第2章 好アルカリ性細菌Baci7／us
第2節 実験材料と方法
第1項使用菌株
好アルカリ性細菌8∂ci77usρsθudofirmus OF4−811M株（メチオニン要求性。以下 811M株）を野生株として用いた［5］。また、811M株から得られた運動性向上株である 811M−M株を用いた［4］。この運動性向上株は軟寒天培地においてコロニーの端を何 度も植え継ぐことで得られた株で、軟寒天培地において野生株よりも高い運動性を持 つ、安定した変異株である。同様の方法で得られた枯草菌の変異株と異なり［6］、この 運動性向上株のmotps遺伝子の上流に変異はなく、変異箇所は同定されていない。
第2項使用培地
OF4株の培養や運動性の計測にはアルカリ複合培地と［7］、そのNa＋濃度、 pHを調 製した派生型の複合培地を用いた。基本的なアルカリ複合培地はpH 10、Na＋濃度 230mMである（表2−1．）。Na2CO3を減らしてK2CO3を加えることによって、 pHを変え ずに、5mMから230 mMまで培地のNa＋濃度を変えた。230mM以上のNa＋濃度の培地 はNaClを加えることによって調製した。また、 Na2CO3を減らしてNaClを加えることによ って、Na＋濃度を変えずに、 pHを7．0からpH10までpHを変えた。 pH7．0未満または
pH10より高い培地はHCIまたはKOH水溶液によって調製した。すべての培地のpH
は少量のKOHまたはHCIで正確に調製した。 Na濃度は炎光光度計（AMA−175，東 京光電社）で測定し、実測値で示した。Na 駆動型べん毛モーターの阻害剤EIPA（5−（N−ethy1−N −isopropyl）−amiloride）また
はPVP（polyvinylpyrrolidone）添加による培地の粘性の影響を測定するために用いた 培地は、アルカリ複合培地（pH7、pH8、pH10、Na＋濃度230 mM）に最終濃度5〜400μMのEIPAまたは1〜5％（w／v）のPVPを加えて作製した。
軟寒天培地での運動性試験に用いた軟寒天培地は、様々なNa濃度、 pH7．5また
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表2−1．アルカリ複合培地の組成（pH 10、Na濃度230 mM）
① K，，HPO、
KH，・PO．，
MgSO1・7H20
クエン酸 ペプトン
イーストエキス15．59
4．59
0．059
0．349
59
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② グルコース
59③ Na2CO3 10．6g ／1000ml
①、②、③を別々にオートクレープ滅菌（121℃、20分間）し、空冷後、混合した。
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はpH10に調製した上記の複合培地に、最終濃度0．3％のノーブル寒天（Agar Noble）
（Difco社）を加えて作製した。
第3項べん毛染色
べん毛染色は、青野らの方法をOF4株用に改変して行った［3］。811M株および
811M−M株を50m1のアルカリ複合培地（pH 10、 Na＋濃度230 mM）に植菌し、37℃、一晩、
好気的に培養し、前培養とした。前培養液12mlをpH7．5、8、9、10、10．3の複合培地
（Na濃度はすべて230mM）1200mlに植菌し、37℃、ジャーファーメンター（PMJ−PI、エイ ブル社）で6時間培養した。pHはpHコントローラーを用いて一定を保った。活発な運動 性を示す培養開始6時間後（後期対数増殖期）の培養液を極少量、スライドガラス上に
のせ、乾燥させたあとドライヤーで熱した。2：1：0．1：0．15水溶液（10％（w／v）タンニン酸 水溶液：飽和カリウムみょうばん（potassium alum）水溶液：飽和アニリン水溶液：5％（w／v）
塩化鉄水溶液＝2：1：0．1：0．15（体積比）で混合した水溶液）で30分染色した後、アンモ
