早 稲 田 大 学 大 学 院 先 進 理 工 学 研 究 科
博 士 論 文 概 要
論 文 題 目
両 生 類 ツ チ ガ エ ル に お け る
卵 管 形 成 阻 害 物 質 遺 伝 子 の 単 離 と 発 現 解 析
Molecular Cloning and Characterization of the Anti-Müllerian Hormone Gene
from the Frog Rana rugosa
申 請 者
児 玉 万 穂
Maho KODAMA
生 命 理 工 学 専 攻 分 子 生 殖 生 物 学 研 究
2 0 1 5 年 1 1 月
No.1
脊 椎 動 物 に は 雌 雄 の 性 が あ る 。 個 体 発 生 に お い て 、 雌 か 雄 か を 決 め る こ と を 性 決 定 と い い 、そ の 決 定 に 従 っ て 身 体 が 雄 ま た は 雌 に 分 化 す る 過 程 を 性 分 化 と い う 。 生 殖 腺 は 雌 雄 両 性 能 を 持 つ 未 分 化 生 殖 腺 と し て 形 成 さ れ 、 性 決 定 後 、 精 巣 ま た は 卵 巣 に 性 分 化 す る 。 し か し 現 在 の と こ ろ 、 生 殖 腺 の 性 決 定 及 び 性 分 化 の 分 子 機 構 は 充 分 に 解 明 さ れ て い な い 。 そ の 分 子 機 構 を 明 ら か に し よ う と 哺 乳 類 を 含 む 様 々 な 動 物 種 で 活 発 に 研 究 が 行 わ れ 、 性 決 定 お よ び 性 分 化 に 関 わ る 遺 伝 子 が 数 多 く 単 離 さ れ て い る 。 そ の 結 果 、 性 分 化 に 関 わ る 遺 伝 子 の 多 く は 脊 椎 動 物 間 で 広 く 保 存 さ れ て い る こ と が 分 か っ た 。 そ の 中 の １ つ に 生 殖 腺 の 雄 化 に 深 く 関 わ る 卵 管 形 成 阻 害 物 質 （ A n t i - M ü l l e r i a n H o r m o n e ） を コ ー ド す る A M H 遺 伝 子 が あ る 。 A M H は 卵 管 形 成 を 阻 害 す る だ け で な く 、雄 に お け る 正 常 な 生 殖 腺 と 内 外 性 器 形 成 に 機 能 し 、 そ の た め に は A M H の 供 給 が 適 切 に 調 整 さ れ る 必 要 が あ る 。A M H は T G F - β ス ー パ ー フ ァ ミ リ ー に 属 す る 糖 タ ン パ ク 質 で あ る 。 哺 乳 類 や 鳥 類 に お い て 、 性 分 化 期 の 生 殖 腺 で の 発 現 に 雌 雄 差 が あ り 、 雄 生 殖 腺 で 強 く 発 現 す る 。 哺 乳 類 に お い て 、 そ の 性 決 定 遺 伝 子 S R Y(S e x - d e t e r m i n i n g R e g i o n Y) の 標 的 遺 伝 子 で あ る S o x 9(S R Y r e l a t e d - b o x 9) が A M H の 転 写 制 御 に 関 わ っ て い る こ と が 分 か っ て い る 。一 方 、鳥 類 に お い て は S o x 9 が 転 写 さ れ る 前 に A M H の 発 現 が 上 昇 す る た め 、S o x 9 は A M H の 転 写 制 御 に 関 与 し な い と 考 え ら れ て い る 。 ま た 、 爬 虫 類 の ア メ リ カ ア リ ゲ ー タ ー に お い て 性 分 化 中 の 雄 生 殖 腺 で A M Hが 強 く 発 現 す る 時 期 に S o x 9も 雌 よ り 雄 生 殖 腺 で 強 く 発 現 す る こ と か ら 、S o x 9 が A M H の 転 写 促 進 を す る こ と が 分 か っ て い る 。 