血漿 リポ 蛋 自の細分画 とその臨床 的意義
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(2) 臨 床 化 学 ・第11巻 ・第4号(1982). Table I Cholesterol (Ch), triglyceride (TG) and phospsholipid (PL) concentrations in plasma (P), VLDL+LDL (V+L), HDL2 (H2) and HDLs (H3) and HDL2-lipids/HDLs-lipids ratios in controlssg. High. density. lipoprotein. Ultracentrifuge. Fig.. spectrum. flotation. 1 Schematic. (〓1. analysis. HDL spectrum. .20rate). by analytical. ultracentrifugation4.. 細 分 画 す る とと もに定 量 化 して い る。 Andersonら. は,HDL2分. 画 が さ ら にHDL2b. (1.063―1.1009/ml)とHDL2a(1.100―1.125 g/ml)に. 分 け られ,正. Fig.1の. ご と くで あ る こ と を 示 し た4)。 正 常 人. の 検 索 に て,男 HDL2aの. 常 人 のschlieren像. 性,女. は,. 性 と も に 血 漿HDL2b,. 濃 度 は と も にHDLコ. レス テ ロール. と 強 い 正 の 相 関 が 認 め られ た 。HDL3はHDL2b と 負 の 相 関(r=‑0.315)を お よ びHDL‑コ. 示 し た が,HDL2a. レス テ ロ ール とは 相 関 を示 さな. か っ た 。 従 っ て,HDL2bとHDL2aが b)分. てHDL‑コ. 析 用 超 遠心 法. リポ 蛋 白 の 浮 上 ま た は 沈 降 に は,リ 子 と 溶 媒 と の 間 の 摩 擦,即 溶 媒 の 理 化 学 的 性 状,お. ち,リ. ポ蛋 白粒. ポ蛋 白粒 子 と. よ び遠 心 力 が 関与 して. い る 。 リポ 蛋 白 の 分 析 用 超 遠 心 法 に よ る 分 析 方 法 の 詳 細 は,Lindgrenら2)や. のGofmanら. ル フ ォル ニ ア のDonner. Laboratory. の一 派 の 分析 用 超 遠 心 法 に よ るシ. さ ら に2っ. の 亜 分 画,即. ちH‑. は,こ. の シ ュ リー レ ン. 像 を コ ン ピ ュ ー タ解 析 す る こ と に よ り,さ 254. gradient. よ り分 画 す る 方 法 が 報 告 で 述 べ る 様 にanalytical よ り見 出 され た 。HDL2b. c)ゾ. ー ナル 超 遠 心 法. ゾ ー ナル 超 遠 心 法 は 一 種 の密 度 勾 配 によ る. 分 析 は,Wilcoxら. に よ り報 告 さ れ た5)。. さら. に,Patschら6),Kostner7)ら,Laggner8)ら,Pat‑. 分 画 に 分 け られ る こ と が 報 告 さ. れ て い る 。Lindgrenら. さ れ る と と も に,後 ultracentriugationに. に よ り,density. 超 遠 心 法 で あ る 。 こ の 方 法 に よ る リポ 蛋 白 の. DL2(1.063―1.125g/ml)とHDLs(1.125― 1.200g/ml)の. 最 近,Andersonら ultracentrifugationに. 分 画 も こ の 方 法 に て と ら え られ て い る4)。. ュ リ ー レ ン 像 か らの 分 析 よ り,HDL(1.063‑ 1.200g/ml)は. レス テ ロー ル を反 映 して い る と報 告. した 。. 八 杉 ら3)の 論 文. を参 照 され た い 。 従 来,カ. 主 とし. らに. sch9)ら に よ り,応 用 発 展 さ せ られ た 。Patschら は,HDL2とHDL3の. 良 い 分 離 を 得 る た め に,. 直 線 的 密 度 勾 配 よ り もFig.2の. 様 な3段. 階の.
(3) 〈特集〉血漿 リポ蛋 白の細分画 とその臨床 的意義 れ るこ と を 報 告 し て い る。 ゾ ー ナル ロ ータ ー に て 分 画 さ れ たHDL2,HDL3の て,Patschら HDL亜. は,III型. 意 義 につい. 高 リポ蛋 白血 症 にお け る. 分 画 に 対 す るclofibrateの. 効 果,正. 常. 人 に 対 す る ニ コ チ ン酸 の 影 響 を 観 察 し,HDL‑ コ レ ス テ ロ ー ル の 上 昇 と と も にHDL2/HDL3 比 の 増 加 を み た11)12)。 こ れ は,Blumら13)が. 従. 来 の 分 離 用 超 遠 心 法 を 用 い て ニ コ チ ン酸 の 効 果 を 検 討 し,HDL2/HDL3比. の増 加 を報 告 した 成. 績 と呼 応 す る もの で あ る 。 d)不. 連 続 密 度 勾 配超 遠 心 法. ス ウ ィ ン グ ロ ー タ ー を 用 い て,密 Fig.. 2 Elution. patterns. of HDL. 度 勾配 液 中. of zonal に て リポ 蛋 白 を 分 画 す る 方 法 で あ る 。. ultracentrifugation6.. Redgraveら14)や,Foremanら15)に VLDL,LDL,HDLの 密 度 勾 配 を 用 い て 行 な っ て い る 。Patschら 成 績6)で は,こ. の 方 法 で はFig.2の. HDLはHDL2とHDL3に. の. ご と く,. 相 当 す る2つ. の分. 画 に 分 画 さ れ た 。 この 両 分 画 の 脂 質 組 成,浮 係 数,粒. に お い てApo. 分画. 分 画 法 が 報 告 さ れ た 。Chung. 直(vertical)ロ. ー タ ー に よ っ て も上 記. の 様 な 分 画 が 可 能 な こ と を 示 した17)。. A‑II比. Shepherd10)ら. がHDL3. 質,蛋. い 方 法 で あ る の で,HDLの. 白 を測 定 す る こ. 分 画 を 定 量 す る こ とが で き る 。 に よ れ ば,HDL‑コ. A‑IはHDL2と. 気泳動 法. 電 気 泳 動 法 は 機 器 の 面 か ら も最 も親 しみ や す. こ の 方 法 に よ りHDL2,. 画 を 分 取 し,脂. と に よ り,各. 2.電. ポ 蛋 白 組 成 で はHDL2. A‑I/Apo. に 比 し大 で あ っ た 。. ル,Apo. HDL2,HDL3の. よ りHDL亜. 子 サ イズ は分 析 用 超 遠 心 法 によ る成 績. と一 致 し た 。 ま た,ア. HDL3分. 