関す 研究 断 的意 義 診 ( ) 細胞癌診断

金沢大 学十 全 医学 会雑 誌 第9 2巻 第2 号 2 8 卜 2 95 (1 98 3)

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肝細 胞 癌 診 断^{に お ける L e u c o c}y t^{e a} d h e r e n c e inh ibⁱtio n

(^{L A I}) ^{a s s a}y の診断的意義^に関 す^る研 究

金沢大学 大 学院医学研究 科 内科 学 第^一講 座 ( 指 導^: 服 部 信教 按)

米 島 学

( 昭和^{5 8}年² 月1 5日受付)

腫瘍^の細 胞 性 免 疫反応を利用 し た特 異な癌 診 断 法^である白血球付 着 阻止試験 (1e u c o cy te ad he r e n c e

inhibitio n a s s ay^, 以下L A I a s s ay と略) を肝 細 胞癌にお^いて行^い, 各種 腰 瘍^{マ ー} カ ^ー と の比較お よ び腫

瘍^の大さ さ と の関 係な どの検 討よ り, L A I a s s ay の診 断 的意 義を明ら かにし よ う と し た.

新鮮 剖検 肝 細胞 癌 組 織よ り作 製し た抽 出液を抗原と し･ 同様^に健 常 肝 組 織よ り の抽 出液を対 照抗 原と し て用^いた･

ヘパリ^ン加 末 棉血よ り比 重遠 沈法^にて m o n o n u cle a r c ells を分離し, メディウム にて 1 0⁷個/ ml に調整し, Gr o s s e r ら の方 法に準じ てt_ubeL A Ia s s ay を行った^･ 結 果は No n^‑ad he r e n c einde x(以下N A I と略) を算 出し て表わ し た.

肝 細胞 癌55 例 中3 7例 (6 7% ) が L A I a s s ay 陽 性であった･ 偽 陽 性は肝 硬 変34例 中6例 (18 % ), 他

の悪性 鵬 2 1 例 中1例 (5% ) であ^った が, 他の良 性肝 疾 患で は陽 性例は認め な かっ た. 同時^に測 定し た 他の腰瘍マ ^ー カ ^ー であ る^{α ‑}fet_opr otein (以 下 A F P と略) 値やn o v el _γ^‑G T P is o e n zym e ( 以 下^{n o v e}l _γ

一^{G T P と}略) の有 無と L A I a s s ay との関係を検 討し た が, これ ら 2 つのマ ^ー カ^ー と N A I 値と の間には相 関性は認め ら れ な かっ た^･ A F P ^･n O V el _γ‑G T P と もに陰性^の2 0例 中1 1 例は本 試験 陽性で あ り, これ ら 3 ^{つのマ ー カ ー} を組み合わ せ ることによ り, 肝細 胞 癌の 8 6% ^に診 断が可 能であった^.

さ らに, L A Ia s s ay と腰 瘍^の大さ さ と の関連も検 討し た･ 肝^スキャ ン によ る腫 瘍のステ^ー ジ分 類と N A I 値と の間には相 関 性は な く, ま た, C T スキャ ンよ り計 測し た腫 瘍 体 積や腫瘍 占拠 率と N A I値との間^にも 相 関性は 認 め な かったt 最 大径3 c m 以 下^の細小肝 癌8 例 中5例^にも本 試験 陽 性^を認 吟た^.

以 上 よ り, 肝 細 胞痛の L A I a s s ay は特 異性^･陽 性率と もにか な り高く^, さ らに, 他の腫 瘍^{マ ー} カ^ー や腰 瘍の進行 度に無 関 係^に出 現し, 細 小 肝 癌^{に お}け る陽性 率^も高^{い こ}と よ り, 本 法は肝 細胞 癌の 血液 学 的診 断 法と し て有用性が高^いと考え ら れ る.

