B
図3−6．免疫抗体顕微鏡観察（IFM）によるβ∂o伽ぷρ5θ固o励加50F4各株におけるMcpXとNavBP
の細胞内局在の分類図3−5．に示した画像から二人の観測者によりスポットを観測し、各画像の下に示した。（A）811M 株（野生株）、SC34株（NavBP欠損株）、 SC34−R株（NavBP回復株）、811M−cheAW株（c加4↓レ破壊
株）。（B）50uMのニフェジピンで処理した811M株。 McpXおよびNavBPの細胞内局在を、 A：片極
（One pole）、 B：両極（Two poles）、 C：片極と側面（One Pole and side（s））、 D：両極と側面（Two poles
and side（s））、 E：側面（Side（s））、拡散（局在しておらずほぼ均一一に存在、）に分類した。
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表3−5．NavBPとMcpXの共局在の定量化
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）NavBPが極にのみ局在した細胞においてMcpXが極に共局在した割合（％）を示した。
）NavBPが極に局在した細胞（A−Dの合計。少なくとも片極に局在した細胞。）においてMcpXが極
共局在した割合（％）を示した。）McpXが極にのみ局在した細胞においてNavBP極に共局在した割合（％）を示した。
）McpXが極に局在した細胞（A−Dの合計。少なくとも片極に局在した細胞。〉においてNavBPが極
共局在した割合（％）を示した。1
野生株（811M株）では93％の細胞でMcpXが極に局在していることが観察された。こ れは枯草菌での報告と同様の結果であった［26］。さらに野生株（811M株）では92％の細 胞でNa，BPが極に局在していることが観察された。野生株（811M株）では、 Na＼BPの極 での局在が観察された細胞のうち90％の細胞ではMcpXも極に局在しており、McpXの 極での局在が観察された細胞のうち94％の細胞ではNav BPも極に局在していた。野生 株（811M株）細胞では、多くの場合、 Na，BPとMcpXが極で共局在していることが分か
った。
Nav BP欠損株（SC34株）では抗Na＼BP抗体の特異的なシグナルはほとんど観察さ れなかった。Na＼BP欠損株（SC34株）ではMcpXの極での局在性は著しく低下していた
（15％）。NavBP欠損株（SC34株）においても、McpXの発現量は野生株とほぼ同じである ため（図3−4）、McpXが局在化せずに拡散しており、膜にほぼ均一に発現していること
（脱局在化）が示唆された。Na＼BP回復株（SC34−R株）ではこのようなMcpXの脱局在化 は観察されなかった。Na＼BP回復株（SC34−R株）では、野生株（811M株）とほぼ同様の Na、BPとMcpXの局在性を示した。
免疫蛍光顕微鏡観察の結果からOF4各株の細胞の長軸の長さを測定したところ、
野生株（811M株）は1．95±O．44μm、 Na、BP欠損株（SC34株）は1．65±0，36μm、
Na＼BP回復株（SC34−R株）は2．43±0．55μmで有意な差は見られなかった。後述する 811M−cheAW株（e力θA W破壊株）は2．39±0．63μm、 SC34／pSC−CFP株は2．25±
0．45μm、SC34／pCFP株は2．13±0．55μmで、同様に有意な差は見られなかった。
また細胞短軸の長さを測定したところ、野生株（811M株）は0．82±0．05μm、 Na、BP 欠損株（SC34株）は0．82±0．05μm、Na＼BP回復株（SC34−R）は0．84±0．05μm、
811M−cheAW株（cfreA W破壊株）は0．84±0．06μm、 SC34／pSC−CFP株は0．84±
0．05μm、SC34／pCFP株は0．85±0，04μmで、有意な差は見られなかった。
これらの結果からNa＼BP欠損株（SC34株）で見られた走化性の異常はNa、BP欠損 によって生じるMcpXの脱局在化が原因である可能性が示唆された。
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野生株（811M株）はNavBPの阻害剤であるニフェジピン（最終濃度50μM）存在下で は、Na＼BP欠損株（SC34株）と同様に反対の走化性を示すことが報告されている［5］。そ こでニフェジピン処理（最終濃度50μM）で処理した野生株（811M株）細胞のNa、BP、
McpXの局在性を免疫抗体顕微鏡観察（IFM）によって確認した（図3−5B、図3−6B）ニ フェジピン処理した細胞のNa、BP、 McpXの局在性は野生株とほぼ変わらず、脱局在 化は起こっていなかった。
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第2項eheA IV欠損株におけるMcpXとNa，BPの極での局在性の低下
