博士（医学）徳原 教 学位論文題名

     博士（医学）徳原   教 学位論文題名

ナチュラルキラーT 細胞はアポリポ蛋白E 欠損マウスにおける アン ジオテンシンII 誘発性腹部大動脈瘤の進展に寄与する

学 位 論 文 内 容 の 要 旨

【 背景 と目 的 】腹 部大 動脈 瘤は 高 齢者 にお ける 有病 率 が非 常に 高い 疾 患で ある 。瘤 径の 増大 に 伴い 破裂 の 危険 性が 増加 し、 大 動脈 瘤が 破裂 した 場 合に は致 死率 が 高い ため 、無 症状 であ っ ても 一定 の 瘤径 を超 えた 段階 で 外科 的治 療が 必要 と なる 。し かし 、 高齢 者で は全 身的 合併 症 のた め手 術 リス クが 高く 外科 的 治療 の適 応外 とな っ てし まう こと も 多い 。し たが って 腹部 大 動 脈 瘤 の 病 態 の 解 明 と そ れ に 基 づ く 内 科 的 治 療 の 確 立 は 重 要 な 課 題 で あ る 。   腹部 大動 脈 瘤の 病理 組織 は、 エ ラス チン やコ ラー ゲ ンな どの 細胞 外 マト リッ クス の破 壊、

血 管平 滑筋 細 胞の 減少 を特 徴と す るが 、マ クロ ファ ー ジや りン パ球 な ど炎 症細 胞の 浸潤 も目 立 っ。 特に 炎 症細 胞は 炎症 性サ イ トカ イン や細 胞外 マ トリ ック ス分 解 酵素 を産 生し 、瘤 形成 に おい て重 要 な役 割を 果た して い る。 一般 的に 腹部 大 動脈 瘤は 動脈 硬 化を 基盤 とし て発 症す る こと が知 ら れ、 慢性 炎症 は腹 部 大動 脈瘤 と動 脈硬 化 双方 の発 症に 関 与す る共 通の 機序 とし て 考え られ る 。

  ナ チ ュ ラ ル キ ラ ーT (NKT)細 胞 は 、 ナ チ ュ ラ ル キ ラ ー 細 胞 とT細 胞 双 方 の 表 面 抗 原 を 発 現 す るT細 胞 亜 群 で あ る 。NKT細 胞 は 抗 原 提 示 細 胞 か ら 提 示 さ れ た 糖 脂 質 を 認 識 し て 活 性 化 す る と 、 ヘ ル パ ーT細 胞 をTヘ ル パ ー1型(Thl） 細 胞 に 分 化 さ せ る サ イ ト カ イ ン(Thl サ イ ト カ イ ン ） で あ る イ ン タ ー フ ェ ロ ン(IFN)―Yお よ び 、Tヘ ル パ ー2型(Th2)細 胞 に 分 化 さ せ る サ イ 卜 カ イ ン(Th2サ イ ト カ イ ン ） で あ る イ ン タ ー ロ イ キ ン(11)‐4など を迅 速に 産 生 す る 。NKT細 胞 は こ れ ら の サ イ ト カ イ ン に よ っ て へ ル パ ーT細 胞 の 免 疫 応 答 を 規 定 す る た め 免 疫 調 節 細 胞 と して 注 目さ れて いる 。動 脈 硬化 モデ ルマ ウス を 用い た検 討で は 、NKT 細 胞は 動脈 硬 化病 巣に 存在 し、 動 脈硬 化の 発症 ・進 展 に重 要な 役割 を 果た すこ とが 明ら かに さ れて いる 。

  最 近 ヒ ト 腹 部 大 動 脈 瘤 を 用 い た 組 織 学 的 検 討 に よ り 、NKT細 胞 が 瘤 組織 に 存在 する こと が 報 告 さ れ た 。NKT細 胞 は 腹 部 大 動 脈 局 所 で 糖 脂 質 な ど の 内 因 性 リ ガ ンド を 認識 し、 慢性 炎 症 を 惹 起 さ せ て 瘤 形 成 に 関 与 し て い る 可 能 も 考 え ら れ る 。 し か し 、 こ れま でNKT細 胞が 腹 部 大 動 脈 瘤 に 及 ぼ す 影 響 を 検 討 し た 研 究 は な く 、NKT細 胞 が 果 た す 役割 に つい ては 不明 で あ る 。 本 研 究 で は 、 ア ン ジ オ テ ン シ ン(Ang) II持 続 投 与 ア ポ リ ポ 蛋 白E欠 損マ ウス にお い てNKT細 胞 を 刺 激 活 性 化 し 、NKT細 胞 が 腹 部 大 動 脈 瘤 の 発 症 ・ 進 展 に お い て 果 た す 役 割 を 検討 した 。

