博士（医学）田中徳彦 学位論文題名

     博士（医学）田中徳彦 学位論文題名

ラッ1の前脳虚血モデルによる高磁場水素磁気共鳴スペク1ロスコピーを用いた脳代謝物変動の評価

学位論文内容の要旨

く 緒 言 ＞ 脳 虚 血 時 の 種 々 の 代 謝 動 態 は ， 脳 虚 血 の 理 解 に っ き 必 須 の 情 報 で あ る ． 第 ー に ， 脳 組 織 へ の 酸 素 の 供 給 停 止に 伴 う ， 高エ ネ ル キ ゛‐ リ ン 酸 化合 物 の 枯 渇に よ る 嫌 気性 解 糖 の 亢進 と い う エ ネ ル キ ゛ 一 代 謝 の 崩 壊 ， 第 二 に ， 引 き 続 く 血 行 再 開 に 伴 う 細 胞 膜 障 害 が 問題 と な る ，高 磁 場 水 素 磁 気 共 鳴 ス ベ 外 ロ ス コ ヒ ゜ − （proton magnetic resonance spectroscopy; iH MRS)は ， 水 素 原 子 を 持 つ 生 体 内 代 謝 物 を 分 析 で き る 優 れ た 検 査 法 で あ り ，lactate，cholineを 初 め ， 各 種 の 神 経 伝 達 物 質 な ど の 測 定 が 同 時 に 可 能 で あ る ． 本 研 究 で は 臨 床 的 な 再 潅 流 障 害 の状 態を再 現でき るフ． ルシネ りの四管閉塞モデルを用い，マイクロウェーフ゛により瞬時に脳代謝を固定 し ， 各 代 謝 物 の 変 動 をiH MRSで 測 定 し 検 討 し た ， 近 年 ， 再 潅 流 障 害 の 進 行 に 関 与 す る 因 子と してフ リーラ シ゛カ ルが注 目されている．血行再開時の酸素の再供給によるアラキドン酸カスケ‐ド活 性 化 に 伴 い 発 生 し た フIJ‐ ラ シ ゛ カル が 細 胞 膜を 傷 害 し ，神 経 細 胞 に不 可 逆 的 な障 害 を 与 える と い う も の で あ る ．MCI‐186（3−methylー1−phenyl−2−pyrazolin―5−one） は ， フリ ー ラ シ ゛カ ル の作 用を抑 制する ことに より， 虚血再潅流時の神経細胞障害を軽減するフリーラシ゛カルスカウ゛エンシ゛

ヤ― であり ，本実 験系を 用い虚 血再潅流 障害に 対する 治療効 果を検 討した ．

く 方 法 ＞Wister系 雄 性 ラ ッI（ 体 重 250‐300g) 60頭 を 用 い た.sodium pentobarbital

（50mg/kg)の 腹 腔 内 注 射 後 に ， 歯 科 用 ド リ ル に て 椎 骨 動 脈 を 永 久 閉 塞 し た ．24―72時 間 後 に ， 脳 波 ， 動 脈 血 圧 ， 直 腸 温 ， 動 脈 血 が ス の モ ニ タ ‐ 下 で ， 覚 醒 さ せ た状 態 で 両 側総 頚 動 脈 をテ ンホ ゜ラ｜J ‑クリッ フ゜で 閉塞した．30分の虚血時間の後，ウリッァを解除して0分，10分，30分，60分の 再 潅 流 を 行 っ た ． 経 過 中 は 直 腸 温 を37.0土0.5℃ に 保 ち ， 正 向 反 射 消 失 ， 脳 波 平 坦 化 ， 血 圧 上 昇 を も っ て 虚 血 を 判 定 し た ， な おMCI・186投 与 群 に つ い て は 血 流 遮 断5分 前 あ る い は 血 流 再 開 通 直 後 に3mg/kgを 外 頚 静 脈 よ り 投 与 し た ． 再 潅 流 終 了 時 にSkw，1.5sec.