現 在 ま で に 多 く の 脊 椎 動 物 で A M H の 単 離 と 発 現 解 析 が 行 わ れ て き た が 、 両 生 類 で は 解 析 さ れ て い な か っ た 。 本 研 究 は 、 両 生 類 の ツ チ ガ エ ル (R a n a r u g o s a) を 研 究 材 料 と し て 用 い 、A M H が 両 生 類 生 殖 腺 の 性 分 化 、 特 に 生 殖 腺 の 雄 化 に 関 わ る か ど う か を 明 ら か に す る こ と を 目 的 と し た 。 そ の た め に 、 ツ チ ガ エ ル の A M H を 単 離 し て そ の 発 現 を 調 べ た 。 加 え て 、 A M H の 受 容 体 で あ る A M H 受 容 体 タ イ プ Ⅱ 遺 伝 子 (A M H R Ⅱ) の 単 離 と そ の 発 現 解 析 も 行 っ た 。
第 １ 章 で は 、 脊 椎 動 物 の 生 殖 腺 の 性 決 定 お よ び 性 分 化 に お け る A M H と そ の 受 容 体 （ A M H R Ⅱ ） の 役 割 に つ い て 述 べ る 。 ま た 、 本 研 究 に 使 用 し た ツ チ ガ エ ル の 性 染 色 体 の 多 様 性 と 性 決 定 様 式 、 ま た 発 生 段 階 分 期 法 お よ び 雌 雄 判 定 法 に つ い て 説 明 す る 。
第 ２ 章 で は 、 ツ チ ガ エ ル A M H 遺 伝 子 の 単 離 お よ び 各 発 生 段 階 の 生 殖 腺 な ら び に 他 の 組 織 に お け る A M H の 発 現 様 式 を 示 し て い る 。両 生 類 で は 初 の A M H c D N A を ツ チ ガ エ ル か ら 単 離 し 、 塩 基 配 列 （ 2 7 0 2 b p ） を 決 定 し た 。 そ の 塩 基 配 列 か ら 推 測 さ れ る ア ミ ノ 酸 残 基 は 5 8 2 で 、 他 の 脊 椎 動 物 と 同 様 、 C 末 端 側 に T G F - β ド メ イ ン 、 中 央 に A M H ド メ イ ン を 有 し て い た 。T G F - β ス ー パ ー フ ァ ミ リ ー に 属 す る タ ン パ ク 質 の 多 く は 、 タ ン パ ク 質 分 解 を 受 け て 生 理 活 性 の 高 い C 末 端 側 が 切 り 出 さ れ る が 、 前 述 の ツ チ ガ エ ル A M H の 2 つ の ド メ イ ン 間 の ア ミ ノ 酸 配 列 に は 切 断 部 位 が 2 カ 所 あ り 、 そ の う ち の 1 つ は ヒ ト A M H の ア ミ ノ 酸 配 列 と 部 位 が 一 致 し た 。 ま た 、 4 カ
所 に N -結 合 型 糖 鎖 コ ン セ ン サ ス 配 列 が 存 在 し た 。さ ら に 、T G F - β ス ー パ ー フ ァ ミ リ ー に 属 す る タ ン パ ク 質 の ア ミ ノ 酸 配 列 を 基 に 分 子 系 統 樹 を 作 成 す る と 、 ツ チ ガ エ ル A M H は 他 の T G F - β サ ブ フ ァ ミ リ ー で は な く 、 予 想 通 り 、 A M H グ ル ー プ に 属 し た 。 ツ チ ガ エ ル 1 3 対 の 染 色 体 に お け る A M H の 位 置 を F I S H 法 で 解 析 し た と こ ろ 、 第 １ 染 色 体 短 腕 の セ ン ト ロ メ ア 近 く に シ グ ナ ル が 検 出 さ れ た 。 従 っ て 、A M H は 常 染 色 体 の 遺 伝 子 で あ る こ と が 分 か っ た 。 次 に 、A M H c D N A の 塩 基 配 列 を 基 に 特 異 的 プ ラ イ マ ー を 作 製 し て R T - P C R 法 に よ っ て 成 体 組 織（ 肺 , 肝 臓 , 腎 臓 , 心 臓 , 筋 肉 , 脳 , 精 巣 , 卵 巣 ）に お け る ツ チ ガ エ ル A M H の 発 現 を 調 べ た 。