Key ^{w o r}ds L A I _{a s s ay}

, α^‑Fetop^{r o}tein(^{A F P}), N o v el _γ^‑G T P is o e nzy ^{m e}

(^{n o v el} γ^‑G T P), 腫 瘍 体 積

肝細胞癌 (Hepato c ellula r c a r cin o m a, 以下H C C と略) は他の癌^に比し て^α‑^fetop^{r o}t_ein (以下A F P と 略) やn o v elγ‑^{G T P is o e n z}ym e (以下n o v el γ^‑G T P

と略) ^{1 ) 2 )}のよ うに癌 特 異 性^およ び感 度^いず れに お いて

も劉_{は 膿}瘍^{マ ー} カ^ー に恵ま れ ている. し か も, これ らマ ^ー カ^ー は, H C C に限れ ば,

一般にその陽 性 率も進 行度と は無関 係で あ る と^いう成績が得ら れ ている²⁾. し かし,A F P やn o v el_γ‑G T P な どのよ う^に腫瘍^{マ ー カ}

ーと して現 在 最も優れ ている もの であって も, 腫 瘍が 塵生す る蛋 白や酵 素を直接 測 定す る方 法では検 出 率^に

限 界が あ り, 特に細 小 肝癌^{で の}有用性は低く^{3 ) 4)}, 新た な 血液 学 的診 断 法^の開発が急務^であ る.

1 9 72 * , Halliday ら⁵⁾によ り報 告さ れ た白血球 付 着 阻止試験 (1e u c o cy te ad he r e n c einhi bitio n a s s ay, 以 下 L A I a s s ay と略) は, 腰 瘍^の膜 特 異 抗原に対す る細 胞 性 免疫 応 答を in vitr o でと ら え る もので あ り, 従 来

の蛋白や酵 素な ど を直 接測 定す る方 法と は異な る特 異 な癌 診 断 法と期 待さ れ て^いる^5ト7). しか し, H C C に お いて も, その診 断 的 意 義は未だ十 分に検 討さ れ て^いな い. 本 稿で は, 1 9 75 年, Gr o s s e r ら⁶⁾によ り開発さ れ た Studie s o n the C linic al S i_gnific an c e of Le u c o cy t^e A d he r e n c e Iⁿhibition (^{L A I}) ^{As s a}y in Hep^ato c ellula r Ca r cin o m a (^{H C C})^{･ M} a n abu Y o n e shim a, D ep^{a r}tm e nt of Inte r n al

Medicin e(^Ⅰ)^,(^{D ir e cto r :} Pr of･ N ･ H at tori)^{,Scho ol of M e}dicin e

, K a n a z a w a U ni_{v e r s}i_{t y}.

ガ ラス試 験 管壁^への ^m o n o n u cle a r c ells の付 着 阻 止を 観 察す るtube L A I a s s ay を H C C ^{に お い}て行^い, 本 試 験と各種腫 瘍^{マ ー} カ^ー と の比 較お よ び腫 瘍の大き さ と の関 連な ど も検討し, 本 試 験の診 断 的 意 義を明ら か

に し よ う と し た.

対 象お よ び方法

1 ^. 対 象

対 象は, 金 沢 大学 第1内 科ま た は関 連施 設^に入院し た H C C 5 5 例, H C C を合併し な^い肝 硬 変 (以下L C と 略) 34 例, 慢 性肝 炎 ( 以 下C H と略)1 6 例, 急性 肝 炎 (以下A H と略)8例,H C C を除く 他の悪 性 腫 瘍2 1例 (9 例は肝 転 移を伴な う) である^. さ ら^に対 照と し て,

健 常 者2 8例で も本 試 験を行っ た. H C C の診断は, 17 例は手術な^いし剖検で確 認さ れ,残り 3 8 例ほ臨床 症 状, 一 般生 化 学検 査^にカロえ て, 肝 動 脈 造影 所 見^によ り診 断 さ れ た^. 他の疾 患^の診 断は, 臨 床 症 汎 生 化 学 的検 査

に加え, 各 種Ⅹ線検 査, 生検, 腹 腔 鏡^によ り な さ れ た.

