博 士 論 文 概 要

早稲田大学大学院理工学研究科

博 士 論 文 概 要

論 文 題 目

Characterization of amino acid ligases and development of production processes for peptide

containing D-amino acid アミノ酸リガーゼの特性解析と

D-アミノ酸ペプチド合成プロセスの開発

申 請 者 佐藤 大 Masaru Sato

応用化学専攻・応用生物化学研究

2006 年 12 月

ペ プ チ ド は 抗 菌 物 質 や シ グ ナ ル 分 子 と し て 自 然 界 に 見 出 さ れ 、 そ の 多 様 な 機 能 か ら 医 薬 品 原 料 や 機 能 性 食 品 な ど 幅 広 い 分 野 で 用 途 開 発 が 進 め ら れ て い る 。 ま た 近 年 の 化 学 的 な ペ プ チ ド 合 成 技 術 の 進 展 と 分 析 技 術 の ハ イ ス ル ー プ ッ ト 化 は 、 多 様 な ペ プ チ ド の 創 出 と 迅 速 な 機 能 解 析 を 可 能 と し て い る 。 こ の よ う な 技 術 革 新 を 基 盤 と し て 、 タ ン パ ク 質 性 の ア ミ ノ 酸 か ら な る 天 然 型 ペ プ チ ド に 抗 菌 活 性 や 降 圧 活 性 な ど 有 用 な 機 能 が 数 多 く 見 出 さ れ て い る 。 一 方 、 ペ プ チ ド の 機 能 は 構 成 す る ア ミ ノ 酸 の 特 性 に 由 来 す る た め 、 非 天 然 型 を 含 む 多 様 な ア ミ ノ 酸 で 構 成 さ れ る ペ プ チ ド を 合 成 す る こ と が で き れ ば 、 さ ら に 機 能 の 多 様 性 を 拡 張 で き る も の と 期 待 さ れ る 。 し か し 、D-ア ミ ノ 酸 な ど 非 天 然 型 ア ミ ノ 酸 を 含 有 す る ペ プ チ ド に 関 し て も 、 天 然 型 ペ プ チ ド と 同 様 効 率 的 な 合 成 法 が な い た め に 用 途 開 発 研 究 が 停 滞 し て お り 、 機 能 開 発 研 究 の 発 展 に は よ り 効 率 的 な 合 成 法 が 必 須 と な っ て い る 。

本 研 究 で は 、D-ア ミ ノ 酸 含 有 ペ プ チ ド の 効 率 的 合 成 プ ロ セ ス を 構 築 す る た め に 、 微 生 物 が 有 す る ア ミ ノ 酸 リ ガ ー ゼ で あ る D-ア ラ ニ ン-D-ア ラ ニ ン リ ガ ー ゼ （D d l） に 着 目 し た 。D d l は 細 菌 の ペ プ チ ド グ リ カ ン の 生 合 成 に 関 わ る 酵 素 で あ り 、 遊 離 の D-ア ラ ニ ン 2 分 子 を 連 結 し て ジ ペ プ チ ド を 合 成 す る 。ま た 、一 部 の 微 生 物 が 有 す る 変 異 D d l に は D-ア ラ ニ ン 以 外 に D-セ リ ン や D-乳 酸 の 結 合 活 性 が 報 告 さ れ て い る 。 こ の こ と か ら 、 多 様 な 微 生 物 の 中 に は よ り 広 範 な 基 質 特 異 性 を 有 す る D d l が 存 在 し て い る と 期 待 さ れ 、こ の よ う な D d l を 利 用 す る こ と で 基 質 の 修 飾 を 必 要 と し な い 簡 便 で 効 率 的 な D-ア ミ ノ 酸 ジ ペ プ チ ド の 1段 階 合 成 プ ロ セ ス が 構 築 で き る も の と 考 え た 。 し か し 、 広 範 な 基 質 特 異 性 を 有 す る D d l の 報 告 は こ れ ま で に な い 。 ま た 、D d l に よ る ジ ペ プ チ ド 合 成 反 応 に は 高 価 な AT P が 必 要 と な る 。 こ う し た 状 況 を 踏 ま え 、 本 論 文 で は 、D d l の 特 性 解 析 に よ っ て 見 出 し た 広 範 な 基 質 特 異 性 を 有 す る D d lと そ れ を 利 用 し た 効 率 的 な D-ア ミ ノ 酸 ジ ペ プ チ ド 合 成 プ ロ セ ス に つ い て 論 じ た 。

