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図3−3．ncbA −ec17コ断片、θαρ断片の構築の概略図
上にBaev7／usρsθudofirmus O F4株の染色体のncbA遺伝子座、下にncb．4 ecip断片（A）、θφ 断片（B）の概略図に示し、使用したプライマーの位置を示した。
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を表3−4．に示した。まずBa ci7／us pseudofirn？us O F4−8 1 1 M株（野生株）の染色体DNAを
テンプレートに、N C−Fl−SC2とNC−Rl−1、N C−F2−1とNC−R2−BH1という組み合わせで
プライマーを用いて二つの独立したPCRを行った。また、 pECFPプラスミドをテンプレ ートに、NC−F−CFPIとNC−R−CFP1の組み合わせでプライマーを用いてPCRを行い θoφ遺伝子を増幅した。精製したこれら三っのPCR産物をテンプレートにNC−F1−SC2 とNC−R2−BHIをプライマーに用いて2回目のPCRを行い、rrchA一θeip断片を得た。精製した刀o胡一θoφ断片をEcoR Iで消化し、 EcoR Iで消化したpMW118にクローニン グし、pMWSC−CFPを構i築した。クローニングの宿主としては大腸菌DH5α株を使用し た。pMWSC−CFPをBan？H 1およびHind Mで消化し、8∂mH Iおよびthhd皿で消化し たpYHMWの大きい断片（5．Okb）とライゲーションしてpSC−CFPを構1築した。このプラス ミドはncbAのプロモーターの制御によりNa、BP−CFPを発現する。
ecth断片（図3−3B）、 pMWCFP、 pCFPを同様の方法で構築した。 pCFPはncbAのプロ モーターの制御によりCFPを発現する。クローンニングしたnebA−eefO断片およびecfO 断片の配列はDNAシークエンサーを使用して確認した。プロトプラスト法によりこれら
のプラスミドでSC34株（NavBP欠損株）を形質転換した［34］。
第4項ウエスタンブロット解析
Baci77us psθudofirn？us OF4各株を1mlのMYE培地（pH10）で上記のように一晩培養 し、前培養とした。1m1の前培養液を100mlのMYE培地（pH10）に植菌し、 OD6。。＝0．6 まで培養した。8∂cW5 subti7is（枯草菌）はLB培地で前培養し、1mlの前培養液を 100mlのLB培地に植菌し、同様にOD6。。＝0．6まで培養した。各細胞を集菌し、 TSEバ
ッファー（50mM Tris−HCI pH 8．0，10％スクロース，1mM EDTA）で洗浄後、同じバッフ
ァーに再懸濁し、プロテアーゼインヒビターカクテル（Sigma−Aldrich社）とDNase（50μg／m1）を加えた。超音波破砕により破砕し、未破砕の細胞を遠心（9、100 g、15分、
4℃）で除き、全画分クルード溶液を調製した。超遠心（40，000rpm、90分、70Tiロータ
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一（Beckman社）、4°C）し、ペレットをTSEバッファーに懸濁して、プロテアーゼインヒ ビターカクテルを加え、膜画分クルード溶液を調製した。タンパク質濃度はBSAを基 準にm・一一リー法で測定した［35］。2xSDSサンプルバッファーを等量加えて沸騰したお 湯で3分間処理した。811M株全画分クルード溶液はタンパク質10μg分を、811M−M 株全画分クルード溶液はタンパク質1．0μg分を、12％ポリアクリルアミドSDSゲルを用 いてSDS−PAGEを行った［36］。次にゲルをニトロセルロースフィルター（Biorad）に25V で一晩転写した。転写にはTGMバッファー（25mM Tris−HCI（pH8．3）、192mMグリシン、
20％（v／v）メタノール）を用いた。
ウエスタンブロット解析で用いたウサギ抗B∂ci17us鉗九治McpBポリクローナル抗体 はG．W．Ordal博士（イリノイ大学）から、マウス抗Nav BPモノクローナル抗体は D．ECIapham博士（ハーバード大学）に分与して頂いたものを使用した。
Bacf／／us 5μ6〃治（枯草菌）のMcpB、 Ba ei7／us pseudofiri7？us O F4各株のMcpXの検出 は以下の通りに行った。フィルターをTTBS（20mM Tris−HC1（pH7．5）、0．15M NaCl、
0．05％Tween20）で洗浄後、10％スキムミルクーTTBSで2時間ブロッキングを行い、再び TTBSで洗浄した。一次抗体反応を1／2000ウサギ抗Baci77us subtths McpB抗体を含 む10％スキムミルクーTTBSで2時間行い、 TTBSで洗浄し、二次抗体反応を1／3000ヤ ギ抗ウサギ抗体一HRPコンジュゲート（Biorad社）を含む5％スキムミルクーTTBSで1時間