2) Tu m o r e xtr a cts の抽 出

tu mo r e xtr a cts の抽 出は H al li day ら⁵⁾⁷⁾の方法に準 じ て行^った^. す な わ ち, 手術な^い し は剖 検^によ^って得 ら れ た新 鮮H C C 組織を水 冷したpH 7^･3,0･0 1 M リ^ン 酸綬 衝 液 加食 塩 水 ( 以 下^{P B S と}略) 内で壊 死 部^･結合 織を除去 後, ハサ ミ^にて紙 切し た. これ を テ^{フロ ン}ホ モジ ナ イ ザ ^{一 に}てホ モジ ネ^ー ト後,さ ら に P B S を加え,

4 ⁰C,2 0,0 0 0g,3 0 分 間遠 心し た.上滞を Folin‑Lo w ry

法^にて蛋 白濃 度を測 定し,0.5mlずつ に分 注し, a S S ay に使用 す る ま で は ^‑8 0⁰Cにて保 存し た^. 同様^に, 健 常

刑

m o n o n u cle Q r C ell ^{s u s}_p^{e n sio n O･1r nL} 1 1^xl O^†c ells/ ^ml) tis s u e e xtね^ct O .1 ml

m edi^{u m} O.3 ml

に｣^ノ 這 ^{S et ho riz o ntqlly q nd}

i_nc ubQtC^rin CO 之in c ubQtO r qt 3 ア^Oc fo r 2 hr s.

S et V e rtic qlly ^{q n}d

C O U nt n O n ^‑Qd he r e nt c eLL^s b y Co ulte r Co u nte r

F ig^.1. Pr o c edu r e s fo r tube L A I (^{1e u c o c}y t^e ad he r e n c einh ib itio n) ^{a s s a}y^.

肝 組織か ら もe xtr a cts を抽 出し, 分注 保 存し た.

3) M o n o n u cle a rc ells の分 離

ヘパリ^ン加 末 棺^{血 1 0 ml よ り,Co n r a}y‑^Fic oll による 比 重 遠 沈 法⁸⁾で m o n o n u cle a r c ells を分 離し, m ediu m

T C^‑1 9 9 ^{m に}て 1 ^×1 0⁷個/ ^mlに調 整し た^. 4) Tube L A I a s s ay

Gr o s s e rらの方法^6)に準じ て, tube L A I a s s ay を行

っ た. F i_g^.1 に示 す ご と く, m O n O n u Cle a r c ells浮遊液 1 0 0_jLl, 蛋 白 濃 度1 m g/ml の H C C あるいは健常 肝

e xtr a ctsl O O/⁽l, m ed iu m T C‑^{1 9 9 m 3 0 0}pl を 1 6×2 55

m m の W H E A T O N ^{c u}ltu r e tube に注入 し た. 水平 位^にて 3 7⁰C, 5 % C O2イ^ンキ^{ュベ ー} タ ^ー内で 2 時間培 養後, 試 験 管を垂直に立て, パ スツ ^ー ルピペ ット^にて 管 底^の液を軽く攫 拝 後, 管 底 液 中^の非 付 着 細 胞数 (^{n o n‑a}d he r e ntc ells) を Co ulte r Co u nte r にて カ ウン ト し た^. 測 定 結 果は 以下^に示 す式^によ り, n O n^‑adhe r^‑ e n c einde x (以下N A I と略) を算 出し て表わ し た⁹⁾.