本 論 文 は 7 章 よ り 構 成 さ れ る 。 以 下 に そ の 概 要 を 述 べ る 。

第 1 章 で は 、既 存 の ペ プ チ ド 合 成 法 の 中 で も D-ア ミ ノ 酸 ペ プ チ ド 合 成 に 関 わ る バ イ オ プ ロ セ ス を 中 心 に 、 現 在 の 合 成 法 の 概 要 と 課 題 を 挙 げ た 。 さ ら に 、 本 研 究 の 中 心 と な る 酵 素 で あ る D d l に 関 連 す る 生 理 学 的 知 見 を 概 説 し 、本 研 究 の 着 想 に 至 っ た 経 緯 を 論 じ た 。

第 2 章 で は 、数 種 類 の 微 生 物 か ら 取 得 し た 異 な る D d l ホ モ ロ グ の 機 能 解 析 と そ の 結 果 に つ い て 説 明 を 加 え た 。多 様 な D-ア ミ ノ 酸 ジ ペ プ チ ド 合 成 の た め に は 広 範 な 基 質 特 異 性 を 有 す る D d l が 必 要 と な る 。 そ こ で 、 ゲ ノ ム 情 報 を 基 に 多 様 性 が 期 待 さ れ る E s c h e r i c h i a c o l i K - 1 2（E c D d l B）、S y n e c h o c y s ti s s p . P C C 6 8 0 3（S s D d l）、

O c e a no b a c i l l us i h e ye n s i s J C M 11 3 0 9（O i D d l）、T h e r m o t o g a m a ri t i m a AT C C 4 3 5 8 9（T m D d l） 由 来 の ４ 種 類 の D d l 遺 伝 子 を ク ロ ー ニ ン グ し 、 組 換 え 酵 素 の 基 質 特 異 性 を 検 証 し た 。O i D d l は D-ア ラ ニ ン の み に 特 異 性 を 示 す 酵 素 で あ っ た が 、 そ の 一 方 で 、E c D d l B、S s D d l、T m D d l は D-ア ラ ニ ン に 加 え 、D-セ リ ン 、D-シ ス

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テ イ ン 、D-ス レ オ ニ ン 、 グ リ シ ン に 対 し て も 活 性 を 示 す こ と を 明 ら か に し た 。 と く に 常 温 で 高 活 性 を 示 す E c D d l B を 利 用 し た D-ア ミ ノ 酸 ジ ペ プ チ ド 合 成 で は 、遊 離 の D-ア ミ ノ 酸 か ら 1 段 階 の 酵 素 反 応 で 最 大 7 7 % ( m o l / m o l )の 収 率 を 達 成 し 、D- ア ミ ノ 酸 ジ ペ プ チ ド 合 成 に お け る D d l の 有 用 性 を 示 し た 。ま た 、T m D d l は 好 熱 性 菌 由 来 の 酵 素 で あ り 、 工 業 利 用 に 有 用 な 耐 熱 性 と 安 定 性 が 期 待 さ れ た 。