で マ イ ク ロ ウ ェ ー フ ゛ の 瞬 時照 射 を 行 い頭 頚 部 の 代謝 固 定 を 行っ た ． 取 り出 し た 脳 より 皮 質 を 分離 し 凍 結 さ せ ， 各 代 謝 物 を 抽 出 し 凍 結 乾 燥 粉 末 と し た の ち に 重 水 に 溶 か し ， 高 磁 場MRS装 置 （11T Bruker AM―400 spectrometer)で 測 定 し た ， 各 代 謝 物 の ス ペ 外 ラ に っ き 信 号 強 度 を 求 め ， 生 体 内 で 安 定 と 考 え ら れ て い るphosphocreatineと creatineの 和 を 内 部 基 準 とし て，各 代謝物 の代謝量 は両者 の和へ の比と して解 析した ．

く結果＞MCI 一186 投与群と非投与群で，再潅流時間を変化させ，全10 群で検討した．

MCI・186非 投 与 群choline，acetate，lactateと も に 虚 血 終 了 時 （ 再 潅 流 時 間0分 ） に ， コンIロール に比し 高いスヘ ゜外ラ 比を得 た．再 潅流の 経過と ともに 遷延しながらもコン1ロ‐ル値に戻る 傾 向 を 認 め た （ 三 代 謝 物 と も 群 間 変 動 が 群 内 変 動 に 比 し 大 き か っ た ．  Kruskal Wallis test:PくO.OOOl） ． な おacetateはcholineに 較 ベ 再 潅 流 時 の ス ベ ク1ラ 比 が 高 値 で 遷 延 し た ． MCI・186虚 血 前 投 与 群cholineは 虚 血 前 投 与 に よ り ， ス ベ 外 ラ 比 の 上 昇 が 虚 血 再 潅 流 の ほ ぼ 全 期 間 で 抑 制 さ れ ， 特 に 再 潅 流 時 間 O分 と30分 で は 非 投 与 群 に 比 し て 統 計 学 的 有 意 に 抑 制 さ れ た （ 両 時 点 と も Mann‐WhitneyUtest:P＝0.0065） ． acetateで は cholineと 異 な り ， 虚 血 終 了 時 の 抑 制 は 見 ら れ ず ， 再 潅 流 時 間30分 で 有 意 に 抑 制 さ れ た （Mann‐ WhitneyUtest: P=0.01 63） ． い っ ぽ う ｜actateで は 有 意 な 抑 制 は み ら れ な か っ た ． MCI・186虚 血 後 投 与 群 虚 血 前 投 与 に よ り 三 代 謝 物 と も 再 潅 流 時 間30分 で ， ス ヘ ゜ ク1ラ 比 の 上 昇 の 平 均 値 が 最 も 抑 制 さ れ た た め ， 再 潅 流 時 間30分 で 非 投 与 群 と 虚 血 後 投 与 群 を 比 較 し た ． lactateで の み 有 意 な 薬 効 が 得 ら れ た （ Mann― WhitneyUtest: P=0.0104).

く 考 察 ＞cholineは 細 胞 膜 の 主 要 構 成 成 分 で あ る り ン 脂 質 の 構 成 物 質 で あ り ，cholineを 含 ん だphosphatidylcholineの よ う な り ン 脂 質 の 形 で 細 胞 膜 内 に 多 く 存 在 す る ．MRSで は 主 に 細 胞 膜 内 リ ン 脂 質 の 構 成 成 分 と し て のcholineを 測 定 し て い る と 考 え ら れ て い る ． 今 回 ， 虚 血 終 了 時 に ヒ ． ‐ ウ を 迎 え ， 再 潅 流 時 に 遷 延 し な が ら 滅 少 す る 一 過 性 のcholineの 上 昇 が み ら れ た ．cholineの 上 昇 は りン 脂 質 破 壊に よ る と 思わ れ ， 虚血 再潅流 による アラキ ト゛ン 酸カス ケ‐ド の 活 性 化 に よ ル フ｜J‐ ラ シ ゛ カル が 産 生 され ， 細 胞 膜障 害 を 遷 延化 し て い ると 考 察 さ れる ． 本 検 討 ではフリ‐ラシ゛カルスカウ゛エンシ゛ヤ―であるMCI‑1 86の投与によルスヘ゜外ラ比の上昇が抑制されており，