ニア性硝酸銀水溶液（2％硝酸銀水溶液に極少量のアンモニア水を加えた水溶液）で2 分染色した。明視野顕微鏡（Leica DMLB100明視野顕微鏡（1，000倍）、 Leica DC300F カメラ、Leica・IM50・version 1．20ソフトウェア（Leica Microsystems社））を使用し、顕微鏡観察し撮影した。それぞれ50細胞のべん毛の本数と長さを測定した。
第4項フラジェリンのウエスタンブロット解析
べん毛繊維タンパク質であるフラジェリン発現量を調べるため、811M株および 811M−M株を前述のようにpH7．5、8、9、10、10．3の各pHの複合培地（Na＋濃度はすべ て230mM）で培養した。培地のNa＋濃度のフラジェリン発現量に対する影響を調べる実 験では、Na＋濃度55、230、560mMの複合培地（pH7．5または10）を用いた。培養液500ml を集菌し、TSEバッファー（50mM Tris−HCI pH8．0、10％スクu一ス、1mM EDTA）で洗っ
た。TSEバッファー−50mlにけん濁し、 Protease inhibitor cocktail（SIGMA社）を加えた後、
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超音波破砕を行った。未破砕の細胞を遠心で取り除き（9，100g、15分、4℃）、上清を全 画分クルード溶液とした。BSAを基準としてn一リー法で蛋白質濃度を測定した［8］。
2xSDSサンプルバッファーを等量加えて沸騰したお湯で3分間処理した。811M株全画 分クルード溶液はタンパク質10μg分を、811M−M株全画分クルード溶液はタンパク質 1．0μg分を、12％ポリアクリルアミドSDSゲルを用いてSDS−PAGEを行った［9］。次にゲ ルをニトロセルロースフィルター（Biorad）に25Vで一晩転写した。転写にはTGMバッ
ファー（25mM Tris−HC1（pH8．3）、192mMグリシン、20％（v／v）メタノール）を用いた。
フィルターをTTBS（20mM Tris−HCI（pH7．5）、0．15M NaCl、0．05％Tween20）で洗浄
後、10％スキムミルクーTTBSで2時間ブロッキングを行い、再びTTBSで洗浄した。一次抗体反応を1／5000ウサギ抗Baci7／us psudofirmus R、AB株フラジェリン抗体（3996）を含む
10％スキムミルクーTTBSで2時間行い、TTBSで洗浄し、二次抗体反応を1／3000ヤギ抗 ウサギ抗体一HRPコンジュゲートを含む5％スキムミルクーTTBSで1時間を行った。 TTBS、TBS（20mM Tris−HCI（pH7．5）、 O．15M・1 aC1）で洗浄後、 ECL化学発光ウェスタンブロッ
ティング検出試薬（Amersham Biosciences社）を用いて検出し、イメージングシステム（Fluor−S MAX、 Bio−Rad社）を用いて撮影、定量化を行った。定量化はそれぞれのバ ンドの化学発光量から行い、それぞれの株においてpHIOで培養したものを1．0としたと きの数値で表した。三回の独立した実験を行い、その平均を示した。
811M株および811M−M株の細胞外のフラジェリン量を比較するため、各株の細胞 からべん毛繊維を調製した。べん毛繊維の調製は青野らの方法をOF4株用に変更し て行った［3］。前述のように811M株および811M−M株をアルカリ複合培地（pH10、 Na＋
濃度230mM）で培養し、集菌後、TSEバッファーでけん濁し、 OD6。。＝3．5になるよう調節 した。100mlの細胞けん濁液をミキサー（ナショナルファイバーミキサーMX−XO2）に30 秒かけてべん毛を細胞から切り離iした。遠心し（9，100g、15分、4℃）、上清に含まれるタ ンパク質（主に切り離されたべん毛の細胞外フラジェリン）を最終濃度5％（w／v）のTCA によるTCA沈殿により回収し、1mlのTSEバッファーにけん濁した。これを細胞外画分
