肝細胞 癌 け 測定 意義

肝 細胞癌^{に お} ける P I V K A ^‑Ⅰ 測 定^の意 義

M P I V K A ^‑Ⅱ 微 量 測 定を含^{め た}検 討 ^‑

金沢 大 学 医 学 部 内科 学 第 ^一講 座 (^主任^: 小 林 健^一 教 授)

大 帝 了 庸

( 平成⁴年⁴月^{9 日}受付)

肝 細 胞 癌お よ び各種 疾患^における 血紫 中 異 常プ^ロ トロ ン ビン(p^{r o}tein indu c ed by vita min K abs e n c e o r a ntago nist‑^Ⅱ,

P I V K A ^‑Ⅱ) を酵 素 抗 体免 疫 測 定 法 (^{E‑1 0 2 3})^{, E‑1 0 2 3 に ア ピ ジン ー ビ オチソ}法を応用 L , 微 量 測定を 可能^に し た高 感 度 法, ラ テ ック ス凝 集 法(T Z R^‑1 1 0) ^の3 法を用^い測 定し, そ^の有用性を検討^{した. E}‑1 0 2 3 に よ る測 定^{で は}, 0.1 A U/^ml以^{上 を}陽性とす る とt 健 常 人^は全例 陰 性^で, 肝 細胞 癌9 6例 中5 8例 (6 0 %), 肝 硬 変7 9例 中1 例 (1 %), 慢 性 肝炎8 3例 中3例 (3 %) が陽性を 示 し,

肝 細 胞 癌^にお^いて P I V K A^‑Ⅰ 陽性^ほ高 率^であり, その差^は有 意^であっ た(_p <0･0 0 1)･ ま た, P I V K A^‑Ⅱ とα^‑fet_opr otein

(^{A F P}) には相 関を認めず, 両 者 併 用^によ り肝 細 胞 痛^の診 断 率は 9 6例 中6 9例 (^{7 2 %}) と向上 した^･ さ ら^に ,経 時 的測 定に よ り, 肝 細 胸 痛の臨 床 経 過を反 映し た P I V K A^一Ⅱ の変 動 も 確 認^{さ れ た. 一}方, 他 臓器悪 性 腫 瘍や原 発 性 胆汁性 肝 硬 変^{の 一} 部に PI V K A^‑Ⅱ 高 値 例が み られた が, これ ら ほす^べて閉 塞 性 薫 痘や肝 内胆 汁 うっ滞 例^であ^{った. な お}, ビタ ミソK2投 与^によ り肝細 胞 痛 患 者^においても, 胆 汁^うっ滞 例^と同 様^に, P I V K A^‑E の低 下, 陰 性 化が認め ら れ, ビタ ミソK2反 応 性か らの両疾 患^の鑑別 は困難であ^った^. 高 感度 法を用^いた P I V K A‑^{Ⅱ 教 皇 測定で ほ, 0.00 8 A U}/ ^ml 以^{上 を}陽性^とする と, 健常^人は全 例 陰性^で,肝細 胞 癌^{では5 2}例 中^{3 3}例 (^{6 3 %})^が陽性であった^. E^‑1 0 2 3 に よ る測 定 結 果に比し, 肝 細 胞 癌での陽 性 率^の上昇と, 小 肝 細 胞癌で^の陽 性 例を認め た が, 胆 汁 う^っ滞 例^や肝硬 変 例^におけ^る陽 性 率 も 増 加^{した. ま た}, 本 法によ る測 定は, 経 過 中^に P I V K A^‑Ⅱ 値が E^‑1 0 2 3 の測 定 感 度 以下^{にな った}肝細 胞 癌 例に おいて, その臨 床 経過^の評 価^に有用 であった^{. ラ テ} ッ クス凝 集 法^{によ る}測定^は,

