博 士 （ 医 学 ） 折 舘 伸 彦
学 位 論 文 題 名
Jun and Fos related gene products bind to and modulate the GPE I, a strong enhancer element of the rat glutathione transferase P gene.
(Jun/Fos関連遺伝子産物はラットグルタチオントランスフェラーゼ遺伝子の強カな エ ン ハ ン サ ーGPEI配 列 に 結 合 し そ の 転 写 調 節 活性 を変 化さ せる 。）
学 位 論 文 内 容 の 要 旨
緒 言
ラッ トグ ルタ チオ ント ラン スフ ェラ ーゼP (GST‑P: glutathione transferase，EC 2.5.1.18)遺伝子 は 肝 化 学 発 癌 の 初 期 か ら 特 異 的 に 発 現 さ れ る 腫 瘍 マ ー カ ー で あ り 、 こ の 遺 伝 子 発 現 の 機 構 を 解 明 す る こ と は 肝 化 学 発 癌 過 程 の 遺 伝 子 発 現 変 化 を知 る一 助と なる 。GST‑P遺 伝子 はそ の5 ，上 流 に 位 置 す る 強 カ な エ ン ハ ン サ ー(GPEI配 列 ） に よ り 発 現 が 調 節 さ れ る こ と が 知 ら れ て い る が 、 こ のGPEI配 列 はphorbol 12‑O‑tetradecanoate 13‑acetate (TPA)応 答 配 列(TPA responsive element: TRE)様 配 列 が 逆 向 き に2個 並 ん だ 構 造 で 、TRE配 列 に 結 合 す る 転 写 因 子AP‑1の 関 与 が 示 唆 さ れ る 。AP‑1はJun/Fosフ ん ミ リ ー に 属 す る 構 造 が 類 似 し た 複 数 の タ ン パ ク 質 の 二 量 体 でTPAの 核 内 シ グ ナ ル 伝 達 を 担 う 因 子 と し て 同 定 さ れ た 。Jun/Fosフ ん ミ リ ー は3個 のjun遺 伝 子： c‑jun，junB，junDおよび5個のfos遺伝子：c‑fos，fosB，△fosB，fral，fra2からなるoC‑Jun/c‑Fos 二 量 体 がGPEI配 列 に 結 合 し 転 写 調 節 を 行 う 可 能 性 は す で に 示 さ れ て い た が 、 こ の 二 量 体 を 持 た な い マ ウ ス 未 分 化F9細 胞 に お い て もGPEI配 列 が 高 い 活 性 を 示 す こ と か ら 、 こ の 高 活 性 は c‑Jun/c‑Fos=量 体 で は 説 明 さ れ ず 、 他 の 転 写 因 子 の 関 与 が 示 唆 さ れ る 。 そ こ で 我 々 は 、Jun/
Fos関 連 遺 伝 子 産 物 の GPEI配 列 に 対 す る 結 合 親 和 性 と 転 写 調 節 能 を 検 討 し た 。 材 料 と 方 法
(1) Jun/Fos関 連 遺 伝 子 産 物 の 合 成 と ゲ ル シ フ ト ア ッ セ イ
c‑jun cDNAは ラ ッ ト 肝cDNAラ イ ブ ラ リ ー よ ル クロ ーン した 。fosB，△ 、fosB，fral，fra2のcDNA は ラ ッ ト 線 維 芽 細 胞 株3Y1のRNAか ら 逆 転 写 後polymerase chain reactionで 増 幅 し た 。junB， junDのcDNAはD．Nathans博 士 か ら 、c‑fos cDNAはN．Nomura博 士 か ら そ れ ぞ れ 供 与 を 受 け た 。 各cDNAをpBluescriptII (Stratagene，CA，USA)に 挿 入 し 、T3あ る い はT7 RNA合 成 酵 素 を 用 い て 試 験 管 内 でcap類 似 体 存 在 下 に 転 写 反 応 を 行 いRNAを 合 成 し 、 こ れ ら のRNAか ら ウ サ ギ 網 状 赤 血 球 ラ イ セ ー ト(Promega，WI，USA)を 用 い て 各 遺 伝 子 産 物 を 合 成 し た 。 下 記 の オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド をKlenow酵 素 を 用 い て[oc‑32Pl‑dCTPで 標 識 し 、 遺 伝 子 産 物 と と も に2ygの ポリ(dI‑dC)． ポ リ(dI‑dC)存 在 下 で37℃ で30分 間 結 合 反 応 を 行 っ た 。 反 応 物 は4%ポ リ ア ク リ ル ア ミ ド ゲ ル 内 で 電 気 泳 動 し た 。