そ の 結 果 、精 巣 で 強 い 発 現 が 見 ら れ た 。 ま た 、 性 決 定 期 前 後 ( s t . 2 5 〜 s t . V ) の 生 殖 腺 に お け る A M H の 発 現 を リ ア ル タ イ ム R T - P C R 法 で 調 べ る と 、A M H は 雌 雄 の 未 分 化 生 殖 腺 で 発 現 す る が そ の 発 現 に は 性 差 が な か っ た 。し か し 、精 巣 分 化 期 に は 卵 巣 よ り も 強 い 発 現 を 示 し た 。 第 ３ 章 で は 、 ツ チ ガ エ ル の 精 巣 に お け る A M H の 局 在 を 述 べ て い る 。 組 織 免 疫 染 色 法 で A M H の 発 現 細 胞 を 同 定 す る た め 、 ツ チ ガ エ ル A M H ア ミ ノ 酸 配 列 5 1 4 - 5 2 7 位 に 相 当 す る 1 4 ア ミ ノ 酸 か ら 構 成 さ れ る ペ プ チ ド を マ ウ ス に 免 疫 し て ツ チ ガ エ ル A M H 抗 体 を 作 製 し た 。 免 疫 マ ウ ス か ら 得 た 抗 血 清 と ツ チ ガ エ ル 成 体 精 巣 の タ ン パ ク 質 抽 出 液 を 用 い 、 ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ 法 で A M H に 対 す る 特 異 性 を 評 価 し た 。 そ の 結 果 、 ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ 法 で １ つ の バ ン ド が 検 出 さ れ た 。 こ の バ ン ド が 示 す 分 子 量（ 8 0 k D a ）と ツ チ ガ エ ル A M H ア ミ ノ 酸 配 列 か ら 推 測 さ れ る 分 子 量 （ 6 6 k D a ） は 一 致 し な か っ た 。 し か し 、 こ の 分 子 量 の 不 一 致 は ウ シ や ヒ ト の A M H で も 見 ら れ 、 糖 鎖 が 付 加 さ れ て い る こ と が 原 因 で あ る と 結 論 づ け ら れ て い る 。 よ っ て 、 ツ チ ガ エ ル A M H も 糖 鎖 が 付 加 し て い る と 考 え ら れ た 。 続 い て 、 抗 原 が 結 合 し た 抗 体 を 用 い て 吸 収 実 験 を 行 う と 、 抗 原 量 の 増 加 と と も に 検 出 さ れ る バ ン ド の 濃 さ が 薄 く な っ た 。 こ れ ら の 結 果 か ら 、 作 製 し た 抗 体 は ツ チ ガ エ ル A M H に 対 し て 特 異 性 が 高 い と 判 断 し た 。 そ こ で 、 こ の 抗 体 と ラ ミ ニ ン （ 基 底 膜 タ ン パ ク 質 ） 抗 体 を 用 い て 雄 生 殖 腺 （ 精 巣 ） の 凍 結 切 片 を 作 製 後 、 二 重 免 疫 染 色 を 行 っ た 。 す る と 、 A M H 陽 性 シ グ ナ ル は 精 細 管 内 の 唯 一 の 体 細 胞 で あ る セ ル ト リ 細 胞 で 見 ら れ 、 し か も A M H の 局 在 は 、 そ の 細 胞 質 に あ る こ と が 確 認 さ れ た 。
