関す 研究 義 床 的意 そ 臨 J く け 腎細胞 癌

金沢大学 十 全 医 学会 雑 誌 第94巻 第6 号 1 0 5 ト 1 06 1 く1 98引 _{1 0 51}

腎細 胞癌^に おける h ^{u m o r a}l le uk o cyte ad h e r e n c e

in h ibⁱtio n く^{H −}L A IJ ^{a s s a}y とそ ^の臨床的 意 義 ^に 関 す ^る 研 究

金沢 大学 医学 部 泌 尿器科 学講 座 く主 任^こ久住 治 男教 掛

越 田 潔

く昭和60年^{1 1}月8 日受付I

腎細 胞 癌 ほ C Cうに特 異 的^{な 血}清 学 的 診断 法の確 立_を目 的^に， 摘 出 腫瘍 組織か ら腫瘍 関 連抗 原を抽 出し， これ を試験 抗 原と す る mic r oplate 法^によ る hu m o r al le uko cy te ad he r e n c e inh ib itio n a s s ay く以 下 H ⁻L A I a s s ay と晰^の臨 床 的有用性を検 討し た． 腎細 胞痛 手術 材 料よ り抽 出し た不 溶性 分 画を デ オ キ^シ

コ ^ー ル酸 塩で可溶 化し，aff in it y chr o m atogr aphy によ り脱ア^ルブ ミ^ン処理 し た抗 原 分 画を免 疫抗 原と し，

モ ル モ _ットに抗 血 清を作 製し た^． 正常^ヒト 血清^によ り十 分に吸収を行った抗血 清を 用い，Sepha c ryl S⁻2 0 0 のゲル濾 過^{に お}け る抗原 活 性を測 定し， 分子量約^{6 0}，0 0 0の ピ^ー ク を得た． つい で， 同ピ^ー ク分 画を試験 抗 原と し て H⁻L A I a s s ay を改 変し たmic r oplate 法の実施 条 件を検 討し， 至適 白 血球 数， 5 Xl O^Sc e11sノ^ml，至 適抗 原 分 画波 及 ⁵⁰ 鵬 蛋 白ノml，至適 被 検血清濃 度， 0^■2 5％という結 果を得た^． これ ら の条件^に基づいて 腎細 胞 癌症 例5 0例を含む 1 2 6例^に対して， H⁻L A l a s s ay を施 行し た^． 結 果は， ad h．e r e n c e in de x くA Iい^こ よって 示 し た． 腎細 胞 癌5 0例にお け る陽 性 率は， 2 215 0 例 く4 4％， で， 病 期分 類別^に見る と， Stage I ，

9J¹5例 く6 0％lニII， 5ノ9例 く5 6％トH 払 3ノ1 2例 く2 5％，ニIV， 5ノ1 4例 く3 6％1 で あ り， lo w stage

群 くstag^e I， IIl に高^い傾 向^にあり， A I にお いて も lo w stage 群は， h igh ^stag^e 群 くstageIII，I Vl と の間に有 意差くp く0^■0 1ほ 示 し た． 手術 後3 ケ月以 降の検 討で は， 術 前に L A H 場性で あ り， 術 後再 発兆 候 が認め ら れ なか った 10例は，いずれ も陰 性で あ^った が，術 後に再 発転 移を認め た 6 例で は， 2例が陽 性を，

4 例は陰 性を 示 し た^． 以 上 よ り， mi c r oplate 法によ る H ^．L A I a s s ay は， 腎細 胞 癌^の血 清学 的 診断^上， 有 用 な ^一手段と考え ら れ た．

Key ^{w o r}ds hu m o r al le uk o cy t^{e a}d he r e n c e inhib itio n a s s ay， mic r oplate

，r e n al

C ell c a r cin o m a，tu m O r⁻a S S O Ciated a nti_ge n

腎細胞 癌 くR C Cう^に対す る治 療に関し て， 未だ有効 な化学療 法は確立 さ れ ておらず， ま た放 射線 療 法に対 す る感受性も低^{い こ}と よ り，早 期^の外 科 的療 法のみ が，