第 3 章 で は 、 安 価 な L-ア ミ ノ 酸 を 原 料 と す る た め に 、 ア ミ ノ 酸 ラ セ マ ー ゼ を

D d l と 共 役 さ せ た プ ロ セ ス に つ い て 論 じ た 。 こ の 共 役 プ ロ セ ス に は 広 範 な 基 質 特

異 性 を 有 す る ア ミ ノ 酸 ラ セ マ ー ゼ が 必 要 で あ る こ と か ら 、P s e u d o m o n a s p u t i d a I F O 1 2 9 9 6 由 来 低 基 質 特 異 性 ア ミ ノ 酸 ラ セ マ ー ゼ （B A R） に 着 目 し 、 当 該 酵 素 遺 伝 子 の ク ロ ー ニ ン グ を 行 っ た 。 取 得 し た 組 換 え 酵 素 の 特 性 に つ い て 詳 細 に 検 討 し た と こ ろ 、B A R は ほ ぼ 全 て の 標 準 ア ミ ノ 酸 を 基 質 と し 得 る 広 範 な 基 質 特 異 性 を 有 す る こ と を 明 ら か に し た 。L-ア ミ ノ 酸 か ら D-ア ミ ノ 酸 の 供 給 を 可 能 と す る B A R と E c D d l B と の 共 役 反 応 に よ っ て 、安 価 な 原 料 か ら の D-ア ミ ノ 酸 ジ ペ プ チ ド 合 成 を 達 成 し た 。 さ ら に 、 本 共 役 反 応 を 菌 体 反 応 プ ロ セ ス に 応 用 し 、 菌 体 が 元 来 有 す る グ ル コ ー ス か ら の 解 糖 系 に 依 存 し た AT P 再 生 能 を 利 用 す る こ と を 考 え た 。そ こ で 、E c D d l B と B A R を 高 発 現 す る 組 換 え 大 腸 菌 を 造 成 し 、D-ア ミ ノ 酸 ジ ペ プ チ ド 合 成 に 適 し た 培 養 条 件 を 検 討 し た 。 最 適 条 件 下 で は 、 外 部 か ら の L-ア ラ ニ ン と グ ル コ ー ス を 添 加 し た 2 7 時 間 の 反 応 に お い て D-ア ラ ニ ル -D-ア ラ ニ ン を 収 率 7 4 % ( m o l / m o l )で 合 成 す る こ と が で き た 。 こ の よ う に 菌 体 の AT P 再 生 能 の 適 切 な 利 用 に よ り 、 効 率 的 な D-ア ミ ノ 酸 ジ ペ プ チ ド 合 成 プ ロ セ ス の 確 立 に 成 功 し た 。

第 4 章 で は 、 前 章 で L-ア ミ ノ 酸 か ら の D-ア ミ ノ 酸 供 給 に 用 い た B A R の 基 質 特 異 性 を さ ら に 拡 張 す る た め に 、B A R が 極 め て 微 弱 な 活 性 し か 示 さ な い 芳 香 族 ア ミ ノ 酸 、 中 で も ト リ プ ト フ ァ ン に 対 す る 活 性 が 向 上 し た B A R 変 異 体 の 創 製 を 試 み

た 。B A R の 立 体 構 造 は 決 定 さ れ て い な い こ と か ら 、酵 素 改 変 に は 遺 伝 子 に 人 工 的

に ラ ン ダ ム な 変 異 を 導 入 し て 、 目 的 の 候 補 変 異 体 を ス ク リ ー ニ ン グ す る 進 化 分 子 工 学 的 手 法 が 有 効 で あ る と 考 え た 。 そ こ で 、 膨 大 な ラ ン ダ ム 変 異 ラ イ ブ ラ リ ー か ら 目 的 と す る 候 補 変 異 酵 素 を 取 得 す る た め に 、 ト リ プ ト フ ァ ン 栄 養 要 求 性 大 腸 菌 の 生 育 を 指 標 と し た 効 率 的 な ス ク リ ー ニ ン グ 系 を 構 築 し た 。 本 ス ク リ ー ニ ン グ 系 を 用 い て 3 0 , 0 0 0 ク ロ ー ン の 変 異 ラ イ ブ ラ リ ー か ら 、8 0 個 の 候 補 変 異 体 を 選 別 し た 。 さ ら に 、 こ れ ら の 候 補 変 異 体 の ト リ プ ト フ ァ ン に 対 す る ラ セ ミ 化 活 性 を 比 色 分 析 に よ り 定 量 す る こ と で 、 最 終 的 に ト リ プ ト フ ァ ン の ラ セ ミ 化 活 性 が 向 上 し た 5 種 類 の 変 異 酵 素 を 取 得 し た 。 変 異 酵 素 の 解 析 か ら 、B A R の 3 8 4 位 の イ ソ ロ イ シ ン 残 基 と 3 9 6 位 の チ ロ シ ン 残 基 が B A R の ト リ プ ト フ ァ ン に 対 す る ラ セ ミ 化 活 性 の 向 上 に 寄 与 す る こ と を 明 ら か に し た 。 さ ら に 、 分 子 モ デ リ ン グ 解 析 か ら 、 両 変 異 が B A R の 補 酵 素 で あ る ピ リ ド キ サ ー ル 5 ’ -リ ン 酸 の 結 合 に 関 与 し て い る 可 能 性 を 示 し た 。最 も 高 活 性 を 示 し た 3 8 4 位 の メ チ オ ニ ン 置 換 体（I 3 8 4 M B A R）は 野 生 型 酵 素 の 2 0 倍 の ト リ プ ト フ ァ ン ラ セ ミ 化 活 性 を 示 し 、 さ ら に 、 他 の ア ミ ノ 酸 に

