原発性 非 小畑胞肺癌 け 骨髄 微 中 小癌細 胞 臨床 義 的意

原発 性

非

骨髄

微

胞

臨床

義

一 転 移と認 知 す^{る 上で の}妥 当 性^と播種 経路に関 する 1 考^{察 ‑}

金 沢 大 学医 学 部 医 学 科 外 科学 第^一講 座 ( 主 任^: 渡 遵 洋 字 数 授)

野 崎 喜 ^成

骨 髄 中 微 小 痛 細 胞^の存 在 意 義^を明ら か にすることを 目 的とし^て, 非小 細胞 肺 癌 患 者^{2 0 3}症 例^の骨 髄 液 を対 象に 上皮 細 胞 に特異 的なマ ^ー カ ^ー である サ イ け ラ テ^ン(^cy toke r atin, C K) ^に対 する免 疫 組 織 染 色 を 行^い骨 髄 中 微 小 癌 細 胞^の検 出 を 試^{み る} と とも^に, 骨 髄 中^{に お}ける微 小 癌 細 胞^の播 種 経 路と し て^の腫 瘍 血 管^の関 与 を探^{る た め}, 原 発 巣に おける腫 瘍 内 微 小 血 管 密 度 (mic r o v e s s el de n sity,M V D) ^{な ら び に}血管 内皮 細 胞 増 殖 国 子 匝a s cul ar e ndotheli al gr owi h fa cto r,V E G F) 発 現^との相 関性 を検討 し た. さ ら に転 移 関 連マ ^ー カ ^ー と し てn m2 3^‑H l ^の原 発 巣^{に お}け^る発 現 性 を 免疫 組 織 学 的^に評 価し, 骨 髄 中微 小 癌 細 胞^の播 種 との相 関を探^った. 全体^{と し て}骨髄 中 微 小癌 細 胞^の検 出率は 4 2^･4 % であり, 組 織 型 別^{に み た}検 出率^に差は認めなかっ た が, 病 臥 ^丁因子お よびN 因子^の進行と ともに検 出 率^は有 意^{に 上}昇し(^{そ れ ぞ れ}p < 0^･0 0 1, P< 0^･0 0 5, p< 0^･0 0 0 5), 治 癒 切 除^の施 行 さ れ た症 例^{に おいて}, 全 体^{お よ び Ⅰ}期, Ⅲ A 期にお^いて骨 髄 中 微 小 播 種 例^は非 播 種 例^に比し有意^に予 後 不 良 (^{そ れ ぞ れ}p<

0^.00 0 1, p⁼0^.0 0 0 3, p⁼0^.0 1 3 3) ^であ り, 且^つ播 種 陽性 例^{に は}遠 隔 再 発が多く 認め ら れ た^･ さ ら に骨 髄 中微 小 播 種例^{の m は}非 播 種例^に比し有 意に高 値を示し(_{p < 0}^.0 0 0 1), V E G F 発 現 率 も 播 種 例^で有 意^に高 く (p< 0･0 0 0 1) , 骨 髄 播 種^の成 立に おける

Ⅷ G F を 介^{し た}腫 瘍 血 管新^生の関与^が示 唆^{さ れ た.} 原 発 巣に おけるn m23^‑H l蛋 白 発 現 陽性率^{は 4 4･2 % であり, 組}織^型, 病 期,

T 因子, N 因子, M 国 子^{の い}ずれ に お^いても 有 意差^は認め ら れ な かっ た が, n m2 3^‑H l 蛋 白発 現 減 弱 例が骨 髄 中 微 小 播 種 を 有 す る頻度は有 意^に高^{かっ た} b ^{=0.0 0 2 3})^{. N m2 3‑H l} 蛋 白 発 現^の予 後 因 子と し ての意 義は確 認^でき^{な か った が}, 減 弱例^は遠 隔 転 移 に よ る再 発が多^い傾 向が認め ら れ た^. 以 上^の結果^{か ら}骨 髄 中微 小 癌 細 胞 播 種^は, 遠 隔 転 移 再 発^の前 段 階と し て術 後 再 発^{の 一}指 標と な る 可能性^が示^{さ れ た. その}成立 に は, 原 発 巣に おける V E G Fを 介し た腫 瘍 新 生血管^{お よ びn m2 3‑H l}蛋 白 発 現^の減 弱 性

の関 与が示さ れ た^.