上. 分 画 法 が 報 告 さ れ,次. い で 最 近,Chapmanら16)に. らは,垂. よ り,. レス テ ロ ー. 相 関 し た が,HDL3. 細 分 画 に つ い て,. 電 気 泳 動 法 に よ る種 々 の 試 み が な され て きた が,こ こで は 主 と し てgradient resisに. よ るHDL細. a) Gradient. gel electropho‑. 分 画 法 に つ い て 述 べ る。. gel electrophoresis(GGE). と の 相 関 を 認 め な か っ た 。 女 性 に お け るHDL‑ コ レ ス テ ロ ー ル,Apo. A‑Iの. gradient. 高 値 はHDL2の. gel. electrophoresis. (GGE) は使. 増 加 に よ る もの と の 成 績 が 得 ら れ た 。 こ の 方 法. 用 す るポ リア ク リル ア ミ ドゲ ル の 濃度 を あ る一. の 利 点 の 一 つ は,1回. 定 の 濃 度範 囲 で 連 続 的 に増 加 させ,そ のpore. のprofileを た,こ. の 超 遠 心 に てHDL分. 知 る こ とが で き る こ とで あ る 。 ま. の 条 件 下 で は,リ. ポ 蛋 白 の 変 性 も少 な. い と 報 告 さ れ て い る 。 し か し,15〜20mlの 清 を 必 要 と す る 難 点 が あ る 。Patsch9)ら HDL2,HDL3分. 画 を さ ら に2お. 分 画 に 分 け 性 状 を 検 討 し,平 mlの. 画. か な り均 一 なHDL2分. よ び5つ. 血. sizeを 次 第 に小 さ くす る こ とで 分 析 す る蛋 白粒 子 の 大 き さ,即 ち分 子量 に応 じて その 移動 度 が 決 定 され る電 気 泳 動 法 で あ る。 本 法 は一 般 に各. は,. 種 蛋 白,と. の亜. 広 く用 い られ て い る。 本 法 を リポ蛋 白粒 子 の 性. 均 密 度1.096g/ 画,1.140g/mlの. くに高 分 子 量 の 蛋 白の 分 子 量推 定 に. 状 把 握 に応 用 した報 告 は す で に1969年 にみ られ るが,HDLに. つ い て 分 析 した 報 告 と して は,. 組 成 の か な り不 均 一 なHDL3,さ. らに 量 的 に は. Andersonら4)が. 少 な い が,1.160g/mlのHDL3亜. 分画 に分 画 さ. たHDLの. 密 度 勾 配 超 遠 心 法 にて 得 られ. 各 分画 を分 析 した もの が,ま. た, 255.
(4) 臨 床 化学 ・第11巻 ・第4号(1982). Weisgraberら18)がheparin chromatographyに Apo. E,HDL2. Sepharose. affinity. よ り分 離 し たHDL2 without. Apo. Eを. with. 分 析 した 報. 告 な どが あ る。 この様 に種 々 の 方 法 に よ って 得 られ たHDL亜. 分 画 をGGEに. よ り,分. 子量. の 大 小 の 面 か らそ の 特 徴 を と ら え る こ とが で き る可 能 性 が あ る 。 そ こで 著 者 は,分. 離用 超 遠 心. 法 に よ り得 られ たHDL2,HDL3分. 画 をGGE. に よ り分 析,検. 討 し た19)。. 健常人 よ り早期 空 腹 時 に 得 られ た 血 漿 を Havelら. の 方 法 に 準 じ た 超 遠 心 法 に て,HDL2. (1.063<d<1.125g/ml)とHDL3(1.125<d< 1.210g/ml)に EDTA. 分 画 し,0.15MNaCl,3mM. pH7.4に. 対 し て 十 分 透 析 し た 。GGE. はAnderson,ら てgradient. の 方 法4)に gel. PAA. Chemicals)(gel濃. 準 じ てgelと. 4/30(Pharmacia. 度 が4%〜30%と. し Fine. 連続 的 に. 増 加 し て い る ポ リ ア ク リ ル ア ミ ドよ りな る ス ラ ブ ゲ ル)を 使 用 し,Tris 8.35下. に て,試. borateバ. ッ フ ァー,pH. 料 無 添 加 の 状 態 で70ボ ル ト,. 30分 予 備 泳 動 した の ち,試 料 を 添 加 し,120ボ ト,4℃. に て15時 間 泳 動 し た 。 固 定,染. %TCA下0.01%Coomassie に て,脱. ル. 色 は10. brilliant blue. R. 色 は 蒸 留 水 に よ り拡 散 さ せ て 行 っ た 。. そ の 他 の 染 色 法 と し て10%. amido. る蛋 白 染 色,Sudan. Bを. ning法. black. blackに. よ. 用 い たprestai‑. に よ る脂 質 染 色 もあ わせ て検 討 した 。. 分 析 に 用 い た 試 料 は 蛋 白 量 に し て10〜20ug で,分. 析 前 にTris. borateバ. ッ フ ァー にて 充 分. 透 析 した 。 ま た カ リ ブ レ ー シ ョ ン 蛋 白 と し て. Electrophoresis weight weight. calibration. determination proteins. Fig. 3 Gradient gel electrophoresis of HDL2 (H2) and HDL3(H3).Densitometry of patterns is shown19.. kit for molecular of. (Pharmacia. high. molecular. Fine. Chemicals). を 使 用 し た 。 泳 動 像 の デ ン シ トス キ ャ ン ニ ン グ は 島 津2波 いた 。. 長 ク ロ マ トス キ ャ ナ ーCS‑900を. heparin-Sepharose. tographyはWeisgraberら. affinity. 用. chroma-. の 方 法18)に. 準 じ,. 度 よ り求 め た 。 HDL2,HDL3 blue. R染. の 泳 動 像 (Coomassie 色)お. がFig.3で. あ る 。gel濃. 溶出塩濃度 を 0.05M,0.095M,0.29M,0.6M. 連 続 的 に 増 加 し て お り,し. と段 階 的 に 増 加 きせ,溶. sizeは. 出 させ た 。溶 出 され た. 各 分 面 の 蛋 白濃 度 は波 長280nmに 256. お け る吸 光. brilliant. よ び そ の デ ン シ トス キ ャ ン 像 度 は 上 方 か ら下 方 へ た が っ て そ のpore. 下 方 に 向 って次 第 に小 さ くな って い る。. 上 端 が 陰 極,下. 端 が 陽 極 に セ ッ ト され て お り上.