BaCi7／usρsθudofirm us OF4株の全ゲノム配列は明らかになっておらず、抗McpB抗
体で検出したOF4株の推定上のMCPであるMcpXの遺伝子は同定されていない。
それゆえMcpXをコードする遺伝子を欠損させ、Na、 BPの局在化への影響を調べるこ とは不可能である。大腸菌ではcheA W遺伝子を破壊するとMCPの極での局在性が 低下することが知られている［17］。そこで野生株（811M株）のc加Aル遺伝子を破壊し
（図3−2）、811M−cheAW株（o加Aル破壊株）を構築した。
抗McpB抗体を用いたウエスタンブロットを行ったところ、811M−cheAW株（cheA・Vt／
破壊株）のMcpX発現量は他のOF4各株とほぼ変わらなかった（図3−4）。
抗McpB抗体と、抗Na、 BP抗体を用いた免疫抗体顕微鏡観察（IFM）を行ったところ、
811M−cheAW株（eheA W破壊株）のMcpXおよびNa＼BPの極での局在性は野生株に 比べて低下していた（図3−5）。811M−cheAW株（c加A膨破壊株）では33％の細胞でのみ McpXが極に局在していることが観察されず、このような細胞のうち51％の細胞では NavBPとの共局在が観察された。また33％の細胞でのみNa＼BPが極に局在しているこ とが観察され、このような細胞のうち50％の細胞ではMcpXとの共局在が観察された（図
3−6．、表3−5）。
また、811M−cheAW株（cheA W破壊株）の細胞長軸および短軸の長さは2．39±0．63 μmおよび0．84±0．06（μm）であり他の株と有意な差は見られなかった（表3−7）。
これらの結果からNa、 BPとMcpXは極での局在性に関して相互依存的であるある可 能性が示唆された。
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第3項Na、 BP欠損株においてプラスミド上から発現させたNayBP−CFPの極での局在 生細胞内でのNav BPの細胞内局在を観察するため、Na、 BP−CFPを発現するP SC−CFPプラスミド、またはCFPを発現するpCFPプラスミドでNa＼BP欠損株（SC34株）
を形質転換し、SC34／pSC−CFP株およびSC34／pCFP株を構築した。 SC34／pSC−CFP 株およびSC34／pCFP株をMYE培地（pH10）で培養し、抗GFP抗体を用いたウエスタ ンブロットを行い、NavBP−CFPまたはCFPの発現を確認した（図3−7）。 Na＼BP−CFPの バンドは全画分及び膜画分に（白矢印）、CFPのバンドは全画分に確認できた（黒矢印）。
Na、BP−CFPは膜画分に、 CFPは細胞内画分に発現していることが示唆された。
抗Na＼BP抗体を用いたウエスタンブロットも試みたが、特異的なバンドは検出できな かった。この抗Na＼BP抗体は変性したNa，BPを検出できず、3次元構造を保っている
Na、 BPのみを検出すると考えられた。
SC34／pSC−CFP株のNa，BP−CFPおよびSC34／pCFP株のCFPの細胞内局在を蛍
光顕微鏡で観察した（図3−8）。Na＼BP−CFPはほとんどの場合、極に局在したが、 CFP
は局在していなかった（表3−6）。
また、SC34／pSC−CFP株の細胞長軸および短軸の長さはそれぞれ2．25±0．45μm および0．84±0．05（μm）、SC34／pCFP株の細胞長軸および短軸の長さはそれぞれ 2．13±0．55μmおよび0．85±0．04（μm）であり、他の株と優位な差は見られなかった
（表3−7）。
第4項Baci！／us pseudofirmus OF4各株のミグレーション分析とタンブリングバイアス 五ρぷθα∂o㎜∬OF4各株を用いて、軟寒天培地でのミグレーション分析（遊走分析）
および液体培地でのタンブリングバイアスの観測を行い、Na＼BPの影響を調べた（図
3−9、表3−8）。
既に報告されているように［5］、SC34株（Na，BP欠損株）では野生株に比べてコロニ ーが小さくなり、タンブリングバイアスになった。また染色体上にNa＼BPをコードする
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図3−7．Baci7／us psθudofirmus O F4株とその変異株の全画分および膜画分のNa、 BP−CFPまたは
CFPのウエスタンブロット解析
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抗GFP抗体を用いてBaci77us psθudofiri7？us O F4各株のNavBP−CFPまたはCFPをウエスタン
ブロット解析した。（A）全画分。（B）膜画分。使用した株を上に示した。Na＞BP−CFPのバンドの位置を白矢印、CFPのバンドの位置を黒矢印で示した。
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