細 胞 膜 の 破 壊 に 対 し て の 薬 効 を 示 す も の と 考 え ら れ る ．acetateはcholineの 前 駆 物 質 で あ る ． 虚 血 時 の 遊 離 脂 肪 酸 濃 度 が 海 馬 で 有 意 に 高 い と の 報 告 が あ り ， 従 来 のMRSの 報 告 に お い て も ， 虚 血 時 の 選 択 的 脆 弱 性 を 有 す る 海 馬 に お い て acetateの 有 意 な 上 昇 が 観 察 さ れ て お り ，acetateは ， フ ｜J― ラ ゾ カ ル 反 応 の 結 果 と し て 産 生 さ れ る 遊 離 脂 肪 酸 の 分 解物 で あ る と 考 え ら れ て い る ． acetateに お い て も ， cholineと 同 様 の 代 謝 動 態 お よ びMCI・186に よ る 抑 制 効 果 が 認 め ら れ た が ー 薬 効 は 再 潅 流 時 に 限 定 さ れ た ． こ れ は ，acetateが フ リ ー ラ シ ゛ カ ル 反 応 に よ り 産 生 さ れ る 遊 離 脂 肪 酸 の 分 解 物 で あ る と い う ， 従 来 の 仮 説 を 間 接 的 に 支 持 す る ．  iH MRSに お い て 測 定 し や す い ヒ ゜ ― ウ を 持 つacetateは ， 虚 血 再 潅 流 障 害 の 一 指 標 と な り う る と 考 え る ． 虚 血 時 の 嫌 気 性 解 糖 の 最 終 産 物 で あ るlactateは ， 従 来 の 報 告 と 同 様 の 挙 動 を と っ た ．MCI・ 186の 薬 効 に つ い て は ， 虚 血 後 投 与 で の み 有 意 な 抑 制 を 観 察 し た ． こ れ は ， no‐reflow phenomenonが も た ら す 再 潅 流 開 始 遅 延 に よ る 遷 延 し た 嫌 気 性 解 糖 を ， フ リ ― ラ シ ゛ カ ル 反 応 へ の 薬 効 に よ り抑 制 し た もの と 考 察 され る ． 本 検討 は ， 超 急性 期 の 検 討 で あ り ， 前 脳 虚 血 モ デ ル は 虚 血 時 間30分 で は 梗 塞 巣 を も た ら さ な い ． 長 時 間 の 検 討 で は ， 再 潅 流 の 経 過 で 復 調 す る 脳 内 代 謝 の 中 で 超 急 性 期 の 代 謝 変 動 が 埋 も れ る 可 能 性 が あ る ． そ の た め 三 代 謝 物 全 て が 再 潅 流 時 間60分 の 時 点 で ， ほ ぼ コ ンIロ ― ル 値 に 回 復 し た と 考 え ら れ る ．

く結語＞検討した三代謝物で、虚血終了時にスヘ゜外ラ比が上昇し，再潅流の経過で遷延し

つっもコンI ロール値に戻る傾向を認めた．MCI ・186 投与により，三代謝物とも主に再潅流の

経過で統計学的有意な薬効を得た．これは再潅流時の細胞膜破壊へのフI丿‐ラシ゛カルスカウ゛エンシ゛ヤ―

に よ る 薬 効 の 反 映 で あ る と 考 え ら れ た ． MRSで は ， 比 較 的 簡 便 に 多 く の 代 謝 物 を 同 時 に 計 測 で き ，in vitroで の 運 用 が 確 立 さ れ た な ら ，in vIvoで の 無 侵 襲 の 検 査 確 立 に っ な げ ることが可能であ り有用である．