(5) 〈特集〉血漿 リポ蛋 白の細分画 とその臨床的意義. 端 に 添 加 さ れ た 試 料 は 陽 極 側 に 移 動 す る が,終. ドの パ タ ー ン が 両 者 で 異 な り,か. 局 的 に は もは や 通 過 で きな くな っ たpore. ドはII型 高 リ ポ 蛋 白 血 症 患 者 で は 減 少 し て い た. size. の と こ ろ で 停 止 す る。 した が っ て 本 法 で は 添 加. と報 告 し て い る 。. さ れ た 試 料 の 電 気 的 荷 電 状 態 で は な く,そ. dient. 子 の 大 き さ(分. 子 量)に. れ る 。 泳 動 像 は1つ. の粒. 応 じて 移 動 度 が 決 定 さ. の は っ き り したバ ン ドと し. gelの. っHDLバ. ン. し か し上 記 の 報 告 で のgra‑. 濃 度 範 囲 は 報 告 者 に よ りま ちま ち. で そ れ ぞ れ の 成 績 を 比 較 す る こ とが 困 難 で あ る 。 ま た 分 析 し た 試 料 は 血 漿 で,リ. ポ蛋 白全 体. で て は な く幅 を も っ た 像 と し て 現 わ れ て お り,. の プ ロ フ ィ ー ル を と ら え る た め の もの で あ っ. HDLのheterogeneityを. た 。 こ れ ら と は 別 にAndersonら4)は4〜30%. はHDL2に. 裏 づ け て い る。HDL3. と比 較 的 高 濃 度 の範 囲 で濃 度 勾 配 を もつ市 販 の. 比 し 明 ら か に 泳 動 距 離 が 大 き く,し. た が っ てHDL3が. よ り分 子 量 が 小 さ い こ と が. 確 認 で き る)d<1.063g/mlの LDL)も. cia)を. リ ポ 蛋 白(VLDL,. 分 析 した がgel上. slab gel(gradient. 方 に と どま った ま ま. gel PAA. 用 い てHDLを. 4/30,Pharma‑. 泳 動,分. 析 した 。彼 らは. 密 度 勾 配 超 遠 心 法 に よ りHDL(1.063<d<. で あ っ た 。 分 子 量 の 対 数 と相 対 的 移 動 度(Rf). 1.210g/ml)を. の 座 標 に カ リブ レ ー シ ョ ン 蛋 白 の 結 果 を プ ロ ッ. をGGEに. トす る と き れ い な 直 線 関 係 が 得 ら れ,こ. の直線. 動 距 離 は 高 比 重 の も の か ら順 に 大 き く な っ て. 画 の みか け 上 の 分 子 量 を算 出 し. お り,各 分 画 の 泳 動 像 の デ ン シ トス キ ャ ン 像 を. よ りHDL分. 比 重 毎 に12分 画 に 分 け,各 よ り 泳 動 し た 結 果,そ. た 。 そ の 結 果HDL2は(1.9〜3.3)×105,HDL3. 総 合 す る とHDLは. は(1.2〜2.9)×105で. た(I:d=1.090‑1.098g/ml,II:d=1.108. あ っ た 。 こ う して 計 算 さ. れ た 値 は 試 料 と し て 用 い たHDLが 子 で あ る の で,そ が,従. リポ 蛋 白 粒. の 正 確 な 分 子量 とは い えな い. 来sedimentation. equilibrium. HDL3の. 分 子 量 の 値 と大 き な 隔 た りは な く,. GGEの. 結 果 を 評 価 す るパ ラメ ー タ ー と な りう. の分画に分かれ. の. ち に 彼 らは こ れ らの 分 画 をHDL2b,HDL2a, し て い る23)。 ま た,こ. Stokes径. な ど に よ り 測 定 し 報 告 さ れ て い るHDL2,. れ ぞれ の泳. ‑1 .112g/ml,III:d=1.130‑1.450g/ml)。. HDL3と. analysis. 大 き く3つ. の3つ. を 分 析 用 超 遠 心 法,電. びGGEの. の分画の. 子顕 微 鏡およ. 結 果 よ り そ れ ぞ れ 算 出 す る と,3. 者 間 で の 値 は 極 め て 類 似 し て い た と報 告 し て. る と考 え ら れ る。 こ の よ う にGGEがHDL. い る 。 さ ら に そ の 後,Nicholsら24)は. 分 画 を そ の 分 子 量 の 面 か ら特 徴 づ け る の に 有 用. 間 を 延 長 す る こ と に よ り,HDLに. 性 が 高 い と考 え られ た 。 本 法 を リポ 蛋 白 に 応 用. 分画. HDL2a,HDL3に. 泳 動 時 はHDL2b,. 加 え,HDL4,HDL5と. 呼. し た も の と し て,Prattら20),Johnら21),Bauto‑. ぶ べ き分 画 が 存 在 す る と 報 告 し た25)。 著 者 は. richら22)な. ど の 成 績 が あ る 。pratt,ら20)は2. Andersonら. 濃 度 勾 配 を も っ たgradient. に て 分 析 し た が,HDLを. %〜6.5%の gelを. 作 成 し,ヒ. molecular. teins:ほ ぼHDLに か っ 各 々 の3分. あ らか じ め 分 離 用 超 遠 心 法 に てHDL2(1.063. molecular. lipoproteins:ほ. SMDL(small. ぼLDLに. 相 当),. <d<1.125g/ml),HDL3(1.125<d<1.210g/. diameter. lipopro‑. ml)に. 