Ⅸey ^{w o r}ds n o n^‑S m all c ell lu ng c a n c e r

,b o n e m a r r o w mic r od is s e min atio n, mic r o v e s s el de n si_{t y,}

v a s c ular e ndoth elial g^{r o w}也 fa cto r_,n m23^‑H l

肺 痛^は近 年 増 加 傾 向^にあり, 本 邦に おける部位 別悪 性 新生物 死亡率^{に おいて}, 男 性^{で は 死}因^の第^一 位, 女性^{で は}胃 痛^に次 ぎ 第^二位 を 占め る に至っている¹⁾. 非^′J^､細 胞 肺 疇^の根 治 的 治 療 手 段は外科 的切 除が中 心^であ^{る が}, いわ ゆ る病 理 学 的 病 期^工期^の 治 癒 切 除 例に お^いても5年 生存 率は 7 0 % 前 後^{2 )3)}と, 胃 痛 など の他^の固形 痛^に比^し, 再 発 性^の高^{さ が}指 摘^{さ れて いる.} 再 発 形 式^の約2/3 は, 脳, 骨, 肺 な ど^への血 行 性 転 移様 式 を^{と ること} か ら^3】4), 手 術 時 す^{で に}存 在 す^る骨 髄, 末 梢^血液 中^{へ の}癌 細 胞

の播種^の可 能性^が指 摘されて^いる^. 近 年, 免 疫 組 織 学 的 あ^るい は分 子 生 物 学 的 手法^{を 用いて}, 従 来^の病 理 組織 学 的 方 法か ら は 検 出 不可能 な微 小な播種痛 細 胞^の検 出が 可能^{と な}り, そ^の存 在 が肺 癌, 乳 癌, 大腸 癌, 前 立 腺 癌 などの痛で多数 報 告さ れ て^い る^{5 ).} 非 小 畑 胞 肺 癌^に関し て は^これまで, Pa ntel ら⁶⁾, Cote ら⁷⁾,

O bga mi ら⁸⁾の報 告がある が, いず れ^の報告に おい ても 骨 髄 中 癌細 胞 陽 性 例^の予後^は不 良^であり, 骨 髄 中痛 細 胞^の存在が肺 癌

の再 発 予 知な^い し再 発 危 険 因 子^{と し て}重 要 な生物 学 的予 後 因子 と な る可 能 性が支 持さ れ て^いる^.

腫 瘍血管 新^{生 は}, 腫 瘍^の増 殖, 進 展 を 規 定 する重 要 な 因 子で ある^{9)1 0).} また腫 瘍 組 織 内^の血管密 度^と遠 隔 転 移, 術 後 再 発^と

の相 関^が報 告^{さ れ11卜1 4)}, 腫 瘍 内新生 血管^の転 移 経 路と し て^の 重 要性が注 目さ れ て^いる. 癌 転 移^の成^{立 に は}, 原 発 巣で^の増 殖 と離 脱, 組 織^{へ の}浸 潤, 脈 管^{へ の}侵入, 運搬, 標 的 臓 器^の血管 での捕 捉と浸 出, 標 的臓 器^での浸 潤, 増 殖^と多段 階 的 過 程 を 経 る必 要がある. 腫 瘍 組 織での血管 新生を促 進 す^る因 子^のう^ち,

血 管 内 皮 細 胞 増 殖 因 子 (^{v a s c ula r e ndothelial} g^{r o w}th fa cto r,

V E G F) ^は現 在 最 も 強 力 な血管 内 皮 増 殖 作 用 を 有 す^{る と さ れ,} 非 小 細 胞 肺 癌^{に おいて}も, V E G F は 血管 新 生 を 介し て痛^の進展 に関 与 すること が示 され^{15 )16 )}, V E G F 発 現^が予 後 不 良 因子^{と し} て再発 性^と関与 す^{ること が}報告さ れ て^いる^1乃.

近 年の分 子生物 学 的解 析 手 法^の発 達^に伴^い, 転 移 能 を 有^{さ な}

平 成¹¹ 年^{1 1}月^{2 5}日受付, 平 成¹¹ 年^{1 2}月1 5 日受理

A b br eviatio n s : A W ,al kalin ep h^{o s}p h^{ata s e ant}i^‑al k al in e pho sphata s e;B M M ,b o n e m a r r o w mi^{c r o}dis s e min atio n; C E A, C a r Cin o^‑e mbry^{o n}ic a nti g^{e n;}CI, C O n丘de n c einte rv al;C K, Cy t^Oke r ati n; E M A, epi th elial m e m br an e an tig^{e n};M V D ･

mic r o v e s s el de n si_{t y;}R T^IP C R_,r e V e r S etr a n S Cri_{p t}io n^‑P C R_;V E G F, V a S C ular e ndoth eli al g^{r o w} th fa cto r