【 材 料 と 方 法 】20月 齢 雄 性 ア ポ リ ポ 蛋 白E欠 損 マ ウ ス を 用 い 、Angll（1000 ng/kg/min)あ る い は り ン 酸 緩 衝 食 塩 水(PBS)を4週 間 持 続 投 与 し た 。 そ れ ぞ れ の 処 置 を 行 っ た マ ウ ス を 2群 に 分け 、NKT細 胞を 特異 的に 刺 激す る糖脂質OCH (O.lLigg体 重）（AngH‐OCH群；n二二 ニ10 お よびPBS‐OCH群；n二ニ5）あるい はPBS（AngII＿PBS群；n 15およびPBS‐PBS群；n―10）を Angn投 与 開 始2日 前 とAngII投 与 中 は 週2回 、 計9回 腹 腔 内 投 与 し た 。4週 後 に 血 圧 測 定 を 行い 、採 血 後屠 殺し 、大 動脈 を 採取 した 。大 動脈 の 一部 は浸 潤し た 白血 球を 分離 して フロ

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ー サ イ ト メ ト リ ー 解 析 を 行 い 、 そ の 他 定 量 的RT‐PCR法 に よ る 遺 伝 子 発 現 解 析 、 免 疫 組 織 化 学 染 色 や 所sfmZymographyも 行 っ た 。

【 結 果 】PBS＿PBS群 に 比 較 し てAngn‐PBS群 お よ びAngn‐OCH群 で は 収 縮 期 お よ び 拡 張 期 血 圧 は 有 意 に 上 昇 し た が 、AngII・PBS群 とAngIトOCH群 の 間 に 有 意 差 は 認 め な か っ た 。 ま た 、 体 重 、 血 清 総 コ レ ス テ ロ ー ル 、HDLコ レ ス テ ロ ー ル 、non・HDLコ レ ス テ ロ ー ル 、 中 性 脂 肪 も Anglト PBS群 と Angll・ OCH群 の 間 で 有 意 差 は 認 め な か っ た 。   PBS−PBS群 お よ びPBS＿OCH群 で は 腹 部 大 動 脈 の 拡 張 は 認 め な か っ た が 、AngII−PBS群 の 腎 動 脈 分 岐 近 位 部 で の 最 大 径 はPBS‐PBS群 に 比 較 し て 有 意 に 大 き く 、 さ ら にAngn‐OCH群 で はAngn‐PBS群 に 比 較 し て 有 意 に 拡 張 し て い た 。 大 動 脈 の フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー 解 析 で は 、 大 動 脈 に 浸 潤 し たNKT細 胞 の 割 合 はAngn・OCH群 でPBS．PBS群 お よ びAngll・PBS群 に 比 較 し て 有 意 に 増 加 し て い た 。 腹 部 大 動 脈 の 組 織 学 的 解 析 で は 、AngIトOCH群 で AngIトPBS群 に 比 較 し て 弾 性 板 断 裂 数 は 有 意 に 増 加 し 、 壁 内 出 血 や 大 動 脈 解 離 の 合 併 率 も 有 意 に 上 昇 し た 。 ま た 、 マ ク ロ フ ァ ー ジ やTリ ン パ 球 の 浸 潤 も 、Angn‐OCH群 でAngIトPBS 群 に 比 較 し て 有 意 に 増 加 し て い た 。

  腹 部 大 動 脈 の 遺 伝 子 発 現 解 析 で は 、Va14/Ja18、MHCclaSsII、RANTES、IFNイ 遺 伝 子 発 現 はAngI卜OCH群 でAngII．PBS群 に 対 し て い ず れ も 有 意 に 亢 進 し た 。 腹 部 大 動 脈 の 加sむ 甜 Zymographyで は 、MMP活 性 はPBSIPBS群 お よ びAngH‐PBS群 で は ほ と ん ど 認 め な か っ た が 、Angn‐OCH群 で は 弾 性 板 断 裂 や 壁 内 出 血 を き た し た 瘤 形 成 部 の 中 膜 か ら 外 膜 の 領 域 に 一 致 し て 亢 進 を 認 め た 。