を行った。TTBS、丁BS（20mM Tris−HCI（pH7．5）、0．15M NaCl）で洗浄後、 ECL化学発
光ウェスタンブロッティング検出試薬くAmersham Biosciences社）を用いて検出し、イメージングシステム（Fluor−S MAX、 Bio−Rad社）を用いて撮影した。
Na＼BP−CFPおよびCFPの検出にはCan Get Signal Immunoreaction Enhancer Solution（TOYOBO社）を説明書に従って使用した。一次抗体反応には1／250（全画分 の解析）または1／1000（膜画分の解析）ウサギ抗GFPポリクローナル抗体（Clontech社）、
二次抗体反応には1／3000ヤギ抗ウサギ抗体一HRPコンジュゲート（Biorad社）を用いた。
その後ECL化学発光ウェスタンブロッティング検出試薬（Amersham Biosciences社）を
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用いて検出し、イメージングシステム（Fluor−S MAX、 Bio−Rad社）を用いて撮影した。
Na＼BPはマウス抗Na、BPモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロットでは全画分に も膜画分にも検出できなかった。
第5項免疫蛍光顕微鏡観察
免疫蛍光顕微鏡観察は平賀らの方法をBaα7／us pseudofirmus O F4株用に改変して
行った［37］。B∂Ci7／us pseudofirmus OF4各株をウエスタンブロット解析で述べた様に培
養し、OD，。。＝0．6になったところで菌を固定した。ニフェジピン処理を行う実験では OD6。。＝0．6になったところで最終濃度50μMのニフェジピンを加え、一時間培養を続 けた後、固定した。固定は10mlの70％エタノールにlmlの培養i液を加え、1時間室温 で放置し行った。スライドグラス（S−2215、NATSUNAMI社）に1mg／mlポリーL一リジン水 溶液20μ1スポットし、20分間乾燥させ、蒸留水で洗い再び乾燥させた。エタノール固定した細胞を遠心（700g、15min、4℃）により回収し、1m1の70％エタノールに再けん濁し た。ポリーL一リジンコーティングされたスライドグラスにエタノール固定した細胞けん濁液 10μ1をスポットし、20分乾燥させた。リゾチーム溶液（2．Omg／ml lysozyme，25mM Tris−HCI pH8．0，50mMグルコース，10mM EDTA）10μ1をスポットの上に乗せ、5分間 インキュベート後、4mlのPBSTE溶液（140 mM NaCl、2 mM KCI、8mM Na2HPO4、1．5 mM KH2PO4、0．05％Tween20、10mM EDTA、 pH8．0）で3回洗浄した。スポットを50 rd のPBSTE−2％BSA溶液で覆い、15分間インキュベートした。1次抗体溶液（1／1000マ
ウスNa＼BPモノクローナル抗体、1／2000ウサギ抗McpBポリクローナル抗体、
PBSTE−2％BSA（pH8．0））50μ1をスポットに乗せ、チャンバー中で1時間インキュベート した後、5m1のPBSTE溶液（pH8．0）で3回洗浄した。スポットを50μ1のPBSTE−BSA 溶液で覆い、15分間インキュベートした。2次抗体溶液（1／1000Alexa Fluor 488
rabbit anti−mouse lgG（Molecular Probe社）、1／1000 Alexa Fluor 546 goat anti−rabit
IgG（Motecular Probe社）、 PBSTE−2％BSA（pH8．0））50μ1をスポットに乗せ、遮光したチ
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ヤンバー中で1時間インキュベートした後、5mlのPBSTE溶液で3回洗った。
O．85％NaC1水溶液5μ1をスポットのせてカバーグラスをし、エナメルで封じた。 Imaging workstation FW4000（Leica Microsystems社）で顕微鏡観察し、写真を撮影した。
Photoshop CSソフトウェア（Adobe Systems社）を用いて重ね合わせ画像（Overlay＞を作 製した。撮影した各画像の蛍光スポットを2人の観測者によってカウントした。このスポ ットが細胞上のどこに存在するかを観察することにより、McpXおよびN av BPの細胞内
局在を、A：片極（One pole）、 B：両極（Two poles）、 C：片極と側面（One・Pole・and・side（s））、
D：両極と側面（Two poles and side（s））、 E：側面（Side（s））、拡散（局在しておらずほぼ均
一に存在、）に分類した。また画像からOF4各株の細胞の長軸（長さ）と短軸（幅）（μm）
を測定した。1回の実験で少なくとも30細胞の観察、定量化を行い、独立した実験を3
