博士（薬学）東 敦 学，位論文題名
抗 腫 瘍 活 性 を 持 つ 新 規 ヌ ク レ オ シ ド ， 2 ′ ― く ） ― cyano ― 2 ′ ― deoxy ― 1 ―ロ − D‑
arabinofuranosylcytosine(CNDAC) の 作 用 機 序
学 位論文内容の要旨
現 在 急 性 白 血 病 薬 と し て 臨 床 的 に 応 用 さ れ てい るAra‑Cを母 化 合物 に、 ヌク レ オシ ド自 体 は 化 学 的 に 安 定 で あ る が 、 生 体 内 で 代 謝 さ れDNAやRNAに 取 り 込 ま れ た 時に 反 応性 を発 揮 す る 化 合 物 の 分 子 設 計 を 目 指 し た 。
1．CNDACの 分 子 設 計 と 合 成
2．‑Deoxycytidineの2．‐グ位に強い電子吸引基を導入すると2．．ロプロトンの酸性度が増す こ と が 予 想 さ れ る 。 こ の 誘 導 体 がAra‑Cと 同 様 の 経 路 でDNAに 取 り 込 ま れ た時 、隣 接す る り ン酸 基の 酸素 原 子や 他の 求核 分子 の攻撃に よる2．‐ロプロ卜ンの引き 抜き、続いてロ脱離 に よ りDNA鎖 切 断 が 起 こ る の で は な ぃ か と 考 え た 。 そ こ で こ のDNA鎖 切 断 仮説 を実 現す る 化合物として 、筆者は電子吸引基としてシ アノ基を導入した2．‑ C‑cyano・2．‑deoxy‑l‑グ‑D‑
arabinofuranosylc ytosine(C NDAC） をデ ザイ ンし た。 そ の合成はシチ ジンから容易に得ら れ るN4̲ア セチ ルシ チジ ンの2． −ケ ト体を出 発原料とし、シアノヒドリ ン体に変換した後、3 級 水 酸 基 を フ ェ ノ キ シ チ オ カ ル ボ ニ ル 化 し 、 次 い で ラ ジ カ ル 還 元 を 行 い 更に 脱保 護し て CNDACを塩酸塩 として高収率で得た。
2．CNDACの化 学的安定性
CNDACを 塩 基性 条件 下で37℃に 加温 して その 安 定性 を検 討し たと こ ろ、2． ．ロ シア ノ基 が反 転し た2．‑ C‑cyano‐2．‑deoxycytidine(CNDC)と、グリ コシル結合が開裂した時の 産物 で あ る シ 卜 シ ン と グ リ カ ― ル 体 の3種 の 化 合 物 の 生 成 が 見 ら れ た 。 こ れ ら の 化 合 物 は、
CNDACの酸 性 度が 高ま って い る2． ．ロ プ ロト ンが 塩基 に より 引き 抜か れる こ とで 生成 した と 考 え ら れ た 。 ま た こ の 時CNDACとCNDCの 間 に は 平 衡 が 成 立 し 、 グ リ コ シ ル 結 合 の 開 裂 は 両化 合物 にお ぃ てー 定速 度で ゆっ く りと 起こ るこ と をシ ュミ レ― ショ ン によ り証 明し た。
3. CNDACの抗 腫瘍 活 性
CNDACはin vitroに お ぃ て 強 い 細 胞 増 殖 抑 制 活 性を 示 し、 その 抗癌 ス ペク トル はAra‑C と は 異 な る こ と が 明 か と なっ た。 ま たin vivoに おぃ ても 、マ ウ ス白 血病 細胞P388に 対し てCNDACを20mg/kg、1日1回10日 間 連 続ip投 与 し た と ころ 、延 命 率（T/C値） が600％ 以上 とぃ う値 を示 した(Ara‑CのT/C値 は225％ ）。 また ヌー ド マウ スに 移植 した ヒ 卜胃 癌St‑4細 胞 に 対 し て も 、CNDACを67.5mg/kg、5日 間 連 続 投 与 、2日 間 連 休 の ス ケ ジ ュ ― ル で 繰 り
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返レ経口投与したところ、担癌ヌードマウス5匹中5匹に癌細胞が観察されなくなった。ま たCNDCの培地中で殆どシアノ基が反転しなぃ短時間接触(20分）でその細胞増殖抑制活性 はCNDACの約1/20であ り、またin vivoでも殆ど抗腫瘍活性を示さ なぃため、CNDC自体 には殆ど抗腫瘍活性はなぃことが示唆された。
4．CNDACの作用機序
CNDACのDNA、RNA、蛋 白質 の高 分子 合成 に与 え る影 響を 癌細 胞(col0 320DM)を 用い て 検 討 し た と こ ろ 、Ara‑Cと 同 様 にCNDACはDNA合 成 を阻 害す るだ けで なく 、同 時に RNA合 成も 阻害 する とぃ う特 異的 な挙 動を 示し た 。ま たCNDACはG2/M期で細胞周 期を停 止さ せる とぃ う核 酸 系代 謝拮抗剤としては特異的な 挙動を示した。次にCNDACの 細胞内 代謝を検討するため【'4Cl̲CN DACをKB細胞に添加して代謝物を調べたところ、1 Cで標識 されたCNDACの5｜‐モノ、ジ、卜リリン酸体の生成が確認された。更に癌細胞（KB細胞）に 対してCNDACと種々の天然型ヌクレオシドを併用して細胞増殖抑制活性を調べたところ、