′ 工RE: 5′ ― く;ATCCATGAGTCAGACAくXユXTCー3′
く ヨ ； Eエ ：5′ ― く 薯 ￥ ［ くcGrAGTCAGTCAGIATGATTCAGCAAC￡ Eぬ ユ C− 3′ (2) jun/fos関 連 遺 伝 子 の 導 入 と ク ロ ラ ム フ ェ ニ コ ー ル ア セ チ ル ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ
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(Chloramphenicol acetylransferase: CAT)アッセイ
3‑actin promoter (c‑jun)，RSV‑LTR（j unB，junD)，SRa promoter (c‑fos，fosB，△fosB，fral，fra2)を そ れぞ れ プ ロ モー タ ー とし て 持 つjun/fos関連 遺 伝 子の 発 現プ ラスミ・ ドを作 製し、こ れを2Ligと TRE配 列 あ る い はGPEI配 列 の 下 流 にCAT遺 伝 子 を 持 つ レ ポ ー タ ー 遺 伝 子2Lrgを り ン 酸 カ ル シ ウ ム 共 枕 法 に て 未 分 化 マ ウ スF9細 胞 に 導 入 し た 。CAT活 性 を 導 入48時 間 後 に 測 定 し 、 デ ン シ トメーター(Molecular Dynamics，CA，USA)にて相対的CAT活性を評価した。
結 果
(1) Jun/Fos関 連 遺 伝 子 産 物 のGPEI配 列 に 対 す る 結 合 親 和 性
標 識 し たTRE配 列 お よ びGPEI配 列 を プ ロ ー ブ と し て 用 い た ゲ ル シ フ ト ア ッ セ イ の 結 果 、Jun/
Fos関 連 遺 伝 子 産 物 の 様 々 な 組 合 せ か ら な る 二 量 体 は す ぺ て 特 異 的 にGPEI配 列 に 結 合 す る こ と が 示 さ れ た 。GPEI配 列 に 対 す る 結 合 はc‑Jun/FosBお よ ぴc‑Jun／ △FosBの 組 合 せ が 同 程 度 で 他 の 組 合 せ よ り 強 か っ た 。GPEI配 列 へ の 結 合 は 、 い ず れ の 組 合 せ の 場 合 もTRE配 列 に 対 し て よ り 低 か っ た 。 さ ら に こ の こ と は 、 大 量 未 標 識TRE配 列 あ る ぃ はGPEI配 列 オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド を 用 い た 競 合 的 結 合 阻 害 実 験 に よ っ て 確 認 さ れ た 。
(2) Jun/Fos関 連 遺 伝 子 導 入 のGPEI配 列 に 対 す る 転 写 調 節 、
Jun/Fos関 連 遺 伝 子 産 物 のGPEI配 列 に 対 す る 転 写 調 節 能 を 検 討 す る た め に 、 未 分 化F9細 胞 に お い てTRE配 列 あ る ぃ はGPEI配 列 を 持 つ レ ポ ー タ ー 遺 伝 子 を 用 い たCATア ッ セ イ を 行 っ た 。 c‑junあ る い はjunDをc‑fosと の 組 合 せ で 導 入 し た 場 合 、GPEI配 列 を 介 し た 転 写 が 増 加 し た 。 fosBあ る ぃ はLxfosBは 、 単 独 あ る い はc‑junと の 組 合 せ で 導 入 し た 場 合 、GPEI配 列 の 活 性 を 部 分 抑 制 し た 。 一 方TRE配 列 に 対 し てfosB、 △fosBと も にc‑junに よ る 転 写 活 性 増強 を 抑 制し た が
△fosBの 方 がfosBよ り も そ の 効 果 は 大 で あ っ た 。 考 察