N A I (n o n ^‑ad he r e n c einde x)

n o n‑^{ad he ren c e c ells with n o n}‑^{ad h}e r e n c e c ells with H C C e xtr a ct ^{n o r ma}l liv e r e xtr a ct

n o n^‑ad he r e n c e c ells wi_th n o r mal liv e re xtr a ct

×1 00(%) な お,詳 細は後 述す る が,予 備 実験と し て,数例^のB C C 患 者お よび健 常 者か らの m o n o n u cle a r c ells を用^いて,

各 種 蛋 白 濃度(^{0.2 5, 0.5, 1 , 2 mg}/ ml)のe xtr a cts

で^tube L A I a s s ay を行った結果, e Xtr a CtS の至適蛋 白濃 度は 1 m g/ ^ml^であ^った^. 以後^の測 定は 1 mg/mi の蛋 白 濃 度で行^っ た. m o n o n u cle a r c ells 分 離時^の

m ediu m , L A I a s s ay 時の m ed iu m には fetal c aIf

s e r u m は添加しな かった^.ま た,測 定は す^べてtri_plic ate で行^い, 平均 値を求め て, N A I を算 出し た^.

5) 各 種 腫 瘍^{マ ー} カ^ー の測 定

同 時な^いし ほ ぼ同時 期^に採 血し た血 清を 用^しゝ, A F P 値,n O V el γ一G T P ^の有 無を検 討し た^.A F P は D i^{n a}bot t

社 製の キット を使 用し た Radioim m u n o a s s ay 法^にて測 定し,H C C の特 異 性^の高く な る⁴0 0ng/ml 以 上 を陽性 と し た. n o v el _γ‑^{G T P の}有 無は 既報^{l ) 2)1 0 )の} ごと く,

Polya c ryla mide gr ad ia nt gel ele ctr opho r e sis にて検 索し た^.

6) 腫 瘍^の大き さの測 定

腫 瘍^の大き さの測 定に用^いた肝^スキャ ン およ び C T ^ス

キャ ンは 1^JA I ^{a s s a}y と ほ ぼ同 時期に施 行し た も^のを用

いた.

(1) 肝^スキャ ン によ る進行 度 分 類

H C C の ステ^ー ジ分 類は肝 癌 研 究 会^の試案^{3 ) 1 0 )に}基づ いた. す な わ ち, 肝^スキャ ン の正面像^にお け る d^efe ct の有 乳 程 度^によ り,Tab lel に示 す ごと くstag^e I ^〜IV の 4 段 階^にわ け た.

(2) C T ^スキャ ン によ る腫瘍 体 積

肝 細 胞癌^{に お}け る L A I a s s ay の診 断 的意 義に関す る研 究

Table l. Stage s a nd tu mo r v olu me s of H C C (hep^ato c ellula r c a r cin o m a)

1)^{. Stage s of H C C cla s si 鮎 d b}y p^{o s}t_{e r}io r^‑a nte rio r

v

ie w of liv e r s c a n n l ng

Stage l: n O dete ctable 丘11ing defe ct.

Stage2: Defe ctisbelo w 20% in pr opo rti_{o n} tothe whole hepatogT a m.

Stage3: Defe ctisfr o m 2 0% ^to 7 0% Stage4‥ Defe ctis abo v e7 0%

2)^{. Tu m o r v olu me s o}f H C C c alc ulated b_y m e a s u r e^･ m e ntin C T s c a n n l ng

a n a r e a ofthe s e ctio n C O n Sta nt

V 尋^{(Sl+S2+ ･ … ‥ +S｡)}

1 c m 軌^{こ ス}ラ イ^スし た各 断面^にて,プ ラ^ニメ ^ータ^ー を 用^{い て}, 各 断面にお け る肝 面 積^･腫 瘍 両 横を求め_t Tablelの式^で示 す よ う^に,そ れ ら を積 分す ることによ り, 肝 全体 積 (total liv e r v olu m e), 腫瘍 占拠 体 積 (^tu m o r v olu me), 腫 瘍 占拠 率 (tu m o r r atio) を算 出し た^{1 1 ).}

7) 細 小肝 癌 (S m all H C C)

手術や剖検あ る^いは画 像 診 断^にて診 断し た腫 瘍 径3

C m 以 下の H C C を細 小肝 癌と し て扱^っ た^{1 2).} 画像 診 断

にて診 断し た例は, 腹 部 超 音 波 検 査 (^ultr a s ｡ n ｡^̲ gr aphy), 選択 的 血 管撮 影 (infu sio n hepatic a ngi^0･

g^{r a}ph_y), 血管 撮 影下C T スキャ ン (s equ e ntial C T

Witha rte rial_po rtogr aphy) を行^い, 細小肝 癌と診 断 し た.