第 ４ 章 で は 、 ツ チ ガ エ ル A M H 遺 伝 子 の 転 写 調 節 領 域 の 解 析 に つ い て 述 べ る 。 本 研 究 で は 、 ツ チ ガ エ ル ゲ ノ ム ラ イ ブ ラ リ ー か ら A M H 転 写 領 域 上 流 の A M H 遺 伝 子 5 ’ f l a n k i n g r e g i o n （ 3 . 1 8 k b ） を 得 て 、 塩 基 配 列 を 決 定 し た 。 そ の 内 の 転 写 開 始 点 を 探 索 し た 結 果 、2 . 4 3 k b を プ ロ モ ー タ ー 領 域 と 判 断 し て プ ロ モ ー タ ー ア ッ セ イ に 使 用 し た 。コ ン ピ ュ ー タ ー 解 析 に よ っ て 、そ の 領 域 内 に は 転 写 因 子 S o x 9 の 結 合 部 位 が 6 カ 所 あ る こ と が 分 か っ た 。 ツ チ ガ エ ル 性 決 定 お よ び 性 分 化 時 期 の 生 殖 腺 に お け る S o x 9 遺 伝 子 の 発 現 に 雌 雄 差 は 無 か っ た が 、哺 乳 類 、爬 虫 類 と 同 様 、両 生 類 で も S o x 9 が A M H の 発 現 を 促 進 す る か を プ ロ モ ー タ ー ア ッ セ イ に よ っ て 調 べ た 。 こ の ア ッ セ イ に は 、ツ チ ガ エ ル（ 2 . 4 3 k b ）あ る い は ア メ リ カ ア リ ゲ ー タ ー ( 1 . 5 9 k b )
の A M H プ ロ モ ー タ ー 領 域 を 用 い た 。ツ チ ガ エ ル S o x 9 は ツ チ ガ エ ル A M H の 転 写 を 約
No.3
1 . 4 倍 、 ア メ リ カ ア リ ゲ ー タ ーA M H の 転 写 を 約 1 0 倍 促 進 し た 。 こ の 結 果 は 、 ツ チ ガ エ ル S o x 9 は 他 の 動 物 で も A M H 遺 伝 子 の 転 写 を 強 く 促 進 す る こ と が で き る こ と を 示 し て い る 。
第 ５ 章 で は 、 A M H シ グ ナ ル を 細 胞 内 に 伝 達 す る た め に 必 要 な A M H 受 容 体 タ イ プ
Ⅱ （A M H R Ⅱ） 遺 伝 子 の 発 現 解 析 の 結 果 を 示 し て い る 。 今 ま で 両 生 類 で は A M H R Ⅱ
c D N A が 単 離 さ れ て い な か っ た 。 そ こ で そ れ を 単 離 し 、 塩 基 配 列 （ 1 6 9 0 b p ） を 決 定 し た 。 そ の 塩 基 配 列 か ら 推 測 さ れ る ア ミ ノ 酸 配 列 は 3 9 2 残 基 で あ っ た 。 ツ チ ガ エ ル と 他 の 脊 椎 動 物 の A M H R Ⅱ ア ミ ノ 酸 配 列 を 比 較 す る と 、膜 貫 通 領 域 と 細 胞 内 タ ン パ ク 質 リ ン 酸 化 領 域 に 比 較 的 高 い 相 同 性 が あ っ た 。 ツ チ ガ エ ル A M H R Ⅱ の 細 胞 外 A M H 結 合 領 域 は 他 の 脊 椎 動 物 の そ れ よ り 短 い も の と な っ た が 、そ れ は A M H R Ⅱ c D N A の 全 長 が 単 離 さ れ て い な い た め と 思 わ れ た 。単 離 さ れ た 部 分 配 列 と T G F - β ス ー パ ー フ ァ ミ リ ー 受 容 体 タ イ プ Ⅱ に 属 す る タ ン パ ク 質 の ア ミ ノ 酸 配 列 を 基 に 分 子 系 統 樹 を 作 成 す る と 、 ツ チ ガ エ ル A M H R Ⅱ は 他 の T G F - β サ ブ フ ァ ミ リ ー 受 容 体 タ イ プ
Ⅱ に は 属 せ ず 、A M H R Ⅱ グ ル ー プ に 属 し た 。さ ら に 、ツ チ ガ エ ル A M H R Ⅱc D N A の 塩 基 配 列 を 基 に 特 異 的 プ ラ イ マ ー を 作 製 し て 成 体 組 織 （ 肺 , 肝 臓 , 腎 臓 , 心 臓 , 筋 肉 , 脳 , 精 巣 , 卵 巣 ） に お け る 発 現 を R T - P C R 法 に よ っ て 調 べ た 。 そ の 結 果 、 精 巣 で 強 い 発 現 が 見 ら れ た 。 ま た 、 性 決 定 前 後 の 雌 雄 生 殖 腺 に お け る A M H R Ⅱの 発 現 を R T - P C R 法 を 用 い て 調 べ た と こ ろ 、 そ の 発 現 に 性 差 は 見 ら れ な か っ た 。