肺癌^{に お}ける骨 髄 中 微小 癌細 胞^の臨床 的意 義

い癌 細 胞 株^に発 現し て^いる遺 伝 子と, 同じ親 株^に由来し転 移 能 を獲 得^{し た}子 株に発 現し て^いる遺 伝 子と^の間で発 現 量^の異な る 遺伝 子 群^が存 在 する こ と が明ら か とな^ってきた^. 現 在 まで_, 発 現^{レ ベ ルと}転 移 能と に相 関 を有 す^る新 規 遺伝 子^は多数 報 告さ れ て おり, 転 移 能 を規 定 する遺 伝 子, いわ ゆ る転 移 関連 遺 伝 子と し て注 目^{さ れ ている18 ), N m2 3 はマウス メラノ ー マ}細 胞 株^より デ^{ィ フ}ァ レンシャ ル スク リ ^{ー ニ ン}グ法に より 単離^{さ れ た}遺 伝 子 で¹⁹⁾, 低 転 移 性 株^に比^べ高 転 移 株^{に おいて}発 現減^{弱 を 示し20 )},

さ ら に高 転 移株^{への遺伝 子 導入 に より 転 移 能が抑 制さ れ る2 1)こ}

と か ら転 移抑^{制 遺 伝 子と し て注 目 を 集め ている. N m2 3 に は}

n m2 3^‑H l と^{n m}2 3^‑H 2 ^の2 ^つの アイ^{ソ フ ォー} ム が存 在 する こ と が 知ら れ て^いる^. 乳 癌に お^いて はn m2 3^‑H 2 より もn m2 3^‑H l の方 が転 移 能^との関 連が強^いと さ れ て おり, n m2 3^‑H lを 導^{入 し たヒ} ト乳癌 高転 移 細 胞 株は転 移 能が抑^{制さ れ るこ}と^が報 告さ れ た^{2 2).} これまで にn m2 3発 現^と痛 転 移 能^との間^に負^の相 関 関係^が認め ら れ たものに悪 性黒 色 腫^幻), 乳 癌^24)､2均, 大 腸癌^{2咽 )}, 肝 細 胞痛^{2 9)} な ど が挙 げ^{ら れ る が}, 肺 癌に関し て は^いま だ統 ^一 し た見 解は得 ら れ て^いな^い.

本 研 究で は, 原 発 性 非 小 細 胞 肺 癌 患 者を対 象に サ イトケ ラ チ ン(^cy^toke r atin,C K)^{1 8 をマ ー カ ー と し た}免 疫 組 織 染 色^{に よ}り骨 髄 中 微 小 癌 細 胞^の検 出 を 試み, 再 発お よ び予 後との相 関 性^を検 討 す^{る と と}もに, 原発 巣^{に お}ける微 小^血管 密 度な ら び に V E G F 発 現との関 連 性 を探った^. さら に原 発 巣に おけるn m2 3^‑H l蛋 白

の発 現 を 免 疫 組 織 学 的^に評 価し, 非 小 細 胞 肺 癌に おける そ^の発 現 意 義^と骨 髄 中 微 小播 種と^の関連 性に^つき 検 討し た^.

対 象お よび 方 法

Ⅰ^. 対 象

1 9 9 6年^{1 0}月か ら 1 9 9 9年³月^{ま で に}金 沢 大 学 医 学 部 第 ^一外 科 学 講 座お よ び石 川県立中央 病 院 呼 吸 器 外 科^{に て}原 発 性 非 小 網 胞 肺 癌^と診 断^{さ れ た}患 者^{2 0 3}例, お よ び肺 癌 を 疑わ れ肺生検が行 わ れ た非 担 痛 患 者5 6例^の骨 髄 液 を 対 象と し た. こ のう ち 治 癒 切 除が施 行さ れ た 1 5 7例に対し, 骨 髄 中微 小 癌 細 胞^の播 種と再 発お よ び予 後と^の相 関 を 検 討し た^. さ ら に 1 6 3検 体 原 発 巣 切 除 標 本^のホ^ルマリ^ン固 定^パラフ ィ ン包埋 ブ^ロ ック( 金 沢 大 学 医 学 部 痛理部 保 存) ^{につい て}微 小^血管 密 度, V E G F 発 現, n m2 3^‑H l 蛋 白 発 現を検 討し た^. 組織 分類, 痛 期 分類, 手 術 根 治度は肺 癌 取扱^い規 約 第⁴版^{3 0)}に従^{った. 2 0 3}例^の内 訳は男性1 3 9例, 女 性 64例であり, 年齢は 2 5歳か ら 8 9歳 ( 平 均^{6 5}歳) ^であ^{っ た.} 病理 学 的 病 期 分 類の内訳は, Ⅰ期11 0イ札 Ⅱ期1 9例, Ⅲ A 期4 4例,

Ⅲ B 期2 7 例, Ⅳ期3例^であ り, 組 織 型 別^{に は}腺 病^{1 2 9}例, 扁 平 上皮 痛60 例, 腺 扁平 上 皮 癌7例, 大 細 胞 癌7例であった^.