2．‑deoxycytidineと併用した時に最も増殖抑制活性が減弱したことから、CNDACはAra‑C と同様にdeoxycytidine kinaseによルリン酸化を受けることが明かとなった。【1 C]‑
CNDACを癌細胞(col0 320DM）に添加した後、細胞からDNA、RNA画分を抽出したと ころ、
【14C]̲CNDACはDNA画分 から 検出 され 、CNDAC自 体はDNA分 子中 に取 り込 まれ たこ とが 明かになった。これらの結果より、CNDACはAra‑Cと同じ代謝経路で、5．卜リリン酸体に 代謝され、さらにDNA分子中に取り込まれることが示 唆された。―方、Ara‑Cの分 解酵素 であるcytidine deaminaseによる脱ア ミノ化の受けやすさついて調べたところ、シチジン (Km=0.22mM） が脱 ア ミノ 化を受ける速度を1とすると、Ara‑C(Km=0.35mM）は0.4である のに 対し 、CNDAC（Km=l.OmM)は0.05と なり 、CNDACが 脱ア ミノ 化を 受け る速 度はAra‑
Cの1/8であることが明かになった。
5. CNDACTPのDNA polymerase、RNA poiymeraseに対する挙動
ま ずCNDACのRNA合 成 阻 害 の 機 構 を 検 討す る目 的でCNDACのRNA polymeraseに対 す る挙動を検討した。CNDACの5．卜リリン酸体（CNDACTP）を合成し、モデル実験としてT7 プロ モ― タ― を持 っプ ラス ミド をテ ンプ レ ートとしてT7 RNA polymeraseのCTPの取り 込み の阻 害を 調べ たと ころ 、CNDACTPはT7 RNA polymeraseに対して阻害活性を示し、
その 阻害 様式 はCTPに対 する 競合 阻害 であ った（Ki=250メM）。CNDACのDNA合成阻害の 機構を検討する目的でのDNA polymeraseロ(polロ ）に対する挙動を検討した。活性化DNA を テ ン プ レ ― ト ・ プ ラ イ マ ー と し てpolロのdNTPの取 り込 み阻 害を 調べ たと ころ 、 CNDACTPはAraCTPより 強いpolロ に対 する 阻害 剤で あり 、そ の阻 害様 式はdCTPに対 す る競合阻害であった（Ki=0.16メM）。更に短鎖DNA(lOmer)をプライマーとしてpolばによ りDNA鎖 伸長 反 応を 行い 、変 性ゲ ル電 気泳 動により鎖伸長を観察した。CNDACTPはAra‑
CTPと同 様、dCTPの かわ りに テン プレ ―ト 上のGの相補的な位置に取り込まれ、chain‑
terminatorとして挙動することが明かになった。このときCNDACが3｜‐末端に取り込まれ たDNA鎖 を精 製 して3．，末端の構造決定を行ったところ、CNDACは―部CNDCに変換され てぃたが、一旦CNDACの3．‐側に鎖伸長が起こっ た後にDNA鎖切断が起こった際にのみ生 成する2．，3．．ジデオキシ‐2．，3．・ジデヒドロ体（ddCNC）が観察された。Vent(exo‑) polymeraseを 用い た場 合もddCNCの生 成が 見られたため、CNDACTPはchain‑terminator と し て 作 用 し て い る だ け で な くDNA鎖 切 断 を 引 き 起 こ し て い る と 考 え ら れ た 。
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学 位論文審査の要旨 主 査 教 授 松 田 彰 副 査 教 授 大 塚 栄 子 副 査 助教授 周東 智 副 査 助教授 井上英夫
学 位 論 文 題 名
抗 腫 瘍 活 性 を 持 つ 新 規 ヌ ク レ オ シ ド ， 2 ′ ー く ） − cyano − 2 ′ ‑ deoxy − i‑B 一 D‑
arabinofuranosylcytosine(CNDAC) の 作 用 機 序
難治性がんに対する治療薬の開発は極めて重要な課題である。申請者は、
現 在急 性 白血病 薬として 臨床的に 応用され てぃるAra‑Cを母 化合物に 、ヌク レ オシ ド 自体は 化学的に 安定であ るが、細 胞内で代謝 されDNAに取 り込まれ た時に反応性を発揮する新規制がん剤2｜‑C‑cyano‑2｜‑deoxy‑l‑ fi‑D‑arabino‑