第 ６ 章 で は 本 研 究 の 総 括 に つ い て 述 べ る 。本 研 究 で は 、( 1 ) 両 生 類 初 の A M H c D N A を 単 離 し 、 そ の 塩 基 配 列 を 決 定 し た こ と 、 ( 2 ) F I S H 法 で A M H 遺 伝 子 は 第 １ 染 色 体 に あ る こ と 、( 3 ) 免 疫 染 色 法 で A M H は 精 巣 の セ ル ト リ 細 胞 で 作 ら れ て い る こ と 、( 4 ) リ ア ル タ イ ム R T - P C R 法 の 結 果 よ り 、ツ チ ガ エ ル A M H は 雄 化 生 殖 腺（ 精 巣 ）で 強 く 発 現 し て い る た め 、 A M H が 雄 生 殖 腺 の 分 化 に 関 与 す る 可 能 性 が 高 い こ と 、 ( 5 )A M H プ ロ モ ー タ ー 領 域 の 解 析 に よ っ て 、 S o x 9 に よ る A M H の 発 現 増 加 は 1 . 4 倍 で あ り 、 性 分 化 時 の 生 殖 腺 に お け る S o x 9 の 発 現 に は 雌 雄 差 が な か っ た た め 、A M H の 転 写 制 御 に は S o x 9 に 加 え 、 他 の 転 写 因 子 が 必 要 と 考 え ら れ る こ と 、 ( 6 ) A M H 受 容 体 タ イ プ Ⅱ （A M H R Ⅱ） 遺 伝 子 を 両 生 類 で 初 め て 単 離 し て 、 性 決 定 前 後 の 生 殖 腺 に お け る
A M H R Ⅱの 発 現 を 調 べ る と そ の 発 現 に 有 為 な 雌 雄 差 が な か っ た こ と 、ま た 、( 7 ) 雌 雄
の 生 殖 腺 に お い て A M H R Ⅱが 同 様 に 発 現 し て い る こ と か ら 、リ ガ ン ド で あ る A M H の 方 が そ の 受 容 体 よ り も 生 殖 腺 の 雄 化 に 強 く 関 わ っ て い る こ と が 示 唆 さ れ た 。 以 上 の 結 果 か ら 、 性 決 定 後 の 生 殖 腺 の 精 巣 分 化 に は A M H 受 容 体 で は な く A M H が 強 い 影 響 を 及 ぼ す こ と が 示 唆 さ れ た 。 今 後 は 、 ツ チ ガ エ ル 性 分 化 の 分 子 機 構 を 解 明 す る た め に A M H の 転 写 制 御 に 関 わ る 転 写 因 子 を 見 つ け る 必 要 が あ る 。ま た 、A M H の 精 巣 分 化 へ の 役 割 を よ り 理 解 す る た め 、 精 巣 の A M H 受 容 細 胞 を 特 定 す る 必 要 が あ る 。
Ｎｏ.1
早稲田大学 博士（理学） 学位申請 研究業績書
氏 名 児玉 万穂 印
（2015 年 10 月 現在）
種 類 別 題名、 発表・発行掲載誌名、 発表・発行年月、 連名者（申請者含む）
論文
◯
◯
（１） “Molecular cloning and characterization of oocyte-specific Pat1a in Rana rugosa frogs”
J Exp Zool A Ecol Genet Physiol., Vol.323(8):516-26, Oct 2015
Nakamura Y, Iwasaki T, Umei Y, Saotome K, Nakajima Y, Kitahara S, Uno Y, Matsuda Y, Oike A, Kodama M, Nakamura M.
