3.3 結果・考察
3.3.3 分解生成物の構造解析
Fig. 3.41: 1H-NMR spectrum of the lipase-catalyzed degradation products ofsyn-P(3HB)a).
a)0.5 % P(3HB) toluene solution was stirred with 800 wt.-% Novozym°r 435 at 40 oC for 24h.
1H-NMR (270 MHz: CDCl3) : δ = 1.22～1.33 (–O–CHCH3–CH2–CO–O–, 3H, m), 2.41～2.63 (–O–CHCH3–CH2–CO–O–, 2H, m), 5.16～5.37 (–O–CHCH3–CH2– CO–O– , 1H, br)
こで、本項ではMALDI-TOF MSを用いた分解生成物の経時変化解析を行った。分解生 成物のMALDI-TOF MSスペクトルを分解反応時間順にFig. 3.44～3.53に示した。
Fig. 3.44～3.53の解析より、18 m/zの間隔を有する一組のスペクトルがモノマーユニッ トの分子量である86.09間隔に現れることが明らかになった。分解生成物中には水酸基末 端型と環状型のみが存在するため、18 m/zの間隔を有する一組のスペクトルの中で分子 量の大きいピークが水酸基末端型に帰属され、小さいピークが環状型に帰属される。した がって、本分解反応は環状型オリゴマーを主成分とした分解生成物を与える特徴を有して いることが明らかになった。そこで、得られたオリゴマー混合物のMALDI-TOF MSス ペクトルをC´ordovaらの方法17)にしたがって解析し、スペクトル積分値から混合物中の ナトリウム付加体について組成比を30量体までの範囲で計算した。計算結果をFig. 3.43 にまとめた。環状型オリゴマーの生成機構についてはここでは考察せず、後の分解反応機 構についてに詳細を記した。
Fig. 3.42: Structures of mixtures that was included in the crude degradation products of syn-P(3HB) obtained by the lipase-catalyzed degradation.
Fig. 3.43: Time course of structual composition of the degradatioin products.
Fig. 3.44: MALDI-TOF MS spectrum of the lipase-catalyzed degradation products of syn-P(3HB). (Table 3.13: Entry 2; 1 h-degradation)
Fig. 3.45: MALDI-TOF MS spectrum of the lipase-catalyzed degradation products of syn-P(3HB). (Table 3.13: Entry 3; 2 h-degradation)
Fig. 3.46: MALDI-TOF MS spectrum of the lipase-catalyzed degradation products of syn-P(3HB). (Table 3.13: Entry 4; 3 h-degradation)
Fig. 3.47: MALDI-TOF MS spectrum of the lipase-catalyzed degradation products of syn-P(3HB). (Table 3.13: Entry 5; 6 h-degradation)
Fig. 3.48: MALDI-TOF MS spectrum of the lipase-catalyzed degradation products of syn-P(3HB). (Table 3.13: Entry 6; 9 h-degradation)
Fig. 3.49: MALDI-TOF MS spectrum of the lipase-catalyzed degradation products of syn-P(3HB). (Table 3.13: Entry 7; 12 h-degradation)
Fig. 3.50: MALDI-TOF MS spectrum of the lipase-catalyzed degradation products of syn-P(3HB). (Table 3.13: Entry 8; 15 h-degradation)
Fig. 3.51: MALDI-TOF MS spectrum of the lipase-catalyzed degradation products of syn-P(3HB). (Table 3.13: Entry 9; 18 h-degradation)
Fig. 3.52: MALDI-TOF MS spectrum of the lipase-catalyzed degradation products of syn-P(3HB). (Table 3.13: Entry 10;21 h-degradation)