1 〃 g/^{ml以上 を陽 性とする と, 肝細 胞 痛3 7例 中2 1例 (5 6 %) が陽 性であった が, E‑1 0 2 3 での測 定 結 果に比し, 肝 硬 変や慢性肝} 炎での陽 性 率が高くな る慣 向が み ら れ た^. 以上の結 果か ら, E‑1 0 2 3 に よ る PI V K A^‑Ⅱ測 定^は, 阻 汁う^っ滞^の有 無, ビタ ミンK 投 与^の有 無^に留 意 する 必要^があ^{る が}, 肝細 胞 癌^の腫 瘍^{マ ー カ ー と し て}有用^であり, さ ら^に , 高 感 度 法に よ る微 量 測 定^の併用 はI P I V K A‑^{Ⅱ 低}値^の肝 細 胞 癌^の診 断や臨 床 経 過観 察^に有 用 性^が増 す も^のと考え られ た^. ま た, ラ テ ックス凝 集 法によ る測定 は簡 便^{で は}あ^{る が}, 肝細 胞癌 診断^{に お}ける特 異 性ほ劣る と考え ら れ た^･

K ey ^{w o r}ds hep^ato c ellula r carcin om a, P I V K A^‑Ⅲ, E LI S A m ethod, high ^{s e n sitiv e m ethod,1ate x}

ag glutin atio n m ethod

異 常プ^ロ ト^{ロン ビン}(pr otein indu c ed by ^vi^ta min K abs e n c e o r a ntago nist‑^{Ⅱ, P I V K A‑Ⅱ),ほビ タ ミ ンK の 吸 収 障 害や ワ ー}

フ_ァリソ投 与 な^{どによ る ビ タミソE の}利用障 害が存 在 する と出 現 する異常 蛋 白であり^{J ト 4 )}, 近 年^{L iebm a n} ら⁵⁾は放 射 性 免 疫 測 定 (^{T ad ioim m} u n o a s sy, RI A) 法^{に て,} 藤 山ら⁶⁾は酵 素 抗 体 免 疫 測 定 (e n zym e^‑1inked im m u n o s o rbe nta

.^{s s ay,E L IS A) 2抗 体サ ン ド}

イッ チ法にて, 各 種 肝 疾 患^における 血紫P I V K A ^‑[ を測 定し,

肝 細 胞 癌 (^hep^ato c ellula r c a r cin o ma, H C C) ^において , 高 率^に P I V K A^‑Ⅱ の出現を認め た と報 告し ている^. 今回著 者ほ^カッ プ

型^{E L IS A} 法 (^{E‑1 0 2 3})^丁), さら^に, E^‑1 0 2 3 に アビ ジソ ^ー ビ オチソ

系を応 用し た高感 度 法, ラテックス凝 集法 (^{T Z R}‑^{1 1げ)を用い,}

H C C を含^む各種肝 疾 患 及^び他の悪 性 腫 瘍^{に おいて, P I V K A ‑Ⅰ} を測 定し, H C C 診 断に おける PI V K A ^‑Ⅱ 測 定^の有 用 性^の検 討, さらに, H C C 以 外^の P I V K A^‑Ⅱ 陽 性 例^の検 討, 高感 度 法

によ る P I V K A^‑Ⅱ 微 量 測 定^の意 義^に関す^る検 討^を行^ったので A b br e viatio n s : A F P, α ^‑fetop^{r o}tein; A H, a C ute

報告 する^.

対 象およ び 方 法

Ⅰ. 対 象

金 沢 大学 医学 部第 ^一 内科^に入院^し, 腹 腔 軌 肝 生 軌 各種画 像 診 断, 手 札 剖検な ど^によ り診 断し え た H C C 9 6軌 肝硬変 (^{liv e r ci, rho sis}, L C)^{7 9}例, 慢 性 肝 炎 (^{chr o nic hepatitis･C H)} 8 3例, 急 性 肝 炎 (a c ute hepati^tis, A H) 2 0 例, 劇 症 肝 炎 (^{fulmin a nt he}patitis, F H) 4 例, 原 発 性 胆 汁 性 肝 硬変(prim ary

b ilia ry cir rho sis,P B C)2 1胤 ^{H C C} 以外^の悪 性 腫 瘍^{5 0}例( うち胃 癌^{2 0}例, 胃 悪 性^{リ ン パ}腫1 例, 肺癌3例, 胆 管 細 胞癌¹臥 膵 臓癌1 2例, 胆道 癌1 1例, 大 腸 癌² 例), お よ び健 常 人3 0例,計 38 3例を対 象と した^. なお, H C C 9 6例ほ, 男 性^{7 8}軌 女性¹⁸ 例, 年 齢^{6 0 ±1 0}歳^であ^った.