（２） “Molecular Cloning and Characterization of Anti-Müllerian Hormone (AMH) from the Japanese Wrinkled Frog, Rana rugosa”
Endocrinology, Vol.156(5):1914-1923, Feb 2015
Maho Kodama*, Mari Suda*, Daiki Sakamoto, Takehiro Iwasaki, Yasuki Matsuo, Yoshinobu Uno, Yoichi Matsuda, Yoriko Nakamura, Shun maekawa, Yoshinao Katsu, Masahisa Nakamura.
(*These authors contributed equally to this work.)
（３） “Involvement of Androgen Receptor in Sex Determination in an Amphibian Species”
PLOS one, Vol.9(5), e939655, May 2014
Jun Fujii*, Maho Kodama*, Akira Oike, Yasuki Matsuo, Mi-Sook Min, Takashi Hasebe, Atsuko Ishizuya-Oka, Koichi Kawakami, Masahisa Nakamura.
(*These authors contributed equally to this work.)
（４） “Up-regulation of FSHR expression during gonadal sex determination in the frog Rana rugosa”
Gen Comp Endocrinol., Vol.172(3):475-86, Apr 2011
Suda M, Kodama M, Oshima Y, Yamamoto K, Nakamura Y, Tanaka S, Kikuyama S, Nakamura M.
（５） “Embryonic stem cell transplantation correlates with endogenous neurogenin 3 expression and pancreas regeneration in streptozotocin-injured mice”
J Histochem Cytochem., Vol.57(12):1149-58, Dec 2009.
Kodama M, Tsukamoto K, Yoshida K, Aoki K, Kanegasaki S, Quinn G.
（６） “Deficiency of Myo18B in mice results in embryonic lethality with cardiac myofibrillar aberrations”
Genes Cells., Vol.13(10):987-99, Oct 2008
AjimaR, Akazawa H, Kodama M, Takeshita F, Otsuka A, Kohno T, Komuro I, Ochiya T, Yokota J.
（７） “Pancreatic endocrine and exocrine cell ontogeny from renal capsule transplanted embryonic stem cells in streptozocin-injured mice”
J Histochem Cytochem., Vol.56(1):33-44, Jan 2008
Kodama M, Takeshita F, Kanegasaki S, Ochiya T, Quinn G.
（８） “Streptozotocin-induced partial beta cell depletion in nude mice without hyperglycaemia induces pancreatic morphogenesis in transplanted embryonic stem cells”
Diabetologia, Vol.49(12):2948-58, Dec 2006
Takeshita F, Kodama M, Yamamoto H, Ikarashi Y, Ueda S, Teratani T, Yamamoto Y, Tamatani T, Kanegasaki S, Ochiya T, Quinn G.
Ｎｏ.2
早稲田大学 博士（理学） 学位申請 研究業績書
種 類 別 題名、 発表・発行掲載誌名、 発表・発行年月、 連名者（申請者含む）
講演
（９） “FGF-4 regulates neural progenitor cell proliferation and neuronal differentiation”
FASEB J., 20(9):1484-5, Jul 2006
Kosaka N, Kodama M, Sasaki H, Yamamoto Y, Takeshita F, Takahama Y, Sakamoto H, Kato T, Terada M, Ochiya T.
（１） “Molecular Cloning and Characterization of Anti-Müllerian Hormone (AMH) from the Japanese Wrinkled Frog, Rana rugosa”
7th International Symposium on the biology of vertebrate sex determination, Hawaii, USA, Apr 2015
Maho Kodama, Mari Suda, Daiki Sakamoto, Takehiro Iwasaki, Yasuki Matsuo, Yoshinobu Uno, Yoichi Matsuda, Yoriko Nakamura, Shun maekawa, Yoshinao Katsu, Masahisa Nakamura.
（２） “アンドロゲンとその受容体はツチガエルの性を決める？”
第 84 回日本動物学会, 岡山, 2013 年 9 月
児玉 万穂、藤井 淳、松尾 安希、長谷部 孝、岡 敦子、中村 正久