回行った。
第6項NayBP−CFP融合タンパク質またはCFPの細胞内局在の観察
プロトプラスト法を用いてB∂ci7／us pseudofirn？us OF4−SC34株（Na＼BP欠損株）を
pSC−CFPおよびpCFPプラスミドで形質転換し［34］、SC34／pSC−CFPおよびSC34／pCFP形質転換株を得た。これらの形質転換株をウエスタンブロット解析で述べ た様にMYE培地（pH10）でOD6。o＝0．6まで培養した。極少量の培養液を0．5％のアガロー
スでコーティングしたスライドガラスにスポットし、Imaging workstation FW4000（Leica
Microsystems社）で顕微鏡観察し、写真を撮影した。 Photoshop CSソフトウェア（Adobe Systems社）を用いて重ね合わせ画像（Overlay）を作製した。撮影した画像からNay BP−CFPおよびCFPの細胞内局在、 A：片極（One pole）、 B：両極（Two poles）、 C：片 極と側面（One Pole and side（s））、 D：両極と側面（Two poles and side（s））、 E：側面
（Side（s））、拡散（局在しておらずほぼ均一に存在、）に分類し、定量化した。1回の実験
で少なくとも30細胞の観察、定量化を行い、独立した実験を3回行った。75
第7項ミグレーション分析
軟寒天培地での運動性、走化性を調べるためミグレーション分析を行った。Bn・ci7／us psθudofirmus OF4各株をウエスタンブロット解析で述べた様にMYE培地（pH10）で
OD6。。＝0．6まで培養した。最終濃度0．3％のノーブル寒天（Agar Noble）（Difco社）を含む
MYE軟寒天培地（pHIO）に、1μ1の培養液をスポットし、37℃、10時間培養し、コロニ ーの直径（mm）を測定した。独立した実験を3回行った。第8項タンブリング頻度の分析
Ba・Ci7／us psθudofirmus OF4各株をウエスタンブロット解析で述べた様にMYE培地
（pH10）でOD600＝O．6まで培養した。ハンギングドロップ法によって暗視野顕微鏡（Leica
DMLB100暗視野顕微鏡（400倍）、 Leica DC300Fカメラ、 Leica IM50 version 1．20ソフ
トウェア（Leica Microsystems社））を用いて顕微鏡観察し、タンブリング頻度を観察した。
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第3節結果
第1項McpXとNa， BPの細胞の極での共局在と、Na，BP欠損株におけるMcpXの脱 局在化
Bac？7／us psθudofirn？us OF4株において、走化性レセプター（MCPs）の特徴や、それを
コードする遺伝子は同定されていない。しかし、MCPsのシグナルドメインは保存性が 高く、抗MCP抗体を用いたウエスタンブロット解析や免疫蛍光顕微鏡観察（IFM）にお いて異なる属の細菌のMCPsも検出できるという報告がある［25］。そこで同じ8∂α批s 属細菌である枯草菌（BaCi7／u∬ubti／is）の抗McpB抗体を使用したウエスタンブロット解 析でOF4株において交差反応するタンパク質があるかどうか確認した（図3−4）。この抗 McpB抗体はウエスタンブロット解析において枯草菌においてMcpBとMcpAを検出す ることが報告されており［26］、実際に枯草菌の全画分からは両方が検出された。枯草 菌のMcpBのバンドの位置は図3−4に矢印で示した。 B∂ci77u5 pseudofirn？us OF4野生 株（811M株）の全画分からは一っのバンドのみが検出され、その位置は枯草菌の McpBとほぼ同じであった。そこでこのOF4株から検出されたタンパク質を推定上の走 化性レセプターMcpXと名づけた。 McpXはNa㌦BP欠損株（SC34株）や、 Na＼BP欠損株 の染色体にncbA遺伝子を戻したNa．BP回復株（SC34−R株）においても検出された。McpXの発現量は3つの株においてほとんど変わらなかった。
次に抗McpB抗体と、抗Na＼BP抗体を用いた免疫抗体顕微鏡観察（IFM）を行い
Baci77us pseudofirn？us OF4各株のMcpXおよびNa， BPの細胞内局在を観察した（図 3−5．）。この画像の蛍光スポットを2人の観測者（伊藤、藤浪）によってカウントした（図 3−6）。このスポットが細胞上のどこに存在するかを観察することにより、McpXおよび
Na，BPの細胞内局在を、 A：片極（One pole）、 B：両極（Two poles）、 C：片極と側面（One Pole and side（s））、 D：両極と側面（Two poles and side（s））、 E：側面（Side（s））、拡散（局在し
ておらずほぼ均一に存在、）に分類した（表3−5）。
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