(1) Jun/Fos関 連 遺 伝 子 産 物 の GPEI配 列 に 対 す る 結 合 親 和 性 に 関 し て Jun/Fos関 連 遺 伝 子 産 物 は 二 量 体 の 組 合 せ に よ りTRE配 列 に 対 し て 異 な る 結 合 親 和 性 を 持 っ こ と が 報 告 さ れ て い た が 、GPEI配 列 に 対 し て の 体 系 的 報 告 は こ れ ま で な か っ た 。c‑Jun/FosBお よ びc‑Jun／ △FosBの 組 合 せ がGPEI配 列 に 対 す る 高 親 和 性 を 示 し た が 、Jun/Fos=量 体 のTRE配 列 に 対 す る 解 離 定 数 がnMオ ー ダ ー で あ る の に 対 し 、 こ の 二 量 体 形 成 の 解 離 定 数 がmMオ ー ダ ー で あ る と の 報 告 を 考 え る と 、 こ の 実 験 で み ら れ たJun/Fos関 連 遺 伝 子 産 物 のTRE配 列 あ る い は GPEI配 列 に 対 す る 様 々 な 二 量 体 の 結 合 親 和 性 の 違 い を 規 定 し て い る の は 、 二 量 体 と し て の DNA結 合 能 よ り む し ろ 二 量 体 形 成 の 段 階 の 方 か も 知 れ な い 。 ま た こ れ ら 二 量 体 のGPEI配 列 に 対 す る 結 合 親 和 性 はTRE配 列 に 対 す る よ り 低 い こ と を 示 し た が 、 こ れ はGPEI配 列 のTRE様 配 列 が 完 全 なTRE配 列 で は な い た め と 思 わ れ た 。
(2) Jun/Fos関 連 遺 伝 子 産 物 のGPEI配 列 に 対 す る 転 写 調 節 に 関 し て
線 維 芽 細 胞 で はTRE配 列 を 介 し た 転 写 をFosBは 活 性 化 し 、 一 方 △FosBは 抑 制 す る こ と が 報 告 さ れ て い る が 、 我 々 の 用 い た 系 で はTRE配 列 に 対 し て はFosBと △FosBの 効 果 の 差 が み ら れ た が 、GPEI配 列 に 対 し て は 認 め ら れ な か っ た 。GPEI配 列 結 合 能 に 関 し てc‑junと の 組 合 せ で FosBと △FosBの 間 で 差 は み ら れ な か っ た の で 、Jun/Fos関 連 遺 伝 子 産 物 の 間 のGPEI配 列 を 介 し た 転 写 調 節 能 の 違 い よ り 、 む し ろJun/Fos関 連 遺 伝 子 産 物 以 外 のGPEI配 列 結 合 因 子 の 関 与 を 考 慮 す ぺ き で あ ろ う 。 肝 化 学 発 癌 過 程 に お ぃ てGPEI配 列 の 高 活 性 の 責 任 因 子 は 同 定 さ れ て い な い が 、 こ れ を 発 見 す る こ と がGST‑P遺 伝 子 の 転 写 活 性 化 の 機 構 を 明 か に す る う え で 重 要 で あ る こ と は 言 う ま で も な い 。 し か しGPEI配 列 に 対 し て 高 親 和 性 を 持 つc‑Jun/FosBあ る い はc・ Jun／ △FosBの 二 量 体 が こ の 因 子 のGPEI配 列 へ の 結 合 を 抑 制 す る 、 ま た は 、FosBあ る い は △ FosBが こ の 因 子 と 結 合 し て 、GPEI配 列 を 介 し た こ の 因 子 の 転 写 活 性 化 を 抑 制 す る 可 能 性 は 否 定 で き な い 。
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結 語
(1) Jun/Fos 関連遺伝子産物の二量体はすぺて特異的にGPEI 配列に結合するがその親和性は TRE 配列に対すてより低かった。GPEI 配列に対する結合親和性はc‑Jun/FosB およぴc‑Jun/ △ FosB の組合せが同程度で他の組合せより高かった。
(2) 未分化F9 細胞においてfosB あるいは△fosB の導入は、単独あるいはc‑jun 導入との組合せで
GPEI 配列を介した転写活性を部分抑制した。
学位論文審査の要旨
学 位 論 文 題 名
Jun and Fos related gene products bind to and modulate the GPE I, a strong enhancer element of the rat glutathione transferase P gene.