Fig. 3.53: MALDI-TOF MS spectrum of the lipase-catalyzed degradation products of syn-P(3HB). (Table 3.13: Entry 11;24 h-degradation)
また、Fig. 3.43より、水酸基末端型構造は分解反応開始直後に分解生成物中に著量含ま れていて、分解反応の進行に伴って減少するのに対して、環状型は反応開始直後から著量 含まれている上に反応時間の経過に伴って組成比が上昇することが明らかになった。水酸 基末端型はポリマー試料の加水分解反応により生成すると考えられるため、本分解反応の 初期段階では酵素触媒によるポリマー試料の加水分解反応が迅速に進行していると考えら れる。このことはSECチャートの経時変化から推測された、ポリマーのランダムなエン ド型分解を支持する結果となった。
しかしながら、酵素触媒による加水分解反応のみでは環状型オリゴマーは生成しない。
したがって、本分解反応はポリマー試料の加水分解と環状型オリゴマー生成という二つの 反応機構により進行していることが示された。SECチャートの経時変化より、ランダムな エンド型分解と同時に一定分子量のオリゴマーを与える分解反応が系内に存在することが 示唆されているため、環状型オリゴマー生成反応は一定分子量のオリゴマーを優先的に与 えている可能性が考えられる。Fig. 3.44～3.53の分子量解析から、分解反応時間に依存せ ずに環状7量体オリゴマーがピークトップであったことから、環状型オリゴマー生成反応 が与える一定分子量のオリゴマーが環状7量体オリゴマーであることが示された。
(2)atactic P(3HB)分解生成物の構造
ata-P(3HB)の完全な分解反応により得られた分解生成物の1H-NMRチャートをFig.
3.54に示した。
Fig. 3.54: 1H-NMR spectrum of the lipase-catalyzed degradation products of ata-P(3HB) a).
a)0.5 % P(3HB) toluene solution was stirred with 800 wt.-% Novozym°r 435 at 40 oC for 24h.
1H-NMR (270 MHz: CDCl3) : δ = 1.22～1.33 (–O–CHCH3–CH2–CO–O–, 3H, m), 2.41～2.63 (–O–CHCH3–CH2–CO–O–, 2H, m), 5.16～5.37 (–O–CHCH3–CH2– CO–O– , 1H, br)
Fig. 3.41中には帰属不可能なスペクトルが含まれているが、これらは酵素中に含ま
れ、有機溶媒により抽出された固定化剤や安定化剤であることが確認されている。また、
syn-P(3HB)分解生成物の場合と同様、クロトネート型末端にある不飽和結合由来のスペ
クトルが現れなかったことから、分解生成物中にクロトネート型構造が含まれないことが 明らかになった。したがって、分解生成物中に含まれる化合物はFig. 3.55に示される二 つの構造体であることが明らかになった。
ata-P(3HB)を基質に用いたときも、分解生成物中に含まれる構造はFig. 3.55に示し
た二つの構造体であると明らかになったので、本項ではsyn-P(3HB)分解生成物の構造解 析と同様、MALDI-TOF MSを用いて分解生成物の経時変化を解析した。分解生成物の MALDI-TOF MSスペクトルを分解反応時間順にFig. 3.57～3.66に示した。
Fig. 3.57～3.66の解析より、18 m/zの間隔を有する一組のスペクトルがモノマーユ
Fig. 3.55: Structures of mixtures that was included in crude degradation products of ata -P(3HB) obtained by the lipase-catalyzed degradation.
ニットの分子量である86.09間隔に現れることが明らかになった。分解生成物中には水酸 基末端型と環状型のみが存在するため、18 m/zの間隔を有する一組のスペクトルの中で 分子量の大きいピークが水酸基末端型に帰属され、小さいピークが環状型に帰属される。
したがって、ata-P(3HB)をポリマー試料に用いたときも本分解反応は環状型オリゴマー を主成分とした分解生成物を与える特徴を有していることが明らかになった。そこで、こ こでも、得られたオリゴマー混合物のMALDI-TOF MSスペクトルをC´ordovaらの方法
17)にしたがって解析し、スペクトル積分値から混合物中のナトリウム付加体について組成 比を30量体までの範囲で計算した。計算結果をFig. 3.56にまとめた。
Fig. 3.56: Time course of structual composition of the degradatioin products.