【 考 察 】 本 研 究 で は 、 ア ポ リ ポ 蛋 白E欠 損 マ ウ ス にAngnを 持 続 投 与 し た 腹 部 大 動 脈 瘤 マ ウ ス モ デ ル に お い て 、OCHを 腹 腔 内 反 復 投 与 し てNKT細 胞 を 活 性 化 す る と 、 腹 部 大 動 脈 瘤 の 進 展 が 促 進 す る こ と が 明 ら か に さ れ た 。 フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー 解 析 で はOCH投 与 で 大 動 脈 へ のNKT細 胞 浸 潤 が 増 加 し て い る こ と が 確 認 さ れ 、 さ ら に 病 理 組 織 学 的 解 析 で は 、 マ ク ロ フ ァ ー ジ やTリ ン パ 球 が 腹 部 大 動 脈 壁 内 へ 浸 潤 ・ 活 性 化 し 、MMP活 性 の 亢 進 も 認 め た 。 ま た 、 瘤 径 の 増 大 に は 大 動 脈 解 離 の 病 態 が 関 与 し て い る こ と も 示 唆 さ れ ：NKT細 胞 は 腹 部 大 動 脈 瘤 の 進 展 に お い て 重 要 な 役 割 を 果 た し て い る こ と が 示 さ れ た 。   こ れ ま で の 研 究 で は 腹 部 大 動 脈 瘤 の 形 成 に は 細 胞 外 マ ト リ ッ ク ス 分 解 酵 素 に よ る 細 胞 外 マ ト リ ッ ク ス の 破 壊 が き わ め て 重 要 で あ り 、MMP−2やMMP￣9が 代 表 的 分 子 と さ れ て い る 。 MMP‐9お よ びMMP‐2は そ れ ぞ れ マ ク ロ フ ァ ー ジ や 血 管 平 滑 筋 細 胞 が そ の 主 な 産 生 源 で あ り 、MMPはNKT細 胞 活 性 化 に よ る 腹 部 大 動 脈 瘤 の 進 展 に 関 わ る 有 カ な 分 子 機 序 と 考 え ら れ た 。 今 回 の 研 究 で はNKT細 胞 の 活 性 化 に 伴 っ て マ ク ロ フ ァ ー ジ やTリ ン パ 球 も 活 性 化 し 、 MMPを は じ め と す る 様 々 な 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン が 分 泌 さ れ 、 腹 部 大 動 脈 瘤 の 進 展 に っ な が っ た と 考 え ら れ る 。Angn投 与 腹 部 大 動 脈 瘤 マ ウ ス モ デ ル に お い て は 、 瘤 径 増 大 の 機 序 と し て 血 管 中 膜 へ の マ ク ロ フ ァ ー ジ の 浸 潤 、MMP活 性 亢 進 に 加 え て 大 動 脈 解 離 の 合 併 が 考 え ら れ て い る が 、 こ れ ま で 大 動 脈 解 離 の 病 態 に つ い て 検 討 し た 研 究 は 数 少 な く 、NKT細 胞 な ど に よ る 慢 性 炎 症 の 関 与 が 示 唆 さ れ た 。

【 結 論 】 ア ポ リ ポ 蛋 白E欠 損 マ ウ ス にAngIlを 投 与 し た 腹 部 大 動 脈 瘤 マ ウ ス モ デ ル に お い て 、 OCHを 腹 腔 内 反 復 投 与 し てNKT細 胞 を 活 性 化 す る こ と に よ り 、 大 動 脈 組 織 へ のNKT細 胞 、 Tリ ン パ 球 お よ ぴ マ ク ロ フ ァ ー ジ の 集 簇 活 性 化 、TH1サ イ ト カ イ ンIFN‐Y発 現 亢 進 や 細 胞 外 マ 卜 リ ッ ク ス 分 解 酵 素MMPの 活 性 亢 進 が 認 め ら れ 、 さ ら に 腹 部 大 動 脈 瘤 の 進 展 が 確 認 さ れ た 。NKT細 胞 は 動 脈 硬 化 病 巣 の み な ら ず 腹 部 大 動 脈 瘤 の 進 展 に も 寄 与 し て い る こ と が 確 認 さ れ 、 免 疫 調 節 細 胞 で あ るNKT細 胞 は 腹 部 大 動 脈 瘤 の 新 た な 予 防 ・ 治 療 の 標 的 と し て 有 望 で あ る と 考 え ら れ た 。

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学 位 論 文 審 査 の 要 旨

主 査    教 授    筒 井 裕 之 副 査    教 授    松 居 喜 郎 副 査    教 授    三 輪 聡 一

学 位 論 文 題 名

ナチュラルキラーT 細胞はアポリポ蛋白E 欠損マウスにおける アンジオテンシンII 誘発性腹部 大動脈瘤の進展に寄与する

   本論文 では、アポリポ蛋白 E 欠損マ ウスにアンジオテンシン II を持続投与した腹部大動 脈 瘤 マ ウ スモ デル にお い て、 OCH を腹 腔内 反復 投与 し てナ チュ ラル キラ ー T(NKT) 細胞 を 活 性 化 す る と 、 腹 部 大 動 脈 瘤 の 進 展 が 促 進 す る こ と を 明 ら か に し た 。    審査会 の質疑応答では、3 人の審査 担当者より質問およぴ確認がなされた。まず副査松 居教授よ り以下の質問および確認があった。（1 ）アンジオテンシン II を投与していないマ ウスにOCH を投与しただけでは腹部大 動脈瘤が形成されて丶ヽないため、NKT 細胞は大動脈 瘤の進展には寄与するが、大動脈瘤の発症に関与しているとまではいえないのではないか。

