を作製 した結果､前述 した､栽培品種 間に見 られた

ACS

Hi ndH

‑ 2

‑ 6

p AP2‑ 2

DNA

Hi nd

3. 5k b

3k b

6kb

APl ‑ 2

pAP1 ‑ 6

AP1 ‑ 6

E0 0R

Hi nd

p APl ‑ 2

2 0 0bp

ことがわかった

( Fi g. 3)

この相違が遺伝子の発現 にどのような影響 を及 ぼしているのか興味が持たれた｡

今後 は､遺伝子族 を構成す る個々の遺伝子の全商域 を完全 に含む 入ファージクローン を全て単離 し､塩基配列の解析 を行 うことによって､個 々の遺伝子の発現 について も解析 を行 う必要がある｡

‑1 3‑

Ⅳ. リンゴライ ブニ ング型ACS 遺伝子 の塩基配列

前章で明 らか にされた リンゴ

ACS

ACS

c DNA配列 と一部の制限酵素認識部位および塩基配列が一致す るクロー ン DNAを得ることが出来た｡ また､興味あることに､ リンゴ栽培種 には対立遺伝子 と考 え

2

ACS

3グ

ミックライブラリーか らACSを含む

2

pAP1 ‑ 6

c DNA

‑ 2

Sa c I

Xho

‑ 6に比べて約 200 bpほど長いことが確認 された｡既報の ACSc DNA

1 6

c DNA

ACS

5'

遺伝子ファミリー間の機能分担機構 についての知見が得 られると同時に､ ライブニ ング時 に特異的に機能す るプロモーターが得 られる可能性があ り､ これを使用 しての､ライブニ ングに関わる基礎 と応用の様々な研究 に有効利用 されることが出来よう^｡ そ こで､ これ ら

2

ACS

実験材料及び方法

1.実験材料

リンゴ栽培種

( Ma l u sdo me s t l ' c a L. Bor kh)

2

‑ 2および pAP1 ‑ 6を用 い

2.

PAP1 ‑ 2

pAP1 ‑ 6

Ec oR l

Hl ' Dd T H

0. 8% のアガロースゲルで

‑ 2

3. 5k b 肋 d H

PAP1 ‑ 6

3. 3kb 肋 d H

. 5kbと 2. Okb

Ec o R l

Aq ui c kGe lExt r a c t i o n K

it ( QI AGEN)

pBl ue s c r i pt"KS

Ec oR

Hl ' Dd"l

DNALi ga t i onK it ( Ta ka

a

1 6℃

SOC液体培地 ( 2%

5%

0 mM Na C

2. 5mM KC

0 mM MgC 1 2

0 mM MgS O4

2 0 mM

37℃

50〃 ′ g / ml )

Ga l

′ g / ml )

PTG(

00〃′

a/

LB

. 0%

5%

. 0% Na C

8%

37℃

3.

白色コロニーを

LB液体培地 (

′ g / m

37℃

000 r pm

d iPl a s mi dpu r i f i c a t i on( QI AGEN)

4.

制限酵素で切断 したプラスミ ド

DNA

DNA

Exo nuc l e a s e

buf fe r( 5 0mM Tr i s ‑ HCIpH8. 0

00 mM Na C

5 mM MgC 1 2

0 mM 2‑

nu c l e a s e

37℃

50

0

MungBe a nnu c l e a s e buf f e r( 3 0 mM

pH4. 5

00mM Na Cl

mM ZnCl 2

0%グリセ ロール)に入

1 0

5

ngBe a nnu c l e a s e

℃､

1

この

DNA

l e nowbuf f e r( 7 mM Tr i s ‑ HCIpH8･ 0

1 mM EDTA

20 mM Na C

mM MgCl 2

0. 1 mM d NTP)

l e now

1 5

5.

目的のプラス ミ ドが導入 された大腸菌を

LB液体培地(

′ g / ml

37℃

000 r pm

5

TEG( 2 5mM Tr i s ‑ HCIpH8･ 0

0 mM EDTA

0 mM

TEG ( 1 0mg/

SDS

( 0･ 2NNa OH

3M

pH4. 5)

0, 000 r pm l O

11 5‑

イ ソプ ロパ ノール を加 えて､ ‑ 20℃ に 20 分 間､ 1 5, 000 r pm l O 分 間遠心 によ りプラス ミ ド DNA を沈殿 させたO これ を TEbuf f e r( 1 0 mM Tr i s ‑ HC18･ 0 ､ 1 mM EDTA) に溶解 し､ RNa s e ( 0. 1 mg/ ml ) で 37℃ 30 分間 RNA を分解 した後 ､ フェ ノールー クロロフォルム処理 して､上 層 を回収 し､エタ ノール沈殿 による DNA を TEbuf f e r に溶解 した.

6. シー クエ ンス反応

プ ラス ミ ド DNA は､ Se qui T he r mT MCy c l eSe que nc i ngK it ‑ LC( f orLI I CORSe qu e nc i ng ) ( Epi c e nt e rTe c hnol ogi e s ) を用 いて シー クエ ンス反応 させた｡反応物 を DNAs e que nc e rMode l 4 000

･ ( LLCOR) によって読 み とった後､ Ba s eI ma geI RSof t wa r eVe r s i on2. 1 0( LI ‑ COR) を用 い て解析 を行 った｡

