博士（農学）駒井史訓 学位論文題名
組 織・細 胞培養法 による ホウレンソウ植物体再生系の 作 出 と そ の 利 用 に 関 す る 基 礎 的 研 究
学位論文内容の要旨
ホウレンソウの栽培面において望まれている全雌性系統の作出と、
性表現に関する基礎的な知見を得ることを目的として、組織および細 胞培養法による植物体再生系を作出し、その系において得られた再生 植物体の特性について検討した。研究内容は、次のように要約される。
1．ホウレンソウの植物体再生系の作出
ホウレンソウの優良株の栄養繁殖や、性表現の解析に利用できる、
優れた植物体再生系は確立されていない。そこで、効率的かつ再現性 の高い、組織およびプロトプラストからの植物体再生系を作出した。
（1）予備実験によって、高い植物体再生率を示すホウレンソウ品種 および組織片採取部位について検討したところ、 次郎丸 の根組織 片がカルスおよぴ不定胚形成に優れていることが明らかになった。し たがって、この材料を用いて、分化に適した培地主要成分の種類と濃 度について検討した。根組織片由来カルスからの不定胚は、オーキシ ン単用培地では形成されず、オーキシンとサイトカイニンの併用培地 において低頻度で形成された。また、不定胚は、オーキシンとジベレ リンの併用培地において最も高頻度で、かつ再現性よく形成されるこ とが判明した。6種類の既存培地を用いて根組織片を培養したところ、
1/2MS培地とNitsch培地において高い頻度で不定胚が形成されること が明らかとなり、さらに、不定胚形成は、培地の硝酸態窒素とアンモ ニ ウム態 窒素 の比率 が2対1の条 件下 におい て、 全窒素 濃度 が10〜
30mMの場合に最も 高い頻度で誘 起されることを見出した。また、10 種類の糖質を用いて、不定胚形成に対して促進的に働く糖質を選定し たところ、フルクトースおよぴラフイノースが最も大きな効果を現す ことがわかった。
（2）ホウレンソウ芽生えから取り出した子葉丶丶胚軸、および根組織 のうち、プロトプラストの収量は子葉組織を用いた場合に最も多く、
酵素処理後にピンセットで組織片を崩す処理を施すことによってその 収量が増加した。子葉プロトプラストからのコロニー形成にiま、2，4・ DlpMとzeatin10pMの 組 み合 わせ が 最も 効果的 であり、この培 地の 浸透価は、マンニトール0.5Mが至適であることが明らかになった。子 葉プロトプラストから形成されたコロニーiま、カザミノ酸を添加した 液体培地に 懸濁すると、 カルスを形成 した。NAAとGA3を併用した培 地で生長したカルスからは不定胚および不定根が形成され、その後、
不定胚は発育して幼植物となり、この不定根から採取した外殖片は、
次 代 の 培 養 に お け る 植 物 体 再 生 に 有 効 で あ る こと が 判明 し た。
2.ホウレンソウの植物体再生過程の解析
ホウレンソウ根組織由来の、不定胚を形成しつっあるカルス中の物 質の変化を経時的に調べるとともに、植物体再生過程を組織学的に観 察 し 、 植 物 体 再 生 に 伴 う 内 的 要 因 に つ い て 検 討 し た 。 （1） ラフ イ ノー ス を添 加し た 液体 培地(NAAlOメMお よびGA30.1 pMを含む）で根組織片を培養した場合、ラフイノースが分解されて生 じると思われるフルクトースが優先的に利用されていることが判明し た。また、このような根組織片によるフルクトースの優先的な利用は、
スクロースを添加した液体培地でも確認された。ジベレリン添加培地 において形成されたカルス（不定胚形成能を持つ）および無添加培地 におけるカルス（不定胚形成能を持たない）からは20種類の遊離アミ ノ酸が検出され、グルタミン酸、グ少夕ミンおよびプロリンの含量が 大きく変動することが明らかになった。また、不定胚を形成しつっあ るカルスでは、植物体再生に伴うグルタミン酸含量の減少が顕著であ