(Jun/Fos関連遺伝子産物はラットグルタチオントランスフェラーゼ遺伝子の強カな エ ン ハ ン サ ーGPEI配 列 に 結 合 し そ の 転 写 調 節活 性を 変化 させ る 。）
ラ ッ ト 胎 盤 型 グ ル タ チ オ ン ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ(GST‑P)遺 伝 子 は 肝 化 学 発 癌 の 初 期 か ら 特 異 的 に 発 現 さ れ 、 そ の5 ・ 上 流 に 位 置す る強 カな エン ハン サー(GPEI配列 ）に よ り 発 現 調 節 さ れ る こ と が 知 ら れ てVゝ る 。GPEI配 列 は12‑O‑tetradecanoyl‑phorbol 13‑
acetate (TPA)応 答 配 列(TRE)様 配 列 が 逆 向 き に2個 並 ん だ 構 造 で くTRE配 列 に 結 合 す る 転 写 因 子AP‑1の 関 与 が 示 唆 さ れ る 。AP‑1はJun/Fosフ ん ミ リ ー に 属 す る 構 造 が 類 似 し た 複 数 の タ ン パ ク 質 の 二 量 体 でTPAの 核 内 シ グ ナ ル 伝 達 を 担 う 因 子 で あ り 、 こ の ファミリーはc‑jun，junB，junDのjun遺伝子とc‑fos，fosB，△fosB，fral，fra2のfos遺伝子 か ら な る 。c‑Jun/c‑Fos二 量 体 がGPEI配 列 に 結 合 し 転 写 調 節 を 行 う 可 能 性 は す で に 示 さ れ て い た が 、 こ の 二 量 体 を 持 た な い マ ウ ス 未 分 化F9細 胞 に お い て もGPEI配 列 が 高 い 活 性 を 示 す こ と か ら 、 こ の 高 活 性 はc‑Jun/c‑Fos二 量 体 で は 説 明 さ れず 、他 の転 写 因 子 の 関 与 が 示 唆 さ れ る た め 、Jun/Fos関 連 遺 伝 子 産 物 のGPEI配 列 に 対 す る 結 合 親 和性と転写調節能を 検討した。
合 成Jun/Fos関 連 遺 伝 子 産 物 とTRE配 列 お よ びGPEI配 列 を 用 い た ゲ ル シ フ ト ア ッ セ イ の 結 果 か ら 、 こ れ ら 遺 伝 子 産 物 の 二 量 体 は す べ て 特 異 的 にGPEI配 列 に 結 合 す る が そ の 親 和 性 はTRE配 列 に 対 し て よ り 低 く 、GPEI配 列 に 対 す る 結 合 親 和 性 はc‑Jun/
FosBお よ ぴc‑Jun／ △FosBの 組 合 せ が 同 程 度 で 他 の 組 合 せ よ り 高 い こ と が示 され た。 次 にGPEI配 列 の 下 流 に ク ロ ラ ム フ ェ ニ コ ー ル ア セ チ ル ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ 遺 伝 子 を 持 つ レ ポ ー タ ー 遺 伝 子 を 用 い て 未 分 化F9細 胞 に お け るGPEI配 列 を 介 し た 転 写 調 節 に 対 す るjun/fos関 連 遺 伝 子 導 入 の 効 果 を 検 討 し た と こ ろ 、fosBあ る い は △fosBの 導 入 が 、 単 独 あ る い はc‑jun導 入 と の 組 合 せ でGPEI配 列 を 介 し た 転 写 を 部 分 抑 制 し た こ と か ら 、Jun/Fos関 連 遺 伝 子 産 物 がGPEI配 列 を 介 し てGST‑Pの 発 現 調 節 を 行 う こ と が 示