Ⅰ. 骨 髄 中癌 細 胞^の積 出

1^. 骨 髄 中 細胞^のC K免疫 組 織 染 色 法

骨 髄 液^の採 取^にあたっ て は術 前, 患 者に研 究^の要 綱を説 明し,

承 諾を得た^. 全 身麻 酔 導^入後, 患 者 腸 骨 稜 を 穿 刺^し, 骨 髄液 を 5ml採 取^{し た. 1 0 ml テス ト チュ ー ブ}内に 3mlの M o n o^‑Pol_y

R_{e s o}Iving Mediu m ( 大日本 製 薬, 大 阪) ^{を 入 れ, その上 に 5ml}

の骨 髄 液 を 静か に重 層し, テ^スト チ ^{ュ ー} ブを6 0 分 間 遠 心 (^{3 0 0}Ⅹg, 室 温) ^し, 有核 細胞 を分 離^{し た.} 次^に, 1 0 分 間 遠心 沈 殿 (3 0 0Ⅹg, 室 温) さ^せ, pH 7^.2の P B S (日水 製 薬, 束京) を加 え 洗 浄 す^る作 業 を³ 回線 り 返^{し たの}ち】 P B S を1ml加 え細 胞 浮 遊 液を 作 製^{し た. チエル ク}氏液(武 藤 化 学, 東 京) 5 0_/∠‖^ニ細胞 浮 遊 液4 5 0_〃1を加 え有核^{細 胞の核 染 を 行い}, 血 球 計 算 盤に て細 胞

6 5 5

数 を 算 定^し, 細 胞 浮 遊 液^の濃度が 2 ^×1 0⁵個/ml となる ように調 製し た. さ ら に オ ^ー トス メ ア (^{サ ク ラ}製 機, 束 京) ^{に て}細 胞 浮 遊 液を 5枚^{の ス}ラ イ ド グ ラ^ス上 に塗 布 (^{3 0 0Ⅹ}g, 室 温, 1 0分 間) し細 胞 塗 抹 標 本 を作 製し た. 細 胞 塗 抹 標 本は ^一晩 風 乾し た後,

4 % ^パラフ ォ ル ムアルデヒト^{アセ トン}(^{4 0 % パラフ ォ ル ムアル} デヒド, 0^.02 M リン酸潰 衝 液, 蒸 留 水, ア セ トンを1: 1:2 : 6 で混 合^し塩 酸に て p Ⅲ7^.0 に調 整^{し た}もの) ^{に て 4 ℃}, 1 0分 間 固

定し た^. C I(^の免 疫 組 織 染 色^は, ア ル カ リフ ォ ス ファタ ^ー ゼ抗 ア^ルカ リフ ォ ス ファ タ ^ー ゼ (^{alkalin e} pho sphata s e a nti^‑alk al in e pho sphata s e,A W ) 法^{3 1)32】}キ^ット (^{ダコ ジャ パ ン}, 京 都) ^の手 順に従^った. pH 7.6の0^.0 5 M ト リ^ス綬衝 液に て 5分 臥 3回^の洗 浄 を 行^{っ た}後, ト リス壊衝 液^{に て 2} 〃 g/^{ml に}希 釈^{し た}抗^{C E 1 8} 抗 体 (C E 2) (^{ベ ー} リンガ ^ー マ ンハイム_, 東京) を4 ℃ に て 2 4 時 間 反応^{さ せ た.} 反 応 終 了後, ト リス横 衝 液^{に て 5}分 間, 3 回^の 洗 浄を 行^い, 2次 抗 体 ( 抗^マウ^スIgG ウ サ ギ抗体) を室 温に て 3 0 分 間反 応さ せ た. ト リ^ス破 衝 液に て 3回 洗 浄し た後, 標 識 抗体 仏P A A P 複 合 体) ^を室温に て 3 0分 間 反 応さ せ た^. 同様に 5分 間,