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対 し て も 顕 著 に 活 性 が 向 上 し て い た 。I 3 8 4 M 変 異 体 の 創 製 に よ り 、 ト リ プ ト フ ァ ン を 含 め 多 く の ア ミ ノ 酸 の ラ セ ミ 化 が 達 成 さ れ 、 反 応 プ ロ セ ス へ の 効 率 的 な D- ア ミ ノ 酸 供 給 が 可 能 に な る も の と 期 待 さ れ た 。

第 5 章 で は 、第 2 章 で 見 出 し た 有 用 な D d l の 中 で も 耐 熱 性 が 期 待 さ れ る 好 熱 性 細 菌 T. m a r i ti m a AT C C 4 3 5 8 9 由 来 T m D d l の 酵 素 諸 性 質 と 基 質 特 異 性 に つ い て 論 じ た 。 耐 熱 性 酵 素 は 、 常 温 に お い て も 安 定 で あ り 長 期 保 存 が 可 能 な こ と や 取 り 扱 い の 簡 便 さ な ど か ら 、 産 業 用 酵 素 に 適 し た 特 性 を 有 す る 。 本 研 究 で 取 得 し た T m D d l も 1 0 º C か ら 9 0 º C の 範 囲 に お い て 安 定 で あ っ た 。 さ ら に 、T m D d l の 反 応 速 度 は 温 度 の 上 昇 に 伴 っ て 顕 著 に 増 大 す る こ と と そ の 基 質 特 異 性 が 拡 張 す る こ と を 見 出 し た 。T m D d l は 、 常 温 で は D-ア ラ ニ ン 、D-セ リ ン 、D-シ ス テ イ ン 、D-ス レ オ ニ ン 、 グ リ シ ン を 基 質 と し た が 、 反 応 温 度 を 6 0 º C に 上 昇 さ せ る と 、 こ れ ら の

D-ア ミ ノ 酸 に 加 え て 脂 肪 族 D-ア ミ ノ 酸 、一 部 の 塩 基 性 D-ア ミ ノ 酸 や 芳 香 族 ア ミ ノ 酸 で あ る D-フ ェ ニ ル ア ラ ニ ン も 基 質 と し た 。3 7 º C と 6 0 º C に お け る C D ス ペ ク ト ル に 大 き な 差 異 は な く 、 酵 素 分 子 の ダ イ ナ ミ ッ ク な 構 造 変 化 を 伴 っ て い な い こ と が 示 唆 さ れ 、 基 質 特 異 性 の 拡 張 は 高 温 に お け る T m D d l の 反 応 速 度 の 向 上 に 起 因 す る も の と 推 察 し た 。T m D d l の 6 0 º C に お け る 広 範 な 基 質 特 異 性 は 他 の D d l と 比 較 し て も 特 長 的 な も の で あ り 、 耐 熱 性 酵 素 の 利 点 を 活 用 す る こ と で 見 出 す こ と の で き た 酵 素 の 有 用 な 特 性 で あ る 。