学位論文審査の要旨

学 位 論 文 題 名

ラツIの前脳虚血モデル｜こよる高磁場水素磁気共鳴スペク1ロスコピーを用いた脳代謝物変動の評価

  虚 血 再 潅 流 時 の 脳 内 代 謝 物 変 動 を 高 磁 場 水 素 磁 気 共 鳴 ス ヘ ゜ クIロ ス コ ヒ ゜ ー(iH MRS)を 用 い 検 討 し た 。MCト186（3−methyl・1―phenyl―2―pyrazolin‐5―one） は 、 血 行 再 開 時 の 酸 素 再供 給によるアラキ ドン酸カスケ‐ド活性化に 伴うフリ‐ラシ゛カル作用を 抑制し、虚血再潅流時の神 経 細 胞 障 害 を 軽 減 す る フ リ ー ラ シ ゛ カ ル ス カ ウ ゛ エ ン シ ゛ ヤ ー で あ り 、 治 療 効 果 を 検 討 し た 。   本研 究 では 、ウ イス タ− 系 雄性 ラッ1（ 体重250‑300g) 60頭 を用 いた 。 フ゜ ルシネりの四管閉塞モデ ル に 従 い 、 椎 骨 動 脈 を 永 久 閉 塞 し た24―72時 間 後 に 両 側総 頚動 脈を テン ホ ゜ラ リー クリ ッァ で 閉塞 し、

脳 波 、 動 脈 血 圧 、 直 腸 温 、 動 脈 血 が ス の モ ニ タ ‐ 下 で 、30分 虚 血 の 後 、O分 、10分 、30分 、 60分 の 再 潅 流 を 行 っ た 。 な お 正 向 反 射 消 失 、 脳 波 平 坦 化 、 血 圧 上 昇 に よ り 虚 血 を 判 定 し た 。 再 潅 流 終 了 時 に マ イ ク ロ ウ ェ ー フ ゛ を 照 射 し 脳 代 謝 固 定 を 行 っ た 。 取 り 出 し た 脳 よ り 皮 質 を 分 離 し 、PCA法 に よ り 各 代 謝 物 を 抽 出 し 高 磁 場MRS装 置 で 測 定 し た 。 各 代 謝 物 の ス ヘ ° ク ト ラ の 信 号 強 度 を 求 め 、 生 体 内 で 安 定 で あ るphosphocreatineと creatineの 和 を 内 部 基 準 と し 、 各 代謝 物 量を 両者 の和 への 比 とし 相対 量と し て解 析し た。

  統 計 検 討 の 結 果 、choline、acetate、 ｜actateと も に 虚 血 終 了 時 （ 再 潅 流 時 間0分 ） に 、 上 昇 の ヒ ゜ ‐ ク を 得 た 。 再 潅 流 の 経 過 に 従 い 漸 減 す る 傾 向 を 認 め た （ 三 代 謝 物 と も 群 間 変 動 が 群 内変 動 に比 し大 きか った 。Kru'kaIWa川stest：PくO．0001） 。

  MCI―186の 虚 血5分 前 投 与 に よ り 、 cholineは 虚 血 前 投 与 に よ り 、 上 昇 が 虚 血 再 潅 流 の ほ ぼ 全 期 間 で 抑 制 さ れ 、 再 潅 流 時 間0分 と30分 で は 非 投 与 群 に 比 し 有 意 に 抑 制 さ れ た

（ 両 時 点 と もMann― WhitneyUtest：P〓 O．0065） 。acetateで はchoIineと 異 な り 、 虚 血 終 了 時 の 抑 制 は 見 ら れ ず 、 再 潅 流 時 間30分 で 有 意 に 抑 制 さ れ た （Mann―WhitneyUtest： P＝O．0163） 。Iactateで は有 意な 抑 制は みら れな かっ た 。