相 当)の3分 画 は2〜3の. の方 法 に準 gelを. じ3.5%〜8%のgradient. rod. 用いて健. 常 人 お よ びFredrickson. II型 高 リ ポ 蛋 白 血 症 本 み ら れ るLDLバ. 分 離 し て お き,そ. れ ぞ れ を 泳 動 す る と両. 者 は 異 な った 移 動 度 を 呈 し,HDL3が. 画 に 分 か れ,. 細 か い バ ン ドよ り. 成 っ て い た 。Johnら21)はPrattら. 患 者 の 血 漿 を 泳 動 し,数. 上 記 の ご と く 明 らか. な 分 画 に 分 け る こ とは で き な か っ た 。 し か し,. ト血 漿 を 泳 動 し た 結 果,リ. ポ 蛋 白 はVLDL,LMDL(large diameter. rod. の 方 法 に 準 じ,HDLをGGE. ン. よ り小 さ. い リポ 蛋 白 粒 子 で あ る こ とが 確 認 され た 。 著 者 の結 果 で は上 下 へ 延 び る 淡 い 染 色 帯 が 観 察 さ れ,そ. の 泳 動 像 よ りHDLを. 多数 の分 画 に細 分. 画 化 す る こ と は 困 難 と考 え ら れ た 。 しか し,各 種 実 験 下 に お い て 得 られ るHDLと. 思 われ る リ.
(6) 臨 床 化学 ・第11巻 ・第4号(1982). ポ蛋 白 やHDL亜. 分画 を その 粒 子 の 大 きさか ら. 特 徴 づ け る こ とに対 してGGEは. 有 用 と考 え ら. れた。. Apo. A‑I,Apo. A‑IIの. の他 の 方法. Bonら. は,HDL2,. さ ら に6分. み を 含 有 し て い た 。Peak―VIIはC‑II み を 含 み,Apo. A‑I. HDLと. 比 は,ピ. 画,HDL3は10分. 画. うち. C‑IIIの. Lp(a)とLpB HDL3のisotachophoresis. peptideの. C‑IIの. て い た 。 最 後 の ピ ー ク はApo. b)そ. に よ りHDL2は. 他 にC. ,A‑IIは B含. ,. 欠除 し. 有 リポ蛋 白. 考 え ら れ た 。 脂 質/蛋 白. ー ク Ｉか らVIIIにか け て 増 加 し,TG含. 量 も順 次 増 加 し た 。. に 分 け られ る こ と を 報 告 し た26)。 ア ポ 蛋 白 の 分布 は こ れ らの 分 画 ご とに非 常 に 異 な って い た 。 ま た,HDLの HDL2,HDL3と. 等 電 点 電 気 泳 動 も試 み ら れ も に5〜10個. の亜 分画 に分 け. ら れ て い る27)。. c). Ion exchange. 従 来,ア. column chromatography. ポ 蛋 白 の 分 離 に はDEAE. cellulose. が 最 も使 用 さ れ て き た 。RubensteinはDEAE cellulose. DE. 52とDEAE. Biogel. A. agarose. を 用 い てHDL(1.063‑1.210g/ml)の 3・. カ ラ ム ク ロ マ トグ ラ フ ィ ー. 行 な い,3つ. カ ラ ム ク ロ マ トグ ラ フ ィ ー に よ るHDLの 分 画 法 に は,高 DEAEア. 細. 速 液 体 ク ロ マ トグ ラ フ ィ ー,. ガ ロ ー ス カ ラ ム ク ロ マ トグ ラ フ ィ ー. ,. 速 液 体 ク ロ マ トグ ラ フ ィ ー(HPLC). HPLCに. もに こ れ らの3つ. 画 す べ て を 含 ん で い た 。 一 方,Kostnerら DEAE. celluloseよ. し,こ a)高. の 亜 分 画 を 得 た と報 告 し て い. る29)。HDL2,HDL3と. て もHDL2,HDL3の. の分 は,. り もDEAE‑Sephacelが. よ り分 離 能 が 良 く,6つ. 等 が 報 告 され てい る。. 分画を. の 方 法 で は,検. の 分 画 を 得 た30)。 し か 体 の 稀 釈 の 割 合 が大 きい. た め 十 分 な 検 索 に は 不 適 当 と して い る 。. 分画が可能な 4)ア. フ ィ ニ テ ィ ー ク ロ マ トグ ラ フ ィ ー. ご よ が 原 ら に よ り報 告 され て い る 。 この 詳 細 に つ い て は,前. 号 に て 原 ら に よ り報 告 され て い る. a)ヘ. パ リ ン ア フ ィニ テ ィ ー ク ロ マ トグ ラ フ イー. の で こ こ で は 省 略 す る。. b) Hydroxyapatite. column chromatography. Apo. EはApo. Bレ. セ プ タ ー に 結 合 で き,. 細 胞 内 コ レ ス テ ロ ー ル 代 謝 にApo Hydroxyapatite(HA)に 画 の 可 能 性 は,1972年. よ るHDLの. に 報 告 され て い る が,そ. の 詳 細 に つ い て は,1977年. にKostnerら. り報 告 さ れ た28)。HAはCa++依 ン依 存 性 の2つ. 細分. る 。Apo. によ. 存性および リ. の 結 合 部 位 を 持 つ と考 え られ て. お り,塩 基 性 な ら び に 酸 性 の 両 蛋 白 がHAと 応 す る 。 し か し,HAに. よ るHDLの. 蛋 白(LDL)と. 反. 