括 果 お よび考 集

p AP1 ‑ 2 および pAP1 ‑ 6 をサ ブクローニ ング とデ リー シ ョンを行 い､ Hl ' Dd"J 部位 か ら

t o R

認識部位 間 をシー クエ ンス した.そ の結果 ､ pAP1 ‑ 2 では 5, 676b p ､ p AP1 1 6 では 5, 526bp の塩基配列 を決定す る ことが出来た ( Fi g. 7) ｡

p AP1 1 6 は 4 つのエキ ソンか らな る 1 41 9 bp の コー ド領域 をもってお り､既報 の ライ ブニ ング型 c DNA(

Ay‑ Ye ee ta l .1 99 5) と完全 に一致 した. また､エキ ソ ンの数 とサイズ､ さ ら に､イ ン トロンの位 置 は トマ ト､イネ､ア ラビ ドプ シスの ACS 遺伝子 と類似 して いた ( Fi g.8 ) ｡

一方 ､ p APl ‑ 2 は p AP1 ‑ 6 とほ とん ど同 じ塩基配列 を示 した. しか し､ コー ド領域で は 7 箇所 の塩基置換が存在 し､塩基配列か ら予想 され る翻訳 ア ミノ酸配列で は､1箇所 のみに 違 いがみ られただ けで あった｡ また､ 1 ‑ 2 型 5‑ 隣接領域 には､ 1 ‑ 6 型 に比べて転写 開始点 よ り 一 781bp の位置 に 1 62bp の挿入配列が認 め られた ことか ら､前章で観察 された､ 助 d

H 分解後 の RFLP ( 3. 3kb と 3. 5kb) は､ この挿入配列が起 因 して いる ことが判明 した｡

リンゴ栽培品種 の RFLP 分析で は ACS 遺伝子 は 1 ‑ 2 型 ､ 1 ‑ 6 型 のそれぞれ をホモで もつ 品種 とヘテ ロで もつ品種 の 3 タイ プに分類 され る ことが示 され､ さ らに､ホモ型 同士 の交 雑実生 はヘテ ロ型 とな る ことか ら､ この 2 種 の ACS 遺伝子 は対立遺伝子の関係 にあると 考 え られた｡今 回の塩基配列決定 よ り､ これ らの遺伝子 が コー ドす る ACS のア ミノ酸配 列 は 99. 8% の相 同性 を有す る点や､ また､両遺伝子 の隣接領域間で も約 96% の相 同性 を 示 した ことか ら､対立遺伝子 の関係 にある ことが裏付 け られた｡

対立遺伝子間の最大 の違 いは前述 の 1 62bp の挿入配列 の存否で あるので､ この配列の

両隣接領域 にプライマー を設定 して､ PCR を行 うことで､その増幅産物 のサイズか ら､

どち らの遺伝子 を有 しているかを判断できる^｡ そ こで､

M. pr u Dl ' f o l l ' a

Mha DS l ' E O T l a

M. s l ' e bo l d l '

M. s l ' kk l ' me DS l '

M. a s l ' a t 1 ' c a

1 ‑ 6

‑ 6

こった ことで

1 ‑ 2

この挿入配列の両端 には 6

塩基

A

SI NE( s h o r t i n t e r s p e r s e dr e p e t i t i v ee l e me n t )

PCR

DNA

ゴゲ ノム上に同配列が多数存在することが判明 し､ この挿入配列は

S I NE

SI NE

1 99 5)

( Mo c h i z u k i e t a l .1 991; U me d ae t a l ･1 991 )

SI NE

この トランスポゾンが どのようにリンゴの変異性 に関わっているかな ど､多 くの観点か ら 興味が もたれる^｡

前述の様 に､既報の

c DNA

1 ‑ 6

‑ 2

mRNA

RT‑ PCR

c DNA

Xh oI

PCR

Xh oI

1 ‑ 6

‑ 2

1 ‑ 2

1 ‑ 6

最後 に､

^5'

( c i s ‑ a c t i n gr e g u l a t o r ye l e me n t )

Fi g. 9

1 0

DNA

以上の様 に､本研究の最終 目的である組換え リンゴの作出のための遺伝子 とそのプロ モーター領域 を得 る ことが出来た｡今後 は､上述の遺伝子そのものの特徴ずけを行 うと伴 に､アグロバクテ リウム法による リンゴの形質転換 を本格的に進める予定である｡

‑1 7‑

V. おわ りに

エチ レンは他の植物ホルモ ンと同様､植物の生長や分化 の様々な過程 に関わ っている^｡ すなわち､種子 の発芽か ら落花､落葉そ して老化 まで と植物の一生を通 してエチ レンは機 能 している^｡ この うち､果実の成熟作用は､植物ホルモ ンとしてのエチ レンの発見 に結び ついたほど､古 くか ら知 られた現象であった｡また､果実 は経済的価値が高い ことか ら､

貯蔵や輸送においての品質劣化の防止策の研究が活発 に行われ､その結果､エチ レンの影 響 を減少 させ るべき種々の貯蔵法が試み られ､CAな どの優れた方法が開発 され るに至 っ た｡

エチ レンは最 も簡単な有機化合物であることか ら､オーキシンや ジベ レリンな どに見 られる糖結合 による貯蔵型 (不活性型) を持たない｡ このため､生合成経路 の活性化 は細 胞内のエチ レン量 に直接反映す ることになる｡そ こで､生合成系の律速酵素である

ACS

ACS

一方､アラビ ドプシスのエチ レンに対す るの様 々な トリプル レスポ ンス変異体か ら､

エチ レン トランスダクション系 に関わる遺伝子が順次単離 され､ この数年間で､エチ レン 受容体 (レセプター)蛋 白質や各種

MA

0

のはエチ レン系である^｡

エチ レンはライブニ ングに代表 されるように植物 の生育段階の節 目に作用す ることか ら､エチ レン量 を適切 に調節することで､作物 に大 きな農業的価値 を付与する ことが可能 であろう^｡ 例えば､エチ レン合成系を抑制す ることで､花の萎凋や落花 を妨げる実験は各 国で精 力的に進め られてお り､近い将来､従来の2倍や

3

PI N ( Pr o t e i n a s ei 血i b i t o r )