治癒を も た ら すであ ろ う^こと は諭を ま た な^いのが卿犬 で あ る． C T スキャ ンや超 音 波な どの画 像 診 断^の普及 は， 腎細胞 癌^の早 期発 見に大い に貢献し^{て い}る が， し ば し ば鑑別 診断^の困難な 症例^に遭遇す る． こ の見 地よ り， 腎細 胞 痛^の血 清 学 的 診 断^は臨床 的^に非 常に重要な 意義を担うの であ る が， 今まで のところ臨床 的に有用 な腎細胞 癌^に特異的な腫 瘍^{マ ー} カ ^ー は見 出^{さ れて い}な い

． 最近， 免疫 学 的 診 断法^{の 一 つ}と さ れ る白 血 球付 着 A b bre viatio n s ニ N H S ，n O r m al hu m a n s e r um ニ

阻止試験 く1e uko cy te ad he r e n c e inh ibitio n a s s ay，以 下 L A I a s s ay と田別^の腎細 胞癌に おけ る成膚が， 岡田^り によっ て報 告さ れて いる が， これ は Gr o s s e rら²切 方 法に準じ たtube L A I a s s ay によ る もので， 患 者^の新 鮮 白血球を 必要と し て^いる^． これに対し て， Sa n n e r

ら³鳩 患 者血清を使用 す る hu m o r al le uko cy te ad he r e n c einh ib itio n a s s ayく以下甘 L A I a s s ay と晰

によ り， 2， 3 の癌^の血清学 的 診 断を行^っ ている が，

腎細胞 癌^につい ては触れて いな^い． そこ で著者は， 腎 細 胞癌 組 織よ り 腰瘍 関連 性の高^い抗 原を抽 出して試験 抗 原と し， H−^{L A I 法を改 変し た mic r oplate} 法の実施

P B S，pho sph atebuffe r ed s alin eニR C C

，r e nal

C ell c a r ci_{n o m a三}R P M I 1 6 40，R o s e w ell Pa rk M e m o rial In stitute T is s u e C ultu r e M edi um 16 4 0．

1 0 52 越

条件を設 定後， その臨床 的 有用性を検 討し たの で， そ の成 績を報告す る．

対 象^およ び方法

I ． 対 象

対 象は， 組 織 学 的^に腎 細 胞 癌と証 明さ れ た 5 0 例 く^stage I ， 1 5 こII， 9 こ u I， 1 2こI V， 14l， およ び そ の対 照 群と し て腎 細 胞 癌 以 外の泌 尿 性 器悪性 腫 瘍1 9 例 く前立 腺癌， 8 こ膀 胱癌， 4 こ皐 丸 腫瘍， 3 こ陰茎 癌， 1 こ腎孟癌， 1 こ尿 管 癌^， い 腎碧 性組織 球腫，11，

泌尿 性器 良性 疾患1 9例く尿 路結 石，7 ニ前立腺 肥 大症，

5 ニ前 立腺 炎， 4 こ副皐 丸 炎， 2 こ腎孟 炎， 1I， 健康 成人 3 8例の合計1 2 6例である^．腎細 胞 癌の病 期 分 類は Robu s o n ら⁴¹の そ れ^に従^った．

工工． 抗原^の作製

手 術 時^に得ら れ た摘 出腎を， 腫瘍 部 分と 正常 実質 部 分^に分け， 生 食で洗 浄し， 月旨肪組 織， 結 合組 織^およ び 壊死 部 分を で き る だ け除去し た後^にそ れ ぞ れ ⁻40⁰C で 凍 結 保 存し た^． 凍 結さ れ た組 織を室 温で融 解し，