分 画機 序. て,ヘ. E含. B含. 有 リポ. と もに 重 要 な 役 割 を 果 して い 有 リポ 蛋 白 を 分 画 す る方 法 と し. パ リン との 結 合 特 性 を 利 用 した ヘパ リ ン. ア フ ィニ テ ィ ー ク ロ マ トグ ラ フ ィ ー が 注 目 され て い る。 リ ポ 蛋 白 の 分 画 法 に は 超 遠 心 法,電 法,沈. 気泳動. 澱 法 等 が 広 く用 い ら れ て い る 。 し か し こ. の 詳 細 は 不 明 で あ る 。 分 画 に はHAをCaCl2と. れ らの 方 法 に て 分 画 さ れ た リ ポ 蛋 白 は 細 胞 と. リ ン酸 ナ ト リ ウ ム に て 処 理 し て 用 い る 必 要 が あ. の 相 関 の 関 係 か ら み る と 必 ず し も均 一 で は な. る 。2.5×30cmの hate し,8分. buffer,pH. カ ラ ム に てpotassium 6.8に. phosp‑. よ り段 階 的 に 流 出. 画 に 分 画 した。主 な ピ ー クで あ る. PeakIIは,Apo. A‑1とA‑IIの. み か らな り. 他 の ア ポ 蛋 白 は 認 め られ な か っ た 。PeakIIIは. 258. い。 著 者 は リポ蛋 白が 動 脈 壁 に 沈 着 す る と き や,各. 種 の 体 細 胞 と 結 合 す る際 にglycosami‑. noglycan等. を 含 む 糖 蛋 白 と の 結 合 が,重. 要 な. 役 割 を 果 し て い る と考 え ら れ て い る こ と に 着 目 し,リ. ポ蛋 白 を ヘ パ リン との結 合 親 和 性 の 差 異.
(7) 〈特集〉血漿 リポ蛋 白の細分画 とその臨床 的意義 に よ り分 画 す る こ と を 試 み た31)。 LDL. Iveriusの. 方 法 に 従 っ て,ヘ. し たSepharose 径2.5cm,高. 4 Bに. of. Control. Rat. パ リ ンを活 性 化. カ ッ プ リ ン グ さ せ た 後,. さ10.0cmの. カ ラ ム に充 てん し. た 。 ラ ッ ト血 漿 超 低 比 重 リポ 蛋 白(VLDL:d <1.006g/ml),低. 比 重 リ ポ 蛋 白(LDL:1.006. <d<1.063g/ml),高. 比 重 リ ポ 蛋 白(HDL:. 1.063<d<1.210g/ml)を 0.05M. NaC1を. buffer,pH7.4に い て4℃ dium. 超 遠 心 法 に て分 離 後. 含 む2mM. sodiumphosphate. 十 分 透 析 し,上. 記 カ ラム を用. に て 分 析 し た 。 流 出 液 は2mM. phosphate. NaClの. so‑. buffer,pH7.4,0.05―1.0M 4―(a). 直 線 的 勾 配 を 用 い た 。 流 速 約50ml/時. 間 に て,3.0mlづ. つ 分 取 し,流. 出 パ タ ー ンは HDL. 280nmに. of Control. Rat. お け る吸 光 度 にて示 した 。. ま ず ヘ パ リ ン と結 合 す る リポ 蛋 白 の 代 表 と し て,LDLに. つい て 検 討 し た 。 正 常 ラ ッ ト(ウ. ス タ ー 系 雄 性 ラ ッ ト,体 重250―300g)よ 朝 空 腹 時 採 血 し て 得 ら れ たLDL,蛋 mgの. 白 量3.0. ヘ パ リ ン ・セ フ ァ ロ ー ス,ア. ー ク ロ マ トグ ラ フ ィ ー(ヘ な っ た 。Fig.4aに 0.25M. NaClに. フ ィニテ ィ. パ リ ン カ ラ ム)を. 示 す ご と く,tube 頂 点 を 有 す る1つ. No. volume(tube. 行. 35,. の ピ ー クが. 認 め ら れ た 。 即 ち ほ と ん ど のLDLは と結 合 し,void. ィ. り早. ヘ パ リン. No. 12)に. 認め. 4―(b). ら れ る非 結 合 リポ 蛋 白 は 認 め ら れ な か っ た 。 Fig.4bは. 正 常 ラ ッ トよ り早 朝 空 腹 時 採 血 し て. 得 ら れ たHDLの と し て6.0mgを No. 流 出 像 を 示 す 。HDL蛋 分 析 し た 。void. VLDL. of Control. Rat. 白量. volume(tube. 12)に 頂 点 を 有 す る ピ ー ク が 認 め ら れ た が,. LDLに. 認 め ら れ たtube. No. 35,0.25M. NaCl. の 位 置 に は 明 らか な ピ ー ク は 認 め ら れ な か っ た 。 即 ち ほ と ん ど のHDLは. ヘ パ リ ン とは結 合. せ ず 流 出 さ れ る と 考 え ら れ た 。 正 常 ラ ッ トよ り 早 朝 空 腹 時 採 血 し て 得 られ たVLDLの ン カ ラ ム 流 出 像 はFig.4cの VLDLト. リ グ リセ リ ド(TG)量. へパ リ. ご と く で あ った 。 と し て13.0mg 4―(c). を 分 析 した 。 第1の void. ピ ー ク は,HDLで. volumeに. 認 め られ,ヘ. 認 め られ た 様 に パ リ ン と結 合 し な. Fig. 4 Heparin-Sepharose 4B affinity chromatography of rat LDL (a), HDL (b) and VLDL (C)81.. 259.