3 回^の洗 浄 後, 発 色 基 質 (^{ナフトー ルA S‑M X リン}酸 塩 及びファ

ー ス トレッ ドT R l錠 を^{0.1 M ト リス}塩 緩 衝 液^{1ml に}溶 解^{し た}も

の) と室 温に て 2 0分 間 反応さ せ た^. 発 色 基 質^{に は さ ら に}, 骨 髄 内^の内 因性^{アル カ リフ ォ ス ファタ ーゼ}を 阻害 す^る目 的で 0.7 % の レバミ ゾ^{ー ル} Oe v a miz ole,Sigm a,St.I^JO uis,U S A) を1ml加 え た. 次に 1 0分 間 流 水 水 洗し た後, マイヤ ^{ー ･ へ} マ ト キ シ リ^ン ( 武 藤 化 学) に て 1分 間核 染 色 を 行^い, 水 道 水に て 5分 間 色 出し を 行っ た. 最 後に水 溶性 封 入 剤, ゲル/ ^マ ウント(^{コ ス モ バ}イ オ, 東 京) ^{に て}封^{入 し た.} 染 色^の陽 性 対 照^{と し て}, 腫 瘍 摘 出 時 に原発 巣^の捺 印標 本を作 製し, 同様^の方 法^{に て}染色 を 行^{っ た.}

2. 骨 髄 中^{C K}陽性 細 胞^の判 定

各^{症例につき}, 陽 性 村 照と して作 製し た原 発 巣^の捺 印標 本^が 陽 性である^ことを 確 認し た後, 骨 髄 細 胞 塗抹 標 本す^べてを 鏡 検 し, 核が明 瞭^{で かつ}細 胞 質が均^{一 に}赤 く 染 色さ れ た細 胞^{が 1} 個 でも あれ ば, 陽性と判定し た^.

Ⅱ. 原発 巣^{に お け る}免疫 組織 染色 法

ホルマリン固 定^パラフ ィ ン包 埋 標 本を 4_/J m の厚さ に薄 切 し, シ ラ^ンコ ^ー ティ ングス ライ ド( 武 藤 化 学) ^に付 着さ せ た.

キ シ ^{レ ン}に て 1 0 分 間, 3 回^の 脱^{パ ラフ ィ ン}を 行^{っ たの}ち,

1 0 0 % , 1 0 0 % , 1 0 0 % , 9 0 % , 7 0 % ^のエタノ ^ー ルに て各2 0 回 振 逢し, 親 水 処 理 を 行^い, 水 道 水^{に て 1} 分 間 流 水 水 洗^{し た.}

n m2 3^‑1i l 蛋 白は無 処理, V O n W ill br a nd 因 子お よ び V E G F は

0.0 1 M クエ ン酸綬 衝 液 (pH a O) ^{に て 5 00 W} , 5分 間, 3回^のマイ ク^ロウ^{エ ー} ブ処理 を行^っ た後, 室 温に て 0^.3 % 過 酸 化 水 素( 和 光^, 大 阪) 加P B S で 2 0分 間内 因性^{ペ ル}オ キ シ ダ^ー ゼ を阻 害し, 1 0分 間 流 水 水 洗し た^. 次に ウ シ 正常血清 (^{ダコ ジャ パ ン}) ^{にて1 0} 分

間^の ブロ ッキ^ング を行^っ た後, 抗^ヒトv o n W illbr a nd 因 子^{モ ノ}

ク^{ロ ー}ナ^ル抗 体 (^{ダコ ジャ パ ン}), 抗^ヒト V E G F ポ リ ク^{ロ ー} ナル

抗 体 (^{Sa nta Cr u z B iote chn olo}g y,Sa nta Cr u z, U S A), 抗^ヒト

n m2 3^‑H l モ ノク^ロー ナル抗 体 (^{Sa nta Cr u z B iote chn olo}g y) を 各々 pI 1 7^.2のP B S にて1 0 0倍に希 釈し, 4 ℃ に て 2 4時 間 反 応さ せ た.

一 次抗 体 反 応 後, P B S に て 5 分 間, 3 回 洗 浄し, ビ オ ナ ン標 識抗^マウ^ス, 抗ウ サ ギ, ヤ ギ抗 体 (^{ダコ ジャ パ ン}) を 室 温 下 に 2 0 分 反応さ せ た. P B S に て 5分 間, 3回洗 浄後, ペ ルオ キ シ ダ^ー ゼ標 識^スト^レプ ト ア ピ ジン(^{ダコ ジャ パ ン}) ^で室 温^{に て} 2 0分 間 反応 させ た^. 発 色 剤に は, 四塩 酸³, 3 ザ ア ミ ノ^{ベ ン}チ ジン(^{3,3‑d ia min obe n zidin etetr ahydr o ch llo ri de}) (和 光, 東京)