O kada らの方 法^町に従^って， 不溶 性畢^{自 分画を抽 出し}

た． こ の不 溶分^{画に，5 倍 容量の 0．2％デ オ キシコ ー ル} 酸ナ ト リ ウ^ム液 くs od iu m de s o xycholate， 以下D O C と略1 を加え て ホ^モジ ナ イ ズ し， 4⁰C ^にて 4 8 時 間 渡拝 後，1 0，0 0 0 g で 3 0 分間 冷却 遠心 し て上 清を得た． 沈 渡 を再び 0．2％D O C で 4 8 時 間，4 ⁰C で捜 拝し， 2 回の抽 出上 帝を合わ せ て，これ に 1 0 倍 容 量^の冷ア^{セ ン} ト を加 え て ⁻2 0⁻C で ^一 晩静 置し， 生じ た沈殿を低速 遠 心で集 め， 小量 の蒸 留水^に溶か して_， 3，0 0 0g で1 0分 間遠心 し た^． その上清を Sepha r o s e 4 B く^{P ha r ma cia Fin e} C h^emi c als，S w ede nンの カ ラ^ム く1^，5 ^X4 0 c ml に負荷 し， 0．1 M P B S くpH 7^．41 で溶 出し， 0^．D^．2 8 0n m に よ る低分 子^のピ^ー ク ぐ⁻pfr 2^，， と呼^ぶ1 を集め， 冷 室

に おけ る風 乾 法^によ り 1 0 mg 蛋白ノml前 後^に濃 縮し た． つ いで， B lu eSepha r o s e C L⁻6 B くP ha rm a CiaJ ^の カ ラムを使 用し て， 脱アルブ ミン処理 を行っ た． す な わ ち， 4g のゲ^ルを蒸 留 水で膨 潤 後カ ラ^{ム に}充 填し，

0^．1 M K CI⁻0^．0 1 M ト リ^ス塩 酸バ ッ フ ァ^ー ， pH 7^．0で

平衡 後， 1 5 mg 蛋 白^の抗 原を負 荷し て同バ ッ フ ァ^ー で

溶 出し， 0^，D^．28 0 n m の ピ^ー ク を集め た． これ を P B S で透 析 後， 蛋白 浪度1^．0 ⁻2^．5 m g に濃 縮し て ⁻4 0⁸C で 保存し た． なお_， 蛋 白 定量^{は Lo w r}y 法^61によ^った． こ の段 階での抗 原 収量は腎細 胞 癌 組織10 _g く湿 量う あ た り 2 ⁻ 5 mg で^{， こ}れ は抽 出組 織 重 量^の0^．0 2 ⁻0^．0 5％

に相 当し た． ま た， 摘 出 腎より 得た健 常部 腎組織^およ び剖検よ り得た 正常臓 器 く肝， 肺， 牌う に つ いて も，

同様な方法^によ り， 一−

pfr 2^，， を作 製し， 正常臓 器 抗 原 と して使 用し た．

H l． 抗血清^の作 製お よ び吸 収

4 個の腎細 胞 癌 組織よ り， 上述^の方 法^によ り作製し た部 分 精 製 抗原を 用^い， 体重約⁴0 0g の モ ル モット4 匹 を そ れ ぞ れ免 疫し た．抗原分画0^．5 mlく蛋 白量 0．ト 1^．2 5 m gl に等量のFr e u nd^{，s c o m}plete adju v a ntを加

え^て乳 化し， 背 筋 内数ケ所^に分 割 注射し た^． 1週間隔

で4 回免疫 後， 最終 免 疫^{よ り 1 過}日^に心穿 刺^によ り全 採 血し， 分 離し た 血清を−^400Cで保 存し た． ヒト 血清 を結 合 し た BrC N ⁻a Ctiv ated S epha r o s e 4 B くPa rm a Cial の カ ラム に，得ら れ た抗 血 清を負 荷し，0^．1

M 重 炭 酸ナ ト リ ウム液で溶 出し， 0．D．2 8 0 n m のピ^ー ク を集め て元の血 清量にま で濃縮し た^{． ヒ}ト血清との

交差反応が， e n Zym e⁻1iⁿked i^{m m} u n o s o rbe nt a s s ay

く以下E L 工S A と略Iで陰 性を 示 す ま で， 吸収操 作を反 復し た後，硫 酸ア^{ン モ ニ}ウ^ム3 3％飽 和^によ り 工gG 分画 を分離し， P B S ^で透 析後， 使用 し た^．

