三＿ノ㊥
B． もしもNavBPがべん毛モーターと相互作用するのであれば、周毛性のべん毛（第2章参照）と共 局在し、NavBPは細胞の極には局在しないと考えられた（図3−1）。
A
人 ，−h・R
、
Cnぜピ
・ 〉㍗・…
第2節実験材料と方法
第1項使用菌株、使用プラスミド
使用した菌株は表3−Lに、使用したプラスミドは表3−2．示した。大腸菌と枯草菌は LB培地（トリプトン10g，イーストエキス5g， NaCl 10g／1000ml， NaOHでpH7．0から pH7．4にあわせてオートクレープ滅菌）で培養した。 ncb．4遺伝子を含む断片のクロー ニング時にはLBK培地（トリプトン10g，イーストエキス5g， KCI 6g／1000ml， KOH水溶 液でpH7．5にあわせてオートクレープ滅菌）を用いた。
好アルカリ性細菌β∂o〃μsρ5θαdo㎜αs OF4野生株（811M株）とその派生株はpH10 に調整したMYE培地（semi−de6ned里alate一Σeast gxtract medium、リンゴ酸イーストエ キス半限定培地）［30］を用いて、37℃で好気的に培養した。MYE培地は本来p卜110．5 だが、pH10．5ではSC34株（Na、BP欠損株）の生育が悪くなるため［5］、OF4株とすべて のその派生株pH10のMYE培地を用いて培養した。 MYE培地（pH10）の組成は表3−3．
に示した。抗生物質を加える場合には5μg／mlクロラムフェニコールまたは0．3μ g・ ml
エリスロマシンを加えた。
第2項BaCi7／us pseudofirD？us OF4株のoheA LV遺伝子の破壊
Baci17us pseudofirn？us OF4株のc加A〃遺伝子（NCBI accession number
DQ150110）をクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ca t）で置き換え
た断片をGene SOEing法によって構築した［33］。概略図を図3−2．に、使用したプライマ ーを表3−4．に示した。まずBaci77us pseudofirn？us O F4−81 1 M株（野生株）の染色体DNA をテンプレートに、del−AW−F1−BH1とdel−AW−R1、 del−AW−F2とdel−AW−R2−ERIと いう組み合わせでプライマーを用いて二っの独立したPCRを行った。すべてのPCRにはPfx DNAポリメラーゼ（lnvitrogen社）を用いた。また、 pC194プラスミドをテンプレート
に、del−AW−F−CAT and del−AW−R−CATの組み合わせでプライマーを用いてPCRを62
表3−1使用した菌株
菌株 遺伝子型または説明
リファレンス大腸菌（E．coff）
DH5 a MCR株
XLI−BlueMRF 株
枯草菌（B∂Ci7／u∬ubt」rrs）
168株
B∂eil／us psθudofirn？us O F4株
811M株（野生株）
SC34株（NavBP欠損株）
SC34−R株（Na＞BP回復株）
811M−cheAW株（o力巳4レレ破壊株）
F−Zη㏄・4ムノ（ノηノア訪5ゴ兄幡一merBO
Φ80ロソ∂cZ△（lac−｝t4 argfi）乙ゾ69 deo」？
ノ「θ乙4ノθndA／su）oE44／〜t力∫一ノ8）・アー496
reZA 1
△（mcr．4ノ∫83△（fi？crCB−frsd∫．切〜一ηriジノ73
θノ7由1suρE44 th∫−1ノ「ec．4／gylン496 rel．A〜
！ac［F proAB、／acjoZL）ル〃57｝？10（Tetr）］
trρc2
wild−type， Met−
811M△」ワcb4：：SpcR
SC34， ncbA restored
811M， che4 L V disrupted
Stratagene社
GIBCO／BRL社
BGSG（a）
［29］
［5］
［5］
本研究
（a）BGSG：Ba ci7fus Genetic Stock Center、
63
表3−2．使用したプラスミド
プラスミド
説明
リファレンスpC194
pMWI18
pG＋host4
pG4△cheAW二：CAT
pECFP
pMWSC−CFP pYH30pYHMW1
pSC−CFP
pMWCFP pCFP
Staphy／ococcus∂ureus由来のプラスミド、クロラムフ ェニコール耐性（CmR）
クローニング用ベクター、アンピシリン耐性（AmpR）
温度感受性ベクター、エリスロマシン耐性（ErmR）
pG＋host4＋△cheAW：：CAT ECFP発現ベクター
pMW118＋ncbA一θcφ
pGEM3Z絃＋）（Promega社）とpBD144をPstl部位でライ ゲーションしたプラスミド
pYH30とpMW118をXb∂1−thhdlll部位でライゲーショ
ンしたプラスミド、大腸菌とBa Ci7／us属細菌の低コピーシャトルベクター