furanosylcytosine(CNDAC)分子設計を行い、その作用機序jこついての研究を 行った。
1．CNDACの分子設計と合成
2．‑Deoxycytidineの2｜‐ロ位に電子吸引基を導入すると2｜‐ばプロ卜ンの酸 性度が 増す。この 誘導体がDNAに取り込まれた時、隣接する・リン酸基の酸素 原子による2．．ロプロトンの引き抜き、続いてグ脱離によりDNA鎖切断が起こ る と仮 定 した。 このDNA鎖切 断仮説を 実現する 化合物とし て、シア ノ基を導 入したCNDACを分子設計 し、シチ ジンから2．‐シア ノヒドリン体を経由し、
ラジカル的脱酸素化反応行い高収率で合成した。
2．CNDACの化学的安定性
CNDACをア ルカリ性条 件下で37℃ に加温し て安定性 を検討し たところ、
2 ‐届シアノ基が反転した2｜‑C‑cyano‑2．‑deoxycytidine(CNDC)と、グリコシ ル結 合が開裂し た産物で あるシト シンとグ リカール 体の3種の 化合物が生成 し た 。 こ れ ら の 化 合 物 は 、 こ の 時CNDACとCNDCの間 に は 平衡 が 成立 し 、 グリ コシル結合 の開裂は 両化合物 におぃて一定速度でゆっくりと起こること をシュミレーションにより証明した。
3．CNDACの 抗 腫 瘍 活 性
CNDACはin vitroで各種 ヒ卜固形 がん由来細胞に対して強い増殖抑制活性 を 示 し 、 そ の 制 がん ス ペク 卜 ル はAra‑Cと は 異 なる こ と を明 か にし た 。in vivoでも、マ ウス白血 病細胞P388に対 して延命 率(T/C値）が600％以上とぃう 値を示し た(Ara‑CのT/C値は225％）。ヌ―ドマウスに移植したヒト胃癌St‑4細 胞 に 対 し て も 、CNDAC投与 で5匹 中5匹 に長 期 生存 が 確 認さ れ 癌細 胞 の 消失 を確認し た。
4．CNDACの作用 機序
CNDACのDNA、RNA、 蛋 白 質 合 成 に 与 え る 影 響 を 大 腸 癌 細 胞 を 用 い て 検 討 し た 。CNDACはDNA合成 を 阻 害す る だけ で な く、RNA合成 も 阻 害し た 。 さ ら に 、CNDACはG2/M期 で 細胞 周 期を 停 止 させ 核 酸 系代 謝 拮抗 剤 と して は 特異的な 挙動を示 した。― 方、CNDACは細 胞内で5‐ ‐モノ、 ジ、トリリ ン酸 体に代謝 されるこ とを確認 した。更 に、CNDACと2．‑ deoxycytidineと併用し た 時 に 最 も 増 殖 抑 制 活 性 が 減 弱 し た こ と か ら 、CNDACはdeoxycytidine kinaseによルリン酸化を受けることが明かになった。
5. CNDAC工PのDNA polymeraseユRNA po！Y田 皇 ［量 量 夐 に対 す る挙 動 CNDACの5． 卜 リ リ ン 酸 体 （CNDACTP） を 用 い てT7RNApolymeraseの CTPの 取 り 込 み の 阻 害 を 調 べ た 。CNDACTPはRNApolymeraSeを 阻 害 し 、 その様式 はCTPJこ対す る競合阻 害であっ た（Ki＝250メM）。―方、DNA合成阻 害様式はDNApoIymeraseばに対しdCTPに対する 競合阻害 であった （Ki＝0．16 メM）。 更 に 短鎖DNAをプ ラ イ マ― と し てpolば によ りDNA鎖 伸長反応 を行っ た と こ ろ 、CNDACTPはdCTPの か わ り に テ ン プレ ― ト 上のGの 相 補的 な 位 置 に取り込まれ、chain−terminatorとして挙動した。このときCNDACが3．‐末端 に取り込 まれたDNA鎖 を精製し て3｜‐末 端の構造 決定を行 ったところ 、一旦 CNDACの3｜ ‐側 に 鎖 伸長 が 起こった 後にDNA鎖切 断が起こ った際に のみ生成 する2．，3．‐ジデオキシ‐2．，3．―ジデヒドロ体が観察され、CNDACTPはChain‐ terminatorと し て作 用 して ぃる だけでな くDNA鎖切断 を引き起 こしてぃ るこ とを明らかにした。
以 上 のよ う に 本研 究 は、 新し ぃ制がん 性ヌクレ オシドCNDACを 鎖切断仮説 により分 子設計し 、これが 強カな制 がん活性 を示すこ と、および 作用機序と して仮説 どうりDNAに 取り込ま れた後にchain‐terminationと鎖切断を引き起 こし制が ん活性を 発現することを証明したので博士（薬学）の学位を授与する に足る内容を持っものと認定した。
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