N ． E L I S A

9 6 w ell mic r oplate く^{Nu nk Im m u n oplate I−96 F，}

De n m a rkl を使用 し， 0^．0 5 M 重炭 酸バ ッ フ ァ^ー ， pH

9．6 で適 当濃 度^に希 釈し た抗原資 料1 0 0_月l を^{w e}llに 入 れ， 4

0

C で ^一 晩吸着さ せ た． P B S⁻T w e e n 液く0．05％ Tw e e n2 0， 0^．1 5 M NaCl，0^．0 1 M P B Sl ^で3 回洗浄 し た後，1 5 0J^Ll のb lo ck ingbuffe rく2％ウシ血 清アル ブ ミン含 有P B Sl を 入 れ， 3 7⁰Cで2 時 間 静 置^{し た．} P B S⁻T w e e n 液で3 回洗浄 後， 吸収 抗 血 清^のI_gG 分画

を 0^．5％ウ^シ血清ア^ルブ ミンを含ん だ P B S⁻T w e e n液

で5 0 0倍^に希 釈し，その1 0 0J^Ll を各w ell ^に入 れ，3 r C で 2 時 間静 置し た^． 3 回洗 浄後， パ ^ー オ キシダ^ー ゼ標 識 抗^{モ ル モ} ット IgG 家 兎 抗血清 くCap pel Lab^．U S A l

を P B S⁻Tw e e n 液で2，0 0 0倍に希 釈し， そ^の1 00_J^Ll を

w ell に入 れ 3 7⁰C で 2 時 間 静置 後， 6 回洗浄し た．

0^． フェ ニ レ ンジ ア ミンを加え て 1時 間室 温で静置後，2．5 M H 2S O4，10 0 声1 を加え る^こと^によ り反 応を止 め， 波 長49 2^{n m} の 吸光 度を M i^{c r o}plate Re ade r C M R 60 0 くDyn ate ck，U S AI ^にて測 定し た^．

V ． 分 子 量 測定

Sepha r o s e 4 B およ び B lu e Sepha r o s e によ り部分 精 製さ れ た抗 原く蛋白量 2^．5 m gノmu ^lO ml を Amic o n

Y M 3 0 fil^{te r} によ り 4 ^ml に濃縮し， これ を Sepha c ryl S⁻2 0 0くPa r ma cial の カ ラ^ムく4 X8 6 c ml ^に負荷し，

P B S を溶 出液と し て ゲ^ル濾過を行^い， 溶 出液^の0．D⁻ 2 8 0 n m の測 定と， 吸 収 抗血清を 用^いた E L I S A ^によ る

抗 原^の活 性測 定を行った．

VI^． Hu m o r al I．A Iく^{H−L A I}I 法

健 康 成 人よ り^{ヘ パ}リン加 末 梢血，約2 0 ml を採 取後^， 滅 菌 試 験 管^に移し， 3 7⁰C で1時 間 直立静 置して， 白血 球の豊 富に含ま れ た 上清を採 取し た^{． こ}れ を 2 0 0g で

．^二 一．

−ノ

．^こ

．．

．^ミ

．．^こ

．^二1

．−

．．．．^こ

．^二 一．

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．^こ

．．

．^ミ

．．^こ

．^二1

．−

．．．．^こ

腎細 胞 癌に おけ る H−^{L A I a s s ay}

5分間遠 心し， 沈 壇^に血清を含ま な^い R P M I 1 640く以 下メ ディ ウ ムと す る1 を 5 ml加え， ピペ ッ トによ り洗 浄後，再び 2 0 0 g で 5 分 間 遠心 し た． 沈 漆^に対して蒸 留 水^{4 m}l を入 れ， 2 0秒 間ピペ ットで軽く按押して赤 血 球を破壊し た後，6 ml の メディウムを加え て 5 分 間遠 心 し， 沈 殿し た白 血球に対し て適 量^のメ ディウ^ムを加 え る^こと^によ り， 4 ⁻ 6 Xl O⁶c ellsl^ml の細 胞 浮遊 液を 作製し た． これに等量の 0^．0 2％ト リ プ^{シ ン}くTy pe I ，