第 6 章 で は 、T m D d l が 広 範 な 基 質 特 異 性 を 示 す 高 温 域 に お け る 効 率 的 な AT P 供 給 方 法 を 検 討 し た 。第 3 章 で 述 べ た よ う に 、解 糖 系 に 依 存 し た AT P 再 生 は 常 温 反 応 に お い て 有 効 に 機 能 す る が 、 高 温 反 応 で は 酵 素 の 熱 失 活 に よ り 解 糖 系 が 機 能 し な い 。 そ こ で 、 好 熱 性 細 菌 T he r m o s y n e c ho c o c c u s e l o n g a t u s B P - 1 由 来 の ポ リ リ ン 酸 キ ナ ー ゼ （Te P p k） に 着 目 し 、 当 該 酵 素 に よ る ポ リ リ ン 酸 を エ ネ ル ギ ー 源 と し た 耐 熱 性 AT P 再 生 系 の 構 築 を 試 み た 。大 腸 菌 で 組 換 え 酵 素 と し て 生 産 さ せ た Te P p k は 1 0 º C か ら 7 0 º C ま で の 広 範 な 温 度 域 で 安 定 な 酵 素 で あ っ た 。Te P p k を 組 み 込 ん だ 耐 熱 性 AT P 再 生 系 を T m D d l の 反 応 に 共 役 さ せ た 6 0 º C の 高 温 反 応 条 件 下 で は 、微 量 AT P の 添 加 の み で 8 0 % ( m o l / m o l )を 超 え る 高 収 率 で の D-ア ラ ニ ル-D- ア ラ ニ ン が 合 成 可 能 で あ っ た 。 さ ら に 菌 体 内 に 微 量 残 存 す る ア デ ノ シ ン 骨 格 を AT P 再 生 に 利 用 す る こ と を 考 え 、 本 反 応 を 菌 体 系 に て 実 施 し た 。 そ の 結 果 、 合 成 収 率 8 5 % ( m o l / m o l )を 達 成 し 、 外 部 か ら の AT P 添 加 を 必 要 と し な い 効 率 的 な プ ロ セ ス の 構 築 に 成 功 し た 。

第 7 章 で は 、 第 2 章 か ら 第 6 章 で 得 ら れ た 研 究 成 果 を 総 括 し 、 本 研 究 で 用 い た

D d l な ど ア ミ ノ 酸 リ ガ ー ゼ を 利 用 し た ペ プ チ ド 合 成 プ ロ セ ス の 今 後 の 展 望 に つ い

て 議 論 し た 。

研 究 業 績

種 類 別 題名、 発表・発行掲載誌名、 発表・発行年月、 連名者（申請者含む）

○論文

○論文

○論文

○論文

講演

講演

講演

講演

講演

M a s a r u S a t o , Y u s u k e M a s u d a , K o h t a r o K i r i m u r a , K u n i k i K i n o , D- A m i n o A c i d D i p e p t i d e S y n t h e s i s w i t h a T h e r m o s t a b l e A T P R e g e n e r a t i o n S y s t e m u s i n g P o l y p h o s p h a t e K i n a s e f r o m T h e r m o s y n e c h o c o c c u s e l o n g a t u s B P - 1 . J . B i o s c i . B i o e n g ., S u b m i t t e d ( 2 0 0 6 )

M a s a r u S a t o , K o h t a r o K i r i m u r a , K u n i k i K i n o , S u b s t r a t e S p e c i f i c i t y o f T h e r m o s t a b l e D- A l a n i n e -D- A l a n i n e L i g a s e f r o m T h e r m o t o g a m a r i t i m a A T C C 4 3 5 8 9 . B i o s c i . B i o t e c h . B i o c h e m ., I n p r e s s ( 2 0 0 6 )

K u n i k i K i n o , M a s a r u S a t o , M a r i k o Y o n e y a m a , K o h t a r o K i r i m u r a , S y n t h e s i s o f D L- T r y p t o p h a n b y M o d i f i e d B r o a d S p e c i f i c i t y A m i n o A c i d R a c e m a s e f r o m P s e u d o m o n a s p u t i d a I F O 1 2 9 9 6 . A p p l . M i c r o b i o l . B i o t e c h ., I n p r e s s ( 2 0 0 6 )