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とした。また、細胞内フラジェリンを含むべん毛を切り離された細胞をTSEバッファーに けん濁して、超音波破砕し、未破砕の細胞を遠心で取り除き（9，100g、15分、4℃）、細 胞内画分とした。前述と同様の方法でタンパク質濃度を測定し、細胞内画分はタンパ ク質10μg分を、細胞外画分はタンパク質0．1μg分を、12％ポリアクリルアミドSDSゲ ルを用いてSDS−PAGEを行った。ウエスタンブロソト、検出、定量化も前述と同様の方 法で行った。811M−M株の細胞内および細胞外フラジェリンの量をそれぞれの画分の 811M株のものを1．0としたときの数値で表した。三回の独立した実験を行い、その平
均を示した。
第5項遊泳速度の測定
811M株および811M−M株において、液体培地中での運動性を測定した。811M株 および811M−M株を2m1のアルカリ複合培地（pH 10、 Na濃度230 mM）に植菌し、37℃、
一晩、好気的に培養し、前培養とした。前培養液200μ1をアルカリ複合培地（pH 10、
Na＋濃度230 mM）200mlに植菌し、37℃で好気的に培養した。活発な運動性を示す培 養開始6時間後（後期対数増殖期）の細胞をO．45 pt m径のOMNIPORメンブレンフィ ルター（ミリポア社）で集菌し、様々なpH・Na＋濃度、粘性条件の培地にけん濁して37℃、
10分間、振とう培養した。ハンギングドロップ法によって暗視野顕微鏡（Leica
DMLB100暗視野顕微鏡（400倍）、 Leica DC300Fカメラ、 Leica IM50 version 1．20ソフ
トウェア（Leica Microsystems社））を用いて顕微鏡観察し、「劇場版ディスプレーキャプ チャーあれ」（http：／／www．vector．co．jp／soft／win95／art／se221399．html）を用いて録画した。録画したビデオからそれぞれ20個の遊泳中の細胞の2秒間の移動距離を測定し、
遊泳速度（μm／sec）を求めた。三回の独立した実験を行い、その平均を示した。
第6項軟寒天における運動性分析
811M株および811M−M株の軟寒天培地での運動性を0．3％ノーブル寒天（Agar
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Noble）（Difco社）で固めた複合培地（様々なNa＋濃度、 pH7．5またはpH10）において測 定した。811M株および811M−M株を2mlのアルカリ複合培地（pH 10、Na＋濃度230 mM）に植菌し、37℃、一晩、好気的に培養した。1μ1の培養液を軟寒天培地の中央に スポットし、37℃、16時間後広がったコロニーの直径を測定した。三回の独立した実験 を行い、その平均を示した。
第7項テザードセル分析
811M株および811M−M株の単独のべん毛モーターの性能にっいて調べるためテザ ードセル分析を行った［10］。811M株および811M−M株を2mlのアルカリ複合培地（pH 10、Na＋濃度230 mM）に植菌し、37℃、一晩、好気的に培養した。スライドガラス
（MATSUNAMI S−2215、松浪ガラス工業）にカバーガラス（MATSUNAMI
NEO（24x32mm）、松浪ガラス工業）を両面テープで固定した。50μ1の培養液をスライド ガラスとカバーガラスの間に入れ、カバーガラス側を下にして15分間、37℃に置いた。
50μ1のアルカリ複合培地（pH 10、 Na＋濃度230mM）を通路に導入し、反対側からろ紙 で吸い取ることでガラスに吸着していない細胞を洗い流した。この操作を3回繰り返し た。暗視野顕微鏡（Leica DMLB100暗視野顕微鏡（400倍）、 Leica DC300Fカメラ、
Leica IM50 version 1．20ソフトウェア（Leica Microsystems社））を用いて顕微鏡観察し、
「劇：場版ディスプレーキャプチャーあれ」（http：／／www。vector．co．jp／soft／win95／art／
se221399．html）を用いて回転しているテザードセルを録画した。各株10個の大きさが ほぼ同じテザードセルの回転速度（Hz）、および細胞の長さ（μm）をビデオから測定し
た。
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