pYHMW1＋ncb、4一θφ
pMW118＋θcφ pYHMW 1＋eciP［31］
Nippon Gene社 Appligene社 本研究
Clontech社：本研究
［32］
本研究
本研究 本研究 本研究
64
表3−2A． MYE培地（semi−defined malate−yeast extract medium）
①
②③④⑤⑥
Na2CO3
NaHCO3
1M K2HPO，水溶液
IM MgSO4水溶液 10％イーストエキス水溶液50mM Sodium Malate（リンゴ酸ナトリウム）水溶液
x100 STS（表3−2B．参照）
9．549 0．849
1m1 0．1ml
lOm1
50ml
10ml ／1000ml
①を約800mlのミリQ水に溶かし、別々にオートクレープ滅菌（121℃、20分間）した②〜⑥を加 えた。HCIを加えてpHIOにあわせ、1000mlまでメスアップし、フィルター滅菌した。
寒天培地を作製する際には、①を約300mlのミリQ水に溶かし、別々にオートクレープ滅菌
（121℃、20分間）した②〜⑥を加えた。HCIを加えてpH10にあわせ、500mlまでメスアップし、フィ
ルター滅菌して2xMYE培地を調整した。500mlの水に15gの寒天を加えてオートクレープ滅菌（121℃、20分間）し、500mlの2xMYE培地を加えて固めた。
65
表3−2B． STS
①②③④⑤⑤
N itrilotriacetic Acid（NTA廿ee acid、ニトリロ三酢酸）KOH（＊）
CaCI2°2H20
Ammonium Molybdate（7一モリブデン酸一6一アンモニウム4水和物）
FeSO㍗7H20
Metals 44（表3−2C．参照）
209
14．59
6．79
0．029 0．29
100ml ∵1000ml
①を約800mlのミリQ水に溶かした後、②を加えた。その後③〜⑥を順番に加え、pHをKOHで
6．8に調製した。
（＊）②の代わりにNaOH正Ogを加える方法もある。
表3−2C． Metals 44
EDTA（Free acid）（＊）
ZnSO4・7H20
FeSOt・7H20
MnSO4
CuSO，，
Co（NO3）2・6H20
Na2B407・IOH，O
2、59 10．959 5．09 1．549
0．399
0．259
0．18g ／1000m1
約800m1のミリQ水に上から順番に加えた。完全に溶けてから次の化合物を加えた。沈殿を遅ら せるため、数滴の濃硫酸水溶液を加えた。
（＊）温めて溶かした。
66
トー一］「
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che4 cheY＿」ユi
」 ←と del−46入W賞＿Rl
コどし ギご
→ 十
de］−AW−RL］−FRI
cat
＿＿z−
del−AW−F，・⊃AT → 司一一 ヨel−AW−R．CAT
図3−2．ch e．4 LV遺伝子破壊用断片の構築の概略図
上にBa Ci77us psθu dofirn？us O F 4株の染色体のo力a→ル遺伝子座、下にche．−UV遺伝子破壊用断
片の概略図に示し、使用したプライマーの位置を示した。
この断片をpG＋host4プラスミドにクローニングし、 pG4△cheAW：：CATプラスミドを構築した。
67
表3−4．使用したプライマー
プライマー 酉己 ll （5 −3 ）
del−AW−F1−BHl del−AW−R1
del−AW−F−CAT
del−AW−R−CAT
del−AVV−F2
del−AW−R2
OF4cheA3 0F4cheA15
OF4cheA24 0F4cheA25
NC−Fl−SC2
CGGCATCCTGGTGAGTTTATCTCGATTGC GTCTAAATCAATTTTATTAAAGTTCATCAAG CTCTTGTTCACCTCAATGG
CCATTGAGGTGAACAAGAGCTTGATGAACT TTAATAAAATTGATTTAGAC
CCTTTGCTCTATGTATTTATTTCTTTCATTA TAAAAGCCAGTCATTAGGCC
GGCCTAATGACTGGCTTTTATAATGAAAGA AATAAATACATAGAGCAAAGG
CGGAATTCTAGTCGTATGATCGTCACCAG
TGAGAGCCTAGAAGCAGCAT TGACGATGCCGCCTAATGATTC
CGCGATGTGTATCAAGAGTTCTC CCGGTGAGGGTGACCATATTCATT
TTTCCGCGGGCCCTTAGGAGGAATTCTGT
68
Accession number
DQ150110（180→200）
NCOO2013（1286→1260（minus strand））， DQ150110（1044→
1022（minus strand））
DQ150110（1022→1044），