MCl― 186の 虚 血 終 了 直 後 の 投 与 群 に よ り 、 再 潅 流 時 間 30分 で 、 Iactateで の み 有 意 な 抑 制 が得 ら れた （Mann―WhitneyUtest：P＝O．0104）。

  choIineは 細 胞 膜 の 主 要 構 成 物 質 で あ るphosphatidyIcholineの よ う な IJン 脂 質 の 形 で 細 胞 膜 内 に 多 く 存 在 す る 。MRSで は 主 に 細 胞 膜 内IJン 脂 質 の 構 成 成 分 と し て のcholineを 測 定 し て い る と 考 え ら れ て い る 。 虚 血 再 潅 流 時 のchoIine上 昇 は 、 フIJ‐ ラ シ ゛ カ ル に よ る 細 胞 膜 障

弘 哉

雄

秀 輝

部 藤

橋

阿 齋

石

授 授

授

教 教

教

査 査

査

主 副

副

害 の 結 果 と し て の9ン 脂 質 破 壊 に よ る と 推 察 さ れ 、MCI・186投 与 に よ り 上 昇 が 抑 制 さ れ 、 細胞膜障害への薬効を示したと考えられた。

  acetateは、フリ ‐ラシ ゛カル反 応の結 果として 産生され る遊離 脂肪酸の 分解物であると考えら れ てい る 。MCト186に よ るacetate上 昇の 抑 制 は再 潅 流 時に 限 定 さ れ、acetateが フIJ− ラシ ゛ カ ル 反 応 に よ り 産 生 さ れ る 遊離 脂 肪 酸の 分 解 物で あ る とい う 従 来 の仮 説 を 間接 的 に 支持 す る ものと推察された。

  虚 血 時 嫌 気 性 解 糖 の 最 終 産 物 で あ るlactateで は 虚 血 後投 与 で のみ 有 意 な抑 制 を 認め た 。 no―reflow phenomenonに 伴 う再 潅 流開始 遅延によ る嫌気性 解糖の 遷延を、 フlJ―ラ シ゛カル 反 応への薬効により抑制したと推察された。

  検 討 し た三 代 謝 物 で、 虚 血 終了 時 に 上昇 の ヒ °― ク を 認め 、再 潅流の経 過で漸減 する傾 向を 認 め た 。MCI・186投 与 に よ り 、 三 代 謝 物 と も 主 に 再 潅 流 の 経 過 で 有 意 な 薬 効 を 得 た 。 こ れは再潅流時の細胞膜破壊へのフlJ−ラシ゛カルスカウ゛エンゾャ‐による薬効の反映であると考えられた。

  公 開 発 表 に お い て 齋 藤 秀 哉 教 授 よ り 、MCト186の 虚 血 前 投 与 と 虚 血 後 投 与 で の 各 代 謝 物 へ の 抑 制 効 果 の 差 異 、 お よ びMCト186の 投 与 量 決 定 の 根 拠 に つ き 質 問 が あ っ た 。 次 い で 石 橋 輝 雄 教 授 よ り 、 測 定 さ れ た 各 代 謝 物 の 由 来 、 お よ びMRSで の 各 代 謝 物 測 定 の 妥 当 性 に つ い て 質 問 が あ っ た 。 い ず れ の 質 問 に 対 し て も 、 申 請 者 は 自 ら の 研 究 に 基 づ く経 験 や 過去の論文の結果を引用し、豊富な知識に基づいて明快に回答した。

  本 研 究 に よ り 、 虚 血 再 潅 流 時 のcholine、acetate、lactateの 動 態 が 明 ら か に な り 、 MCI・186の 薬 効 が 明 ら か に な っ た 。 今 後 本 研 究 の 成 果 は 脳 の 虚 血 再 潅 流 障 害 の 原 因 探 究 や実臨床での治療にっき、役立っものと期待される。

  審 査 員 一 同 は こ れ ら の 成 果 を 高 く 評 価 し 、 ま た 研 究 者 と し て 誠 実 か つ 熱 心 で あり 、 申 請 者が博士（医学）の学位を受けるのに充分な資格を有するものと判定した。