(8) 臨 床 化 学 ・第11巻 ・第4号(1982). HDL2(d=1.063‑1.125). Fig. 5 Elution profile of human plasma HDL2 (1.063<d<1.125g/ml)by heparin-Sepharose affinity chromatography19.. い リ ポ 蛋 白 で あ り,第2の られ た 様 に0.25M. ピ ー ク はLDLで. NaClに. 認 め. て流 出 され る へパ. リ ン と結 合 す る リポ 蛋 白 で あ る。な お0.6M Cl以. Na. 上 にお い て は リポ 蛋 白 の 流 出 は 認 め られ. な か っ た 。 さ ら にheparin‑Sepharose chromatographyを. affinity. 用 い てHDL2を. へパ リンと. の 親 和 性 の 相 違 に よ り分 画 し,各. 分 画 をGGE. 結 果 はFig.5に. と くで,Weisgraberら. 有 さず0.05M 画1),へ. NaClに. NaClに. そ れ ぞ れHDL2 E,Apo. り,各. 画2),お. よ び0.29M 画3)に. Apo. 分かれ. with. Apo. み か け 上 の 分 子 量 はHDL2(1.0〜4.6)×105, 分 画1(1.0〜3.3)×105,分. Apo. E,HDL2. with あ. の 分 画1,分. 画2 なわ ち. Eと 思 わ れ る分 画 はHDL2の. 画2(1.8〜4.6)×. あ っ た 。Weisgraberら. Eに. with. のGGEの. Apo. EがHDL2. 結果 without. 比 し 分 子 量 が 大 きか っ た 。. Iveriusは,ヒ. ト リポ 蛋 白 とglycosaminogli‑. canagarose(Sepharose. 4 B)と. も にVLDLもheparin, sulfate,. の結合につい. dermatan chondroitin. 合 し た 。 一 方HDLお VLDL,LDLと. lipoproteinsで. て 分 析 す る と 分 画2,す. う ち 分 子 量 の 大 きい 部 分 を 構 成 し. て い る こ と が 判 明 した 。 こ の 結 果 よ り計 算 した. heparan. に よ れ ば 、 分 画1,2,3は. B containing. た が っ て 分 画2. て 報 告 し た32)。 そ の 成 績 に よ れ ば,LDLと. NaCl. 分 画 の ア ポ 蛋 白 の 分 析 で もほ ぼ 同 様 の 結. をGGEに. 260. て 溶 出 され る 分 画(分. without. 果 を 得 て い る 。 そ こ で,こ. HDL2. パ リ ン と親 和 性 を. て 溶 出 さ れ る 分 画(分. た 。Weisgraberら. Apo. 示 した ご. パ リ ン と親 和 性 を 有 し0.095M. に て 溶 出 さ れ る分 画(分. はHDL2の. に お い て もHDL2. の 結 果18)と ほ ぼ 同 様 で. あ っ た 。 即 ち,HDL2は,へ. が 現 わ れ た 形 を 呈 し て お り,し. 105で. に て 分 析 し た 。heparin‑Sepharoseaffinity chromatographyの. 泳 動 像 の うち泳動 距 離 の小 さい上 方 の 部 分 だ け. と. sulfate,. 4‑sulfateと. 結. よ び アセ チ ル 化 した. は 結 合 し な か っ た 。 そ し て,. こ の 結 合 は 塩 濃 度,イ. オ ン 強 度 に よ り著 明 に 影. 響 さ れ る こ と よ り,Apo. Bの. 陽性 荷 電 した ア. ミ ノ 基 とglycosaminOglyCanの. 陰 性荷 電 グル. ー プ との 結 合 が 重 要 で あ る と 推 測 した 。 しか しhyaluronic. acidと. はVLDL,LDL,HDL. の い ず れ も全 く結 合 し な か っ た 。.
(9) 〈特集〉血漿 リポ蛋 白の細分画 とその臨床的意義 Iveriusは,glycosaminoglycanの. 中 で の. Apo. リ ポ 蛋 白 へ の 結 合 親 和 性 の 強 さ はheparin> dermatan itin た 。. sulfate>heparan. sulfate〓chondro‑. sulfate>hyaluronic. acidで. dermatan. し て,hyaluronic. sulfate,. itin 6‑sulfate,. heparan. acid,. sulfate,. chondroitin. 合 体)を. Bを. chondro. Eは90%がHDL2分. 類 似)に. 芽 細 胞 のLDL. receptorにLDLと. 結 合 す る 。(3)肝. 細 胞 はHDL. sulfate. thin. cholesterol. の 存 在 につ い て の 確 証 は な い 。 また 加 齢 と と も. て は,HDL. に 動 脈 壁 のheparan. reaction. sulfate さ ら に リポ 蛋. with. Apo. 競合的 に with. Apo. Eの without. acyltransferase)の. without. Apo. Eよ. 基質 と し. りそ のinitial. もに 小 さ い こ と な どが. 解 明 さ れ て い る 。 近 年HDLの. 抗 動 脈硬 化作. 白 の 動 脈 壁 へ の 蓄 積 に は リ ポ 蛋 白 がdermatan. 用 に つ い て 数 多 く の 報 告 が み られ る が,こ. sulfate等. と結 合 す る こ とが 重 要 と考 え られ て. Apo. い る。 ヘパ. リ ン は さ き に 述 べ た 様 に リポ 蛋 白 と. て い る と考 え ら れ,ヘ. の 結 合 に 対 し てdermatan 度 を 示 し,ま. sulfateと. た リポ 蛋 白 と最. を 有 す る こ と よ り,ヘ. 同様 の 態. も強 い 結 合 親 和 性. 含 有HDLの. の 結 合 様 式 をin. vitroで. 検 索 す る良 い. の 成 績 は 主 と してHDLに. 注 目 し,報. い る 。Hayら33)は,HDLは. 告 され て. ヘ パ リン との結. 結 合 分 画 と結 合 分 画 と に 分 け ら. れ る こ と を 初 め て 報 告 し た 。 そ して ア ポ 蛋 白 組 成 で は 両 分 画 と も にApo. A‑Iに. A‑I,Apo. 合 分 画 でApo. Eが. Eを 含 ん 相 対 的 にApo. Eが. も同 様 の 成 績 を 報 告 し,非. の90%,結 は10%を Apo. 量 のApo 合 分 画(主. 重 要 な役 割 を果. 結 合 分 画(主 Eを. 含 む)は. と し てApo. と して. 