M a s a r u S a t o , K o h t a r o K i r i m u r a , K u n i k i K i n o , D- A m i n o A c i d D i p e p t i d e P r o d u c t i o n U t i l i z i n g D- A l a n i n e -D- a l a n i n e L i g a s e s w i t h N o v e l S u b s t r a t e S p e c i f i c i t y . J . B i o s c i . B i o e n g ., 9 9 ( 6 ) , 6 2 3 - 6 2 8 ( 2 0 0 5 )

佐 藤 大 , 増 田 雄 介 , 桐 村 光 太 郎 , 木 野 邦 器 , 高 温 反 応 プ ロ セ ス に お け る A T P 再 生 系 共 役D- ア ミ ノ 酸 ジ ペ プ チ ド 合 成 , 酵 素 工 学 研 究 会 第 5 6 回 講 演 会 , 講 演 要 旨 集 p . 5 3 , 東 京 , 2 0 0 6 年 1 0 月

米 山 万 里 子 , 佐 藤 大 , 桐 村 光 太 郎 , 木 野 邦 器 , P s e u d o m o n a s p u t i d a I F O 1 2 9 9 6 由 来 低 基 質 特 異 性 ア ミ ノ 酸 ラ セ マ ー ゼ I l e^{3 8 4}、T y r^{3 9 6}残 基 変 異 体 の 解 析 , 第 5 8 回 日 本 生 物 工 学 会 大 会 , 講 演 要 旨 集 p . 1 0 2 , 大 阪 , 2 0 0 6 年 9 月

M a s a r u S a t o , M a r i k o Y o n e y a m a , K o h t a r o K i r i m u r a , K u n i k i K i n o , T r y p t o p h a n R a c e m a s e d e r i v e d f r o m B r o a d S p e c i f i c i t y A m i n o A c i d R a c e m a s e b y D i r e c t e d E v o l u t i o n , G I M 2 0 0 6 , p . 1 6 1 , P r a g u e ( C z e c h R e p u b l i c ) , J u n e 2 0 0 6

倉 都 頌 子 , 中 澤 裕 二 , 矢 ケ 崎 誠 , 小 窪 雅 弘 , 佐 藤 大 , 桐 村 光 太 郎 , 木 野 邦 器 , 新 規 な グ ル タ チ オ ン 合 成 酵 素 と そ の 類 縁 酵 素 の 解 析 , 日 本 農 芸 化 学 会 2 0 0 6 年 度 大 会 , 講 演 要 旨 集 p . 3 0 1 , 京 都 , 2 0 0 6 年 3 月

佐 藤 大 , 桐 村 光 太 郎 , 木 野 邦 器 , T h e r m o s y n e c h o c o c c u s e l o n g a t u s B P - 1 由 来 耐 熱 性 ポ リ リ ン 酸 キ ナ ー ゼ の 酵 素 諸 性 質 と A T P 再 生 系 共 役 D- ア ミ ノ 酸 ジ ペ プ チ ド 合 成 へ の 応 用 , 日 本 農 芸 化 学 会 2 0 0 6 年 度 大 会 , 講 演 要 旨 集 p . 2 9 0 , 京 都 , 2 0 0 6 年 3 月

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研 究 業 績

種 類 別 題名、 発表・発行掲載誌名、 発表・発行年月、 連名者（申請者含む）

講演

講演

講演

講演

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講演

講演

講演

講演

講演

佐 藤 大 , 桐 村 光 太 郎 , 木 野 邦 器 , T h e r m o t o g a m a r i t i m a由 来D- ア ラ ニ ン - D - ア ラ ニ ン リ ガ ー ゼ の 基 質 特 異 性 に お け る 金 属 イ オ ン 添 加 効 果 , 平 成 1 7 年 度 日 本 生 物 工 学 会 大 会 , 講 演 要 旨 集 p . 1 1 2 , つ く ば , 2 0 0 5 年 1 1 月

米 山 万 里 子 , 佐 藤 大 , 石 井 義 孝 , 桐 村 光 太 郎 , 木 野 邦 器 , Pseudomonas

putida IFO12996 由 来 低 基 質 特 異 性 ア ミ ノ 酸 ラ セ マ ー ゼ の ラ ン ダ ム 変 異 導

入 に よ る 基 質 特 異 性 の 改 変 , 平 成 17 年 度 日 本 生 物 工 学 会 大 会 , 講 演 要 旨 集 p. 112, つ く ば , 2005 年 11 月