Ⅰ^. 検体 採取 法 お よび 保 存 法

hep^atitis : C E A , Ca r Cin o e mbry^{o n}ic antig^{e n}; C H , Chr o nic

hep^atitis; E D T A, ethyl_{e n e} dia min e tetr a a c etic a cid; E LI S A , e n Zy ^{m e‑}1inked im m u n o s o rbent ^{a s s a}y ; F H･

ful mi n a nt hep^atitis; Gla, T ^{‑C ar}bo xy gluta mic a cid r e sidu e s; G lu, gluta mic a cid r e sidu e s; = C C, hep^ato c e11^ula r

肝 細 胞癌^の PI V K A ^一Ⅱ

原月化 ^{し て,} 早 朝 空 腹 時^に3･8% ^{クエ ン}酸^{ナ トリ ウムを}含む

真^{空採血管を用い採血 し た･ 採血後 直ちに3 0 0 0 回転1 0分 間の遠}

心分離^を行^い一 得ら れ た 血凍^{を ‑2 0 ℃にて}凍 結し, 使用時ま^で 保存^した･

Ⅲ^. P I V K A^‑Ⅱ 測 定 法 1 ^. E‑^{1 02 3 操 作 法}

肌I S A 法を原^{理 と し た E‑1 0 2 3}(^{エ ー}ザ イ株 式 会モL 東 京) ^に ょる測定法^を以下^に示す^･

1) 第1反 応 抗^{P I V K A一Ⅱ モ ノ クロ}

ーナ ル抗 体を ^{コ ー} ト し た^カ ッ プ に 4

℃下^で全^{て の カップに}反 応 用溶 液(I O% 正常 家 兎血 軌 ^{5 0m M}

ethyle n e diami n e tetr a a c etic a cid (E D T A)･ 0^･7 5 M NaC l･

0^.1% ^{ベ ンザミジン, 0.1}% ^アジ化^{ナ トリ ウム}含^トリス塩 酸 緩 衝 敵0^.01 M pH 8■0) を 2 5F^LI ず^つ注入 し, さ ら^に P I V K A‑^Ⅱ

8^.O A U/^{ml の標 準 抗原 液を倍々希 釈し て作 製さ れ た 8･0, 4･0,}

2^.0, 1 几 0^.5,0^.2 5, 0^.1 2 5, 0^･0 6 3 A U/^{mlの標 準抗 原 液 ある}

いは, 標 準抗 原希 釈^用溶 液 (正常人 血旅6ml凍 結 乾煉 品+ 精 製 水^6ml), 被検血祭を各^々1 00〃lず^つ2カ ップに注^{入 し}, 4 ℃下 で16時間反 応^{さ せ た.}

2) 第2 反応

第¹反応 終了 軌 洗 浄 器 (^{ミ ニ}ウオッ シ ャ ^ー 8穴用) を 用^い,

4 ℃下で カッ プ内 溶 液^を吸 引 除 去^し, 0.0 1% Tw e e n 2 0含 有 0.15 M 塩化^ナト リ ウ^ム液に て洗 浄^{し た.} 洗 浄 終 了 後, 酵 素標 識 抗体 (^{ペルオ キシダー ゼ}結 合 抗プ^ロ ト^ロ ン ビ^ン抗 体) を 1 0 0〃1 ず^つ全ての カッ プに注入 し 4 ℃^{に て}1 時 間 反 応^{さ せ た･}