(2) NKT 細胞はアンジオテンシン II 投 与により形成された腹部大動脈瘤のような特殊な大 動脈瘤の進展には寄与するが、ヒトの大動脈瘤の進展にまで関与しているとまでは言えるの か。(3) NKT 細胞が炎症を悪化させる と大動脈瘤の破裂による死亡率や死亡に至るまでの 期間も悪化したのか。それに対して申請者は実験結果を踏まえ、ワイルドタイプのマウスに OCH を投与しただけでは大動脈瘤は形 成されなぃのは事実であるが、アンジオテンシンII の 投与 によ り形成された腹部 大動脈瘤には、OCH の投与が 加わらなくともNKT 細胞数が 増 加する傾向にあり、発症への関与も考えられること、炎症の悪化により死亡率や死亡に至る までの期間に明らかな差はなかったことを回答した。

   次に副 査三輪教授より以下の質問およびコメントがあった。（ 1 ）スライドで重要なデー タを提示 する際にはポインタでそこをきちんと示すようなプレゼンテーションの工夫が必 要である 。(2) フローサイトメトリーのデータを示す場合は非特異的な検出を除外するため に 未染 色で の解 析 デー タも 同時 に示 すべき。(3) リアルタイムPCR の方法について、DNA の検出は どのように避けているのか。(4) 動物モデルとして何故高脂血症マウスやアンジオ テンシン II の投与を用いているのか、すなわち動物モデルが大動脈瘤を発症する機序がど のような ものであり、NKT 細胞がその 機序にどのように作用しているのか。また、アンジ オテンシ ンII の投与により形成された腹部大動脈瘤は何故腎動脈上に限局して形成される のか。それに対して申請者は基本的な解析手法や本動物モデルの選択に関しては知識や考察 がやや不十分な点が認められたものの既報を引用し、本動物モデルが大動脈瘤を発症する機 序はいまだはっきりとはしていないが、高脂血症が発症に必要であると考えられていること、

またアン ジオテンシンII は炎症細胞の遊走因子の発現を介してマクロファージの浸潤を惹 起し、マトリックスメタロプロテアーゼなどの蛋白分解酵素が分泌され大動脈瘤の発症に関 与すると考えられていることを回答した。

   最後に 主査筒井教授より以下の質問およびコメントがあった。（1 ）松居、三輪両教授か らもコメ ントがあったように、動物モデルが大動脈瘤を発症する 機序とNKT 細胞が大動脈 瘤を進展 する機序がどのように関連しているのかをきちんと考察することが必要。(2) ヒト の腹部大 動脈瘤でNKT 細胞の関与を示 唆する報告はあるのか、また関与しているのであれ ばNKT 細胞を活性化させる因子は何か 。それに対して申請者は既報を引用しヒ卜の腹部大

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動 脈 瘤 を フ ロ ー サ イ 卜 メ ト リ ー で 解 析 す る と 、NKT細 胞 が 集 積 し て い る こ と が 示 さ れ て い る こ と 、 ま たNKT細 胞 の 生 理 的 リ ガ ン ド は こ れ ま で は っ き り と は 同 定 さ れ て お ら ず 、 今 後 明 ら か に し て い く 必 要 が あ る こ と を 回 答 し た 。

  本 論 文 は 、NKT細 胞 が 腹 部 大 動 脈 瘤 の 進 展 に 寄 与 す る こ と を 明 ら か に し た 点 で 高 く 評 価 さ れ 、NKT細 胞 は 腹 部 大 動 脈 瘤 の 新 た な 予 防 ・ 治 療 の 標 的 と し て 有 望 で あ る 可 能 性 が 期 待 さ れ る 。

  審 査 員 一 同 は 、 こ れ ら の 成 果 を 高 く 評 価 し 、 大 学 院 課 程 に お け る 研 鑽 や 取 得 単 位 な ど も 併 せ 申 請 者 が 博 士 （ 医 学 ） の 学 位 を 受 け る の に 充 分 な 資 格 を 有 す る も の と 判 定 し た 。

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