Fig. 3.57: MALDI-TOF MS spectrum of the lipase-catalyzed degradation products of ata -P(3HB). (Table 3.15: Entry 2; 1 h-degradation)
Fig. 3.58: MALDI-TOF MS spectrum of the lipase-catalyzed degradation products of ata -P(3HB). (Table 3.15: Entry 3; 2 h-degradation)
Fig. 3.59: MALDI-TOF MS spectrum of the lipase-catalyzed degradation products of ata -P(3HB). (Table 3.15: Entry 4; 3 h-degradation)
Fig. 3.60: MALDI-TOF MS spectrum of the lipase-catalyzed degradation products of ata -P(3HB). (Table 3.15: Entry 5; 6 h-degradation)
Fig. 3.61: MALDI-TOF MS spectrum of the lipase-catalyzed degradation products of ata -P(3HB). (Table 3.15: Entry 6; 9 h-degradation)
Fig. 3.62: MALDI-TOF MS spectrum of the lipase-catalyzed degradation products of ata -P(3HB). (Table 3.15: Entry 7; 12 h-degradation)
Fig. 3.63: MALDI-TOF MS spectrum of the lipase-catalyzed degradation products of ata -P(3HB). (Table 3.15: Entry 8; 15 h-degradation)
Fig. 3.64: MALDI-TOF MS spectrum of the lipase-catalyzed degradation products of ata -P(3HB). (Table 3.15: Entry 9; 18 h-degradation)
Fig. 3.65: MALDI-TOF MS spectrum of the lipase-catalyzed degradation products of ata -P(3HB). (Table 3.15: Entry 10;21 h-degradation)
Fig. 3.66: MALDI-TOF MS spectrum of the lipase-catalyzed degradation products of ata -P(3HB). (Table 3.15: Entry 11;24 h-degradation)
また、構造体の組成比変化はata-P(3HB)を基質に用いてもsyn-P(3HB)を基質に用い た場合と同様の結果が得られた。すなわち、Fig. 3.56より、水酸基末端型構造は分解反応 開始直後に分解生成物中に著量含まれていて、分解反応の進行に伴って減少するのに対し て、環状型は反応開始直後から著量含まれている上に反応時間の経過に伴って組成比が上 昇することが明らかになった。
これまでの検討から本分解反応はポリマー試料のタクティシティーの影響を受けないこ とが示されており、本検討による分解生成物の構造解析の結果も本分解反応がポリマー試 料のタクティシティーに影響されずに進行すること示した。
すなわち、化学触媒重合により得られた高分子量P(3HB)を有機溶媒中でNovozym°r 435により分解させたところ、分解生成物はポリマー試料のタクティシティーに影響され ずに環状型が主成分であった。また、分解生成物構造の経時変化解析より、syn-P(3HB)
とata-P(3HB)いずれのポリマーを基質に用いても分解反応開始直後は分解生成物中の水
酸基末端型オリゴマーの組成比は比較的高く、反応の進行に伴って環状型へと移行してい くことが明らかとなった。以上の結果から、本分解反応は反応系に存在した微量の水分を 用いた加水分解反応によるポリマー試料のオリゴマー化と環状型オリゴマー生成反応の二 つが同時に進行していると考えられた。また、ata-P(3HB)を基質に用いても、分解反応 時間に依存せずに環状7量体オリゴマーがMALDI-TOF MSスペクトル中でピークトッ プであったことから、環状型オリゴマー生成反応が与える一定分子量のオリゴマーが環状 7量体オリゴマーであると考えられた。
また、反応溶媒にトルエンよりも若干疎水性の高いo—キシレンを用いても本反応は迅速 に進行し、生成物中の環状型オリゴマー組成率が若干上昇することも明らかになった。さ らに、ポリマー試料であるata-P(3HB)の数平均分子量を110000に増加させてキシレン 中、800 wt.-%のNovozym°r 435を作用させたところ、分解反応はポリマー試料の分子量 の影響を全く受けずに進行して環状型オリゴマーを主生成物として与えた。
以上の検討から、本分解反応はトルエンや o—キシレンといった疎水性有機溶媒中で
P(3HB)のタクティシティーやポリマー試料の分子量の影響を受けずに迅速に進行し、環
状型オリゴマーを主生成物として与えることが明らかになった。