3) 第³ 反 応

第2反 応終 了後, 2) ^と同様^の方 法で吸 引, 洗浄を行った^･ さ ら に . 2, 2‑^{'a Zin o‑b is (3}‑^ethylbe n z othia z olin e‑⁶‑^{S ulpho nic}

a cid) 1 8mg をク^エ ン酸緩 衝 液^{( 0.1 M} pH 4^.2)1 2ml で溶 解し た 後, 3 % 過酸 化 水 素水3 0J^ノ1 を添 加^して作 製^{し た}酵 素 基 質 液 1 00〃1 を 4 ℃に て, 全て^{の カ}ッ プに注入 し,2 0 ^〜3 0 ℃に て1時 間反応さ せ た^.

4) 反応^の停止

第³ 反応 終了 後, 4 ℃下で反 応停 止液 (^{2m M アジ}化^{ナ ト リ}ウ ム)10 0/^Jl を全ての カッ プに注入 し, 反 応を停 止さ せ た^.

5) 反応 液^の光 学 的 測定

カップ内^の全溶 液 (2 00/‖) の吸光 度^を, 1 0 0‑^{2 0型デ ジタ ル} 分光光度計( 日立, 東 京) を 用^い, 精 製 水を対 照と し て波 長^{4 0 5}

n m に て測定^{し た.}

6) P I V K A‑^Ⅱ 値^{へ の}換 算

両 対 数グラフ 用 紙を使 用^し, 縦 軸に 吸 光 度を, 横 軸^に PI V K A‑^Ⅱ標 準 抗原 溶 液の各濃 度を記入 し た^. 次^に, 各 濃 度^の 標準抗原溶液^の測定か ら得ら れ た吸 光 度 値か ら標 準抗 原 希 釈用 溶液^の平均吸光 度値を減じ た数値を各^{々 プロ} ッ ト し, 標 準 曲 線 を作製した. さ らに被 検血凍^の測定で得ら れ た各^々2 検体^の吸 光度値の平 均か ら 仁標 準 抗 原 希 釈用 溶 液^の平 均^吸光 度値^を減じ た値を求^め, 標 準 曲線か ら被 検血祭 中^の P I V K A Ⅷ 値を算 出^し た･ 本法に て P I V K A‑^{Ⅱ 値は 0.06 3 A U}/ ^ml か ら 8 A U/^ml ま で 馳走が可能^であった^7).

なお, 対象 症 例全 例^{におい て}, 本 法^によ る P I V K A ^‑Ⅱ測 定を 行なった^.

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2 ^. 高感 度 法^によ る測定竜宮

E^‑1 02 3 に ア ピジン ^ー ビオ ジン系^を応 用し た高 感 度 法^によ る P I V K A^一Ⅱ 微 量 測定 法を以下に示す^.

1) 第¹反 応

E^‑1 0 23 操 作法と同 様^に, 抗^{P I V K A‑Ⅱ モ ノ クロ ー ナ ル}抗 体 を^{コ ー ト}し た^カップに_, 4 ℃ で全ての カッ プ に反 応 用溶液を 2 5 pl ず^つ注入 し, さ らにP I V K A^‑Ⅱ 8.O A U/^{ml の標 準 抗原 液を} 倍^々希 釈し て作 製さ れ た 8^.0, 4^.0, 2^.0, 1 ^.0, 0^.5, 0^.2 5,

0.1 2 5, 0.0 6 3,0.0 31,0.0 1 6,0.0 08 , 0.0 0 4 A U/^{ml の標 準抗 原} 液 ある^いは, 標 準 抗原 希 釈用 溶 液^, 被 検血凍を各^{々1 0 0}両 ず^つ

2^カ ップに注入 し, 4 ℃下で1 6時 間 反 応さ せ た^. 2) 第² 反 応

第1 反 応 終 了後, 洗 浄 器^{に て}4 ℃下でカップ内溶 液を吸 引除 去^し,0.0 1% ^{Tw e e n 20} 含 有^{0.1 5 M} 塩 化^{ナ ト リウム}液^にて洗 浄L た^. 洗 浄 終 了後^{ビ オチソ}化 抗プ^ロ ト^{ロ ン ビン}抗 体を 1 0 0