Sig^{m a}，U S Al を加え， 室 温^{にて 4 5} 分 間振 過 渡和によ り白血球膜 表 面を処置し た後， メディウム で2 回洗 浄 し， 細 胞 数5 Xl O⁵c ellsl mi に調整し た． 先にSepha^． c ryl S^．2 0 0 を用^いて部 分 精 製し た抗 原分 画を P B S で 5 0J^Lg 蛋 白Iml に希 釈 し， mic r oplate くNo．3 0 3 4，

Falc o n P la stic s Co．， U S Aン^{に ツベル}ク リン注射 器と 2 6 G 注 射針を 用^い w ellあた り^一 滴 ず^つ落と し た^． つ いで， 5 ^Xl O⁵c ellsノmlに調 整し た白血 球を ^一 滴， さ ら に， メ ディウムで 0^，7 5％^に希 釈し た腎細 胞癌 症 例 あ^る

いは対 照 群^の血清サンプル を ^一滴 加え， 3 アCのイ ン キ^{ュベ ー} タ^ー 内^に5 ％C O2環 境 下で 9 0分 間 培 養し た．

その後プ^{レ ー} ト を室温 で 10 分 軌 細 胞 付 着 面を下^にし て静置し， 非 付着 細 胞を浮遊さ せ た ところ で， そ の ま ま生食 中^にプレ^ー ト を浸し，上 下にゆっく り と 1 0 回往

E 2 −0

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1 0 5 3

復さ せて_， 非付 着 細 胞の除 去を行^った． つ いで プ^レー ト を 1 0 0％^メタノ ^ール で1 0 分 間 固定^し，ギムザ液で 2 0 分 間染 色 後， メタノ^ー ルで 1 0 分間 脱 色を し た上で，

一

晩室 温^にて乾 燥さ せ，白 血 球 数を Auto m atic Pa rticle

Co u nte r，C P 2 0 0 0 syste mくS h ir aim ats u，Jap^{a n}い^こよ り計 測し た． 実験は ^一 検 体^{に つ} き 6 ⁻1 0 w ell を使用 し， そ の平 均 値を もっ て付着 細 胞 数と し た． ま た， 以 下の式よ り^ad he r e n c e in de x く以下A I と略l を求め，

腎細 胞癌 症 例群^と対 照 群を比 較検 討し， さ らに腎細 胞 癌 症例^{に お} け る臨床 経 過との相 関を検 討し た．

A d he r e n c einde x くA Il ^ニ

くM e a n No．c e11sin w ells wi th a ntige n ⁻ Me a n No．

C ells in w ells witho ut a nti_ge nllM e a n N o． c e11s in W ells witho ut a ntige n

用． 統 計 学 的 検 定 法

各 群の A I の有 意 差 検定は，Stude n^，s t^．te st によ り 行^った．

成 績

1 ^． E l 王S A の成績

吸 収抗血清^の4例^の腎細 胞 癌 抗原およ び 正常 臓 器 抗 原^に対す る do s e⁻r e SpO n S e C u rv e の ^一 例を図1 に示

土間^{ge n}

N HS liv 8 r

k 嘉d n ey 1 ．56 3 ．1 2 6 ．2 5 1 2 ^．5 2 5 5 0 10 0

A nti_g e n c o n c e ntr atio n s く_{p g l} mIJ

F_{i g}．1． Do s e r e spo n s e c u r v e s of a ntis e r u m to r e n alc ell c a r cin o m a sくR C C l⁻4ン^{o r} s e v e r al

n o r mal tis s u e e xtr a cts by e n zy^{m e−}1inked im m u n o s o rbe nt a s s ay く^{E L I S A}l^．T he tis s u e e xtr a ctsfr o m v a rio u s s o u r c e s w e r ebo u nd to the w ells of a mi c r oplate a nd a n a ntis e r u m W a S ad ded■ T he a mo u nts of r e a cted a ntis e r u m w a s m e a s u r ed by p^{e r o x}i da s e^．c o nJugated

a

n ti⁻guin e a pi_gI_gG a nd o⁻phe nyle n ed ia mi n e，a nd m o nito r ed at49 2 n m ．