含 む). Bの 関 与 に つ い て は 触 れ られ て い な い 。 ヒ つ い て も,Weisgraberら18)は. パ リ ン カ ラ ム に て 分 画 し,非. 合 す る 性 質 を 利 用 して,Apo (LpB)をConAア. ヘ. 結 合 分 画 と結 合 分. (Pharmacia. Fine. リポ 蛋 白 を ア プ ラ イ し,0.02M 1.0M. NaCl,. 1mM. MgCl2,. 出 さ れ ず,そ. る 。Con. Aカ. Chemicals)に Tris(pH7.2),. 1mM. CaCl2 Aカ. buffer. ラ ムに 吸 着. の他 の リポ蛋 白 は流 出 され. ラ ム に 吸 着 し たLpBは,0.2M 含 む 上 記bufferに. Bの. 免 疫学. 的 定 量 等 の た め に 用 い る た め に,LDL2(1.030 <d<1.050g/ml)分. 画 をCon. プ ラ イ しLpBを. Aカ. ラ ムに ア. 純 化 し た36)。. Mitamuraは,Con‑Aア. フ ィニ テ ィー ク ロ. マ トグ ラ フ ィ ー に よ るHDLc(cholesterol‑. は 動 物(ヒ. た は. 有 リポ 蛋 白. て 流 出 す る こ とが で き る 。 こ の 様 に し てLpB. に2分. E(ま. 結. フ ィ ニ テ ィ ー ク ロ マ トグ. A‑Sepharose. induced. はApo. Aと. ラ フ ィ ー に よ り分 画 す る 方 法 を 報 告 し た 。Con. 画 の 存 在 す る こ とを報 告 した。 結 合 分 画 は さ ら 画 に 細 分 さ れ,1つ. B含. の 純 化 に 用 い ら れ た 。 著 者 もApo. 全HDL. Eを. 蛋 白 がCon. α‑D‑methyl‑glucosideを. 占 め る こ と を 報 告 し た 。 両 報 告 で は,. トHDLに. フ ィニ テ. ィ ー ク ロ マ トグ ラ フ ィー. し,流. し て い る こ と を 示 し た 。 さ ら にQuarfordt34). A‑I,少. ン カ ナ バ リ ン(Con)Aア. に て 流 出 す る と,LpBはCon. 比 し増 加 して い る こ と を 示 し,HDLの. ヘ パ リ ン と の 結 合 にApo. Apo. E. 分 画 に 非 常 に有 力 な手 段 で あ る. McConathyら35)は,糖. ッ ト血 漿 リポ 蛋 白 の ヘ パ リ ン カ ラ ム. で い た が,結. パ リ ン カ ラ ム はApo. とglycosaminogly‑. モ デ ル と 考 え られ る 。. 合 に お い て,非. の. 重 要 な役 割 を果 し. と報告 して い る。 b)コ. 従 来,ラ. 含 有 す るHDLが. パ リン カ ラ ムは動 脈 壁 や. 細 胞 膜 にお け る リポ 蛋 白 canと. 維. 多 く取 り込 む 。(4)LCAT(leci‑. rate,Vmaxと. Eを. は. 分 画 さ. 中 の コ レ ス テ ロ ー ル エ ス テ ル をHDL Eの10倍. sulfate,dermatan. の1つ. 画 に 存 在 す る 。(2)線. Apo. て い る 。 し か し,heparinやkeratan. が 増 加 す る と報 告 され て い る。. 含 む 分 画(Lp(a)に. 知 られ. 4‑sulfateが. 含 む 分 画 で,他. れ た 。 現 在 ま で の と こ ろ,(1)HDL. あ る と 考 え. ヒ ト大 動 脈 の 細 胞 外 組 織 に 存 在 す るgly‑. cosaminoglycanと. E‑A‑II複. HDL)の ト,イ. 分 画 法 を 報 告 し た37)。HDLc ヌ,ブ. タ,サ. ル)を. 高 コ レス 261.
(10) 臨床 化 学 ・第11巻 ・第4号(1982). テ ロ ー ル 食 に て 飼 育 す る と 出 現 す るApo. E. に 富 む リポ 蛋 白 で 超 遠 心 法 に よ る リポ 蛋 白 の 分 画 で はLDL分. 画 に もお よ ぶ(1.030―1.110g/. ml)。HDLcとLDLは. 超 遠 心 法 に よ って は 分. 離 し難 く,Mahleyら. は,Geon‑Pevikonブ. ロ. ッ ク を 支 持 体 と す る電 気 泳 動 法 に よ り分 画 し て い る38)。 し か し,こ. の 方 法 は 必 ず し も容 易 で は. な い とされ て い る。三 田村 の 方 法 を略記 す る。 ま ず 総 リ ポ 蛋 白 分 画(d<1.225g/ml)をBio‑ Gel. A. 15mカ. LDLに peak. ラ ム に て 分 画 す る とpeak. IIに. 属 す る リ ポ 蛋 白 分 画 が 得 られ る。 こ の IIをCon. Aカ. ラ ム に か け る と,非. 結合. 分 画 と 結 合 分 画 が 得 られ た 。 こ れ らの 分 画 の 脂 質,蛋. 白 組 成,粒. 子 サ イズ の 検 討 よ り,非 結 合. 分 画 はMahleyら. の 報 告 し て い るHDLcの. Aア. 5) H. G. Wilcox and M. Heimberg: Biochim. Biochim. Biophys. Acta 152, 424 (1968) 6) J. R. Patsch, S. Sailer, G. Kostner et al: J. Lipid Res. 15, 356 (1974) 7) G. M. Kostner, J. R. patsch, S. Sailer et at: Eur. J. Biochem. 45: 611 (1974) 8) P. Laggner, H. Stabinger and G. M. Kostner: Preparative Biochem. 7, 33 (1977). フ ィニ テ ィ ー ク ロ マ トグ. 10) J. Shepherd, C. J. Packard, J. M. Stewart et at: Clin. Chi m. Acta 101, 57 (1980). ラ フ ィ ー も リポ 蛋 白 の 細 分 画 法 の 一 方 法 と し て 有 用 と考 え ら れ る 。. III.ま. 4) D. W. Anderson, A. V. Nichols, T. M. Forte et al: Biochim. Biophys. Acta 493, 55 (1977). 9) W. Pasch, G. Schonfeld, A. M. Gotto et at: J. Biol. Chem. 255, 3178 (1978). 考 え られ,結. 考 え られ た 。. この 様 にCon. 3) 八 杉 忠 男, 佐 々英 一, 木 下 毅 他: 最 新 医学 27, 424 (1972). 合分. 状 と類 似 し て お り,HDLcと 画 はLDL(LpB)と. 