〟1 ずつの全て の カ ップに注入 し, 4 ℃^{に て}1 時 間反 応さ せ た^. 3) 第³反 応

第2反 応終 了 後, 2) と同様^の方 法で吸 引, 洗浄を行^った^. さ ら^に, アピ ジン化^{ペルオ キシダー ゼを 1 0 0}〟1ず^つ全て^{の カ}ッ

プに注入 し, 4 ℃に て1時 間反 応さ せ た^. 4) 第⁴反応

第3反 応 終 了後, 2), 3) と同 様^の方法^で吸 引, 除去^を行^っ た. さ らに一 酵 素 基 質液1 0 0/バ を 4 ℃^にて全ての カップに注入 し, 2 0^〜3 0 ℃^にて 1 時 間 反応^{さ せ た.}

5) 反 応^の停 止

第⁴反 応 終 了後, 4 ℃下で反 応停 止 液(^{2m M アジ}化^ナト リ ウ

ム) 1 00〟1 を全て の カッ プに注入 し, 反 応を停 止^{さ せ た.} 6) 発 色液^の光 学 的測 定

カッ プ内^の全 溶 液 (2 0 0両) ^の吸光 度^を, 1 0 0 ^‑2 0型^{デ ジタ ル} 分 光 光 度 計 (日 立) を 用^い , 精 製水を対照と して波 長^{40 5}n m に て測 定^{し た.}

7) P I V K A‑^Ⅱ 値^への換 算

両対 数^{グラ フ用}紙を使用 し, 縦 軸^に吸光 度を, 横 軸^に P I V K A一^Ⅲ標 準 抗 原 溶 液^の各濃 度を記入 し た^. 次^に, 各 濃 度^の 標 準 抗 原 液^の測 定か ら得ら れ た吸 光 度値か ら標 準 抗原 希 釈用溶 液^の平 均 吸 光度 値を減じた数値を各^々プロ ッ トし, 標 準曲 線^を 作 製した. さ ら^に, 被 検血紫^の測 定で得ら れ た各^々2 検体^の吸 光度 値^の平 均か ら標 準 抗原 希 釈用 溶 液^の平均吸光 度 値を減じ た 値を求め, 標 準曲 線か ら被 検血祭 中^の P I V K A Ⅷ 値を算 出^し た. 本法^{に て} ,P I V K A‑^{E 値は 0.0 0 8 A U}/^ml か ら 1 A U/^ml ま^で 測定が 可能^であ^っ た^.

な お, 対 象 症 例^{のう ち, H C C 5 2}例, L C 4 3例. C H 4 1例,

A H 3 例, F H 2例, P B C 8 例, 他 臓器悪 性 腫 瘍^{2 2}例, 健常^人 2 0例, 計1 9 1例^において, 本法お よ び E‑^{1 0 2 3に} よ る P I V K A‑^Ⅲ 測 定を同^山 検 体^を用^{い て}行った.

3 ^. T Z R^‑1 1 0 操 作 法

正常^{プ ロ ト ロ ン ビン は バ リ ウム} 塩^に吸着 さ れ る が,

P I V K A ^‑Ⅱ は吸 着さ れ な^い性質^{8 )}を利 用^し, バリ ウム塩^で吸 着 処^{理 し た}後^の検 体^について抗^ヒト プ^ロ ト^ロ ン ビン抗 体との ラ テッ クス凝集 反 応を指標と し た T Z R^‑1 1 0( 帝 国臓 器 製薬株式 会 社, 東 京) に よ る PI V K A^‑Ⅱ 測 定 法を以 下に 示す^.

C a rci_{n o m a;} L C_, liv e r cir rho si^s; P B C, p^rim a ry bilia ry ^cir rho sis; P I V K A^‑Ⅰ, p^{r O}tein indu c ed b_y vita m in

abs e n c e or a ntag^{o n}ist^‑Ⅰ; RI A, r adioim m u n o ass ay