な お, 平均 値の差お よ び陽 性率^の差の有 意差 検 定は そ れ ぞ れ, t検 定, Ⅹ²検 定^にて, 相 関係 数(^r)^の有 意 差 はr表^にて行った.

成 績

1) 添加 抗 原の蛋白 濃 度の決 定

至適蛋白 濃 度を検 討す る た め, 以下の予備 実験を行

った.

数例^のH C C 患 者^およ び健常人の m o n o n u cle a r c e11s

を用^い, 0･2 5, 0^･5, 1 , 2 m g/ml の各種蛋白 濃 度の e Xtr a ct_sl O OJ^Ll を添 加してL A I a s s ay を施 行し た. 従

って, 最終蛋白 濃 度は そ れ ぞ れ 5 0, 10 0,2 0 0,4 0 0〃 g/

ml と なった･ ま た,e Xtr a CtS の代わ りに P B S lO O_pl の

添加にて も測 定を行^い, こ の場 合^の最終蛋白 濃 度は O P g/ml で あった･ Fi_g･2 に示 す ご と く, H C C 患 者^の

m O n O n u cle a r c ells およ び健常人の m o n o n u cle a r c ells

とも^に,最 終 蛋白 濃 度2 0 0 〟g/ml ま^では非 付 着 率(^{n o n}

‑ad he r e ntr atio) は直線 的^に増 加し, 以後は ほ ぼ プ ラ ト にな り, 至適 添 加 蛋白 濃 度は 1 m g/ml( 最 終 蛋 白 濃度では 2 0 0_〟g/ml) と判 定さ れ た. こ の至適 濃 度で

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Pr Otejn c o n c e ntratio n of mjxturetube (J^Jy^mn

Fig^･2^･ Op tim al pr otein c o n c e ntr atio n s of tis s u e e xtr a ct_sin L A I a s s ay^.

n α^■tad he rentceus

5 1 0 15 刀

total m o n o n u cLe a r c eL【s

F i_g.3. Co r r elatio n betw e e n total m o n o n u cle a r C ells a nd n o n ad he r e nt c ellsin L A I a s s ay u s l ng C ells de riv ed fr o m o n e c a s e of H C C patie nts a nd

n o r m al liv e r e xtr a cts.

L A I a s s ay を行^った^.

2) 浮遊 m o n o n u cle a r c ells数^の決 定

浮 遊^m o n o n u cle a r c ells濃 度を そ れ ぞ れ 2^.5^×1 0⁶,

5 × 10⁶, 1 ×1 0⁷,1^･5^×1 0⁷†2 ×10⁷個/ml と して,H C C 患 者^およ び健 常 者で L A I a s s ay を行った(tube 内^の最 終 m o n o n u cle a r c ell 濃度は 0^･5, 1 , 2 , 3 , 4 ×1 0⁶ 個/ml と な る･)･ Fig^･3 にその1例を 示 す が, a S S ay 後

の非付 着 m o n o n u cle a r c ell 濃度は そ れ ぞ れ 2.0, 4.0,

11^･3, 17^･0^×1 0⁵個/^mI と な り, 非 付 着 率は そ れ ぞ れ 40^･0,4 0･0,42･0,4 3^･3,4 2^･5 % と ほ ぼ^一 定であ^った^. L A I a s s ay 陽 性 を 示 す H C C 患 者^の m o n ｡ n u Cle a r C ells と H C C e xtr a cts を用^いた a s s ay の場合のみ, 非 付 着 率^{は 6 0〜8 0}% と高 値_{を示 し た が}, や は り各m ｡ n ｡^̲