米 山 万 里 子 , 佐 藤 大 , 木 野 邦 器 , Pseudomonas putida由 来 低 基 質 特 異 性 ア ミ ノ 酸 ラ セ マ ー ゼ の ク ロ ー ニ ン グ と ラ ン ダ ム 変 異 導 入 に よ る 基 質 特 異 性 の 改 変 , 第 １ 回D-ア ミ ノ 酸 研 究 会 学 術 講 演 会 , 講 演 要 旨 集 p. 71, 東 京 , 2005 年 9 月

Masaru SATO, Kohtaro Kirimura, Kuniki KINO, D-Alanine-D-Alanine Ligases with Broad Substrate Specificities for the Effective Production of D-Amino Acid Dipeptides, BIOTRANS2005, Delft (Netherlands), p. 184, July 2005

佐 藤 大 , 桐 村 光 太 郎 , 木 野 邦 器 , Thermotoga maritima AT CC 435 89 由 来D- ア ラ ニ ン -D- ア ラ ニ ン リ ガ ー ゼ の 基 質 特 異 性 と 当 該 酵 素 を 利 用 し たD- ア ミ ノ 酸 ジ ペ プ チ ド 生 産 , 日 本 農 芸 化 学 会 2005 年 度 大 会 , 講 演 要 旨 集 p. 40, 札 幌 , 2005 年 3 月

佐 藤 大 , 木 野 邦 器 , D-Alanine-D-alanine ligase の 基 質 特 異 性 の 解 析 とD- ア ミ ノ 酸 ジ ペ プ チ ド 合 成 へ の 利 用 , 酵 素 工 学 研 究 会 第 52 回 講 演 会 , 講 演 要 旨 集 p. 44, 東 京 , 2004 年 11 月

佐 藤 大 , 桐 村 光 太 郎 , 木 野 邦 器 , D-Alanine-D-alanine ligase を 利 用 し た 各 種D-ア ミ ノ 酸 ジ ペ プ チ ド 合 成 , 平 成 16 年 度 日 本 生 物 工 学 会 大 会 , 講 演 要 旨 集 p. 108, 名 古 屋 , 2004 年 9 月

佐 藤 大 , 新 井 利 信 , 桐 村 光 太 郎 , 木 野 邦 器 , ア ミ ノ 酸 ラ セ マ ー ゼ / リ ガ ー ゼ 共 役 系 に よ るL- ア ミ ノ 酸 か ら のD- ア ミ ノ 酸 ジ ペ プ チ ド 合 成 , 日 本 農 芸 化 学 会 2004 年 度 大 会 , 講 演 要 旨 集 p. 119, 広 島 , 2004 年 3 月

新 井 利 信 , 佐 藤 大 , 桐 村 光 太 郎 , 木 野 邦 器 , 芳 香 族 ア ミ ノ 酸 に 対 し て ラ セ ミ 化 活 性 を 有 す る 微 生 物 の 探 索 , 第 55 回 日 本 生 物 工 学 会 大 会 , 講 演 要 旨 集 p. 56, 熊 本 , 2003 年 9 月

太 田 文 徳 , 池 田 直 俊 , 佐 藤 大 , 新 井 利 信 , 桐 村 光 太 郎 , 木 野 邦 器 , Bacillus

fusiformis WU-ATR9 由 来D-amino acid aminotransferaseに よ るD-ト リ プ ト

フ ァ ン 合 成 , 第 55 回 日 本 生 物 工 学 会 大 会 , 講 演 要 旨 集 p. 56, 熊 本 , 2003 年 9 月

研 究 業 績

種 類 別 題名、 発表・発行掲載誌名、 発表・発行年月、 連名者（申請者含む）

その他

（特許）

木 野 邦 器 , 佐 藤 大 , ジ ペ プ チ ド の 製 造 法 , 特 出 願 2004-93953, 2004 年 3 月

（ 出 願 中 ）