性. 2) F. T. Lindgren, L. C. Jensen and F. F. Hatch: Blood Lipids and Lipoproteins: Quantitation, Composition and Metabolsm, ed. by G. J. Nelson, Wiley-Interscience, New York, p. 181 (1972). と. 11) J. R. Patsch, D. Yeshurum, R. L. Jackson et al: Am. J. Med. 63, 1001 (1977) 12) J. Shepherd, C. J Packard, J. R. Patsch et at: J. Cl in. Invest. 63, 858 (1979). め. 13) C. B. Blum, R. I. Levy, S. Eisenberg et at HDLの. 抗 動 脈 硬 化作 用 の 機 序 につ い て は未. だ 必 ず し も 明 確 に され て い な い 。 今 後,HDL の ど の よ う な 亜 分 画 が 最 も重 要 な 意 義 を 有 す る か に つ い て よ り詳 細 に 検 討 さ れ ね ば な ら な い 。 そ の た め に はHDLの. 細 分 画 法 に つ い て,そ. の. 機 能 を 加 味 し た 分 画 法 が 考 察 さ れ る こ とが 肝 要 と考 え る 。 ま た,現. 在 行 な わ れ て い る細 分 画 法. に つ い て もよ り一 層 臨 床 応 用 し,各. 種 病 態 にお. け る動 態 を さ ら に 明 らか に さ れ る こ とが 期 待 さ. 15) J. R. Foreman, J. B. Karlin, C. Edelstein et al: J. Lipid Res. 18, 759 (1977) 16) M. J. Chapman, S. Goldstein, D. Lagrange et at: J. Lipid Res. 22, 339 (1981) 17) B. H. Chung, T. Wilkinson, J. C. Geer et at: J. Lipid Res. 21, 284 (1980) 18) K. H. Weisgraber and R. W. Mahley: J. Lipid Res. 21, 316 (1980) 19) 笈 田耕 治, 中井 継彦, 玉 井 利 孝 他: 動脈 硬 化 9, 609 (1981). れ る。 謝 辞:竹 田 亮 祐 教授 の御校 閲 を深 謝 致 します 。. 文. 献. 1) R. W. Mahley and K. H. Weisgraber: Reports of the High Density Lipoprotein Methodology Workshop, ed. by K. Lippel, NIH publication No.79-1661, p. 356 (1979) 262. J. Clin. Invest. 60, 795 (1977) 14) T. G. Redgrave, D. C. K. Roberts and C . E. West: Anal. Biochem. 65, 42 (1975). 20) J. J. Pratt and W. G. Dangerfield: Clin. Chim. Acta 23, 189 (1969) 21) S. M. John and C. Waterhouse: J. Lipid Res. 13, 193 (1972) 22) G. J. Bautovich, M. J. Dash, W. J. Hensley al: Clin. Chem. 19, 145 (1973) 23) D. W. Anderoson, A. V. Nichols, S. S. Pan et al: Atherosclerosis 29, 161 (1978).
(11) 〈特集〉血 漿 リポ蛋白の細分画 とその臨床 的意義 24) A. V. Nichols, P. J. Blanche, R. M. Krauss et al: Report of the High Density Lipoprotein Methodology Workshop, ed. by K. Lippel, NIH publication No. 79-1661, p. 303(1979) 25) P. J. Blanche, E. L. Gong, T. M. Forteet et al: Biochim. Biophys. Acta 665, 408 (1981) 26) G. B. Bon, G. Cazzolato. and P. Avogaro:. J. Lipid Res. 22, 998 (1981) 27) A. M. Scanu, C. Edelstein and L. Agge rbeck: Ann. NY Acad. Sci. 209, 311 (1973) 28) G. M. Kostner and A. Holasek: Biophys. Acta 488, 417 (1977). Biochim.. 29) B. Rubenstein: Atherosclerosis 33, 415 (1979) 30) G. M. Kostner and P. Laggner: Report of the High Density Lipoprotein Methodology Workshop, ed. by K. Lippel NIH publication No. 79-1661, p. 343 (1979). 31) T. Nakai, K. Oida, T. Tamai et al: Artery 10, 150 (1982) 32) P. H. Iverius: J. Biol. Chem. 247, 2607 (1972) 33) C. Hay, J. A. Rooke and E. R. Skinner: FEBS Lett. 91, 30 (1978) 34) S. H. Quarfordt, R. S. Jain, : Biochem. Biophys. Res. Commun. 83, 786 (1978). L. Jakoi et al. 35) W. J. McConathy and P. Alaupovic: FEBS Lett. 41, 174 (1974) 36) T. Nakai, T. Tamai, K. Oida et al: Jpn. J. Clin. Chem. 11, 71 (1982) 37). 三 田 村 健:. 38). R. W.. 脂 質 生 化 学 研 究22,. Mahley. and. 61. (1980). K. S. Holcombe:. J. Lipid Res. 18, 314 (1977) 39) 中井 継彦, 笈 田 耕 治, 玉 井 利 孝 他:動 脈 硬 化 9, 597 (1981). 263.
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