り、これが不定胚形成に関与する要因の1つであることが示唆された。
電気泳動法により、不定胚形成能を持っカルス中の可溶性夕ンパク質 を不定胚形成に至る各過程ごとに調べたところ、スポット数は根組織 片自体および不定胚形成能を持たないカルスのそれよりも少ないこと が認められ、ジベレリン存在下ではある種のタンバク質合成の抑制が 起こるものと思われた。また、不定胚形成のみられないカ´レスでは各 種夕ンパク質の合成がほとんど抑制されないことから、ジベレリンに よるタンバク質合成の抑制と不定胚形成との聞に何らかの関連がある ものと推察された。一方、不定胚を形成しつつあるカルス中には、胚 様体の形成以前に、不定胚を形成していないカルスでは検出されない タンバク質の出現が確認された。
（2）ホウレンソウの根組織をNAAとGA3を組み合わせて添加した培 地にお いて 培養す ると 、中心 柱組 織から容易にembryogeniccallus (EC）が誘導され、ECが胚様体を形成し、この胚様体から不定胚が形成 されることが組織学的観察によって明らかになった。このように、EC は根の中心柱組織を構成している細胞に由来することがわかった。ま た、組 織学 的観察 によ り、NAA単用 培地では胚様体が形成されず、
NAAおよびGA3を含む培地では形成されたことから、胚様体は培地中 のGA3によって誘導されると考えられる。
3.ホウレンソウの性表現の解析
ホウレンソウの性表現に関する知見を得るために、各種生長制御因 子 に よ る 不 定 胚 由 来 植 物 体 の 性 表 現 の 変 化 に つ い て 調 べ た 。 （1）ホウレンソウの雌性株および雄性株に由来する、第1代目の再 生植物体における雌雄性を検討した結果、雌性株由来の再生植物体は 全て雌性を示したが、雄性株由来の再生植物体の性表現には変化が認 められ、11.7％の頻度で間性が出現した。さらに、雌性株およぴ雄性 株に由来する第2代目の再生植物体における雌雄性を検討した結果、
雌性株および雄性株由来の再生植物体の性表現は、ともに間性に変化 したが、いずれの場合にも、雌性から雄性、およぴ雄性から雌性への
性 表現 の転 換は起 きて いな いこ とが確 認さ れた 。雌花の変化によって 生 じた 間性 花は自 家受 粉に よっ て種子 を形 成し 、その種子は発芽カを 有 して いた 。しか し、 雄花 の変 化によ って 生じ た間性花は自殖によっ て種子を形成したが、それらは発芽しなかった。一方，、間性株由来の 再生植物体は全個体が間性を表した。
（2）培 養系 における再生植物体の着花および開花は、長日条件で促 進 され 、短 日条件 では 抑制 され るなど 、種 子由 来植物と同様の生育特 性を示した。また、．再生植物体の性表現は培地ヘ添加したGAヨ濃度によっ て変化し、特に、雄性から間性への変化が促進されることがわかった。
そ こ で 、 培 地に ジベレ リン 生合 成阻 害剤（AM01618、CCC)を 添加 し、
雄 性か ら間 性への 移行 を抑 制す ること を試 みた ところ、これらの薬剤 を 添加 する と、逆 に間 性株 が多 く出現 した 。こ れらのことから、ホウ レ ンソ ウの 雌性株 から 間性 株へ の移行 また は雄 性株から間性株への移 行において、GAヨの作用とジベレリン生合成阻害剤の作用と．の関連がい か な る も の で あ る か に つ い て は 明 ら か に で き な か っ た 。 以上 のよ うに、 本研 究は 、組 織およ び細 胞培 養法によってホウレン ソ ウの 植物 体再生 系を 作出 し、 この系 が、 一般 栽培における優良株の 栄 養繁 殖な らぴに 採種 栽培 に有 用な雌 性株 の作 出と栄養繁殖に応用で き るこ とを 示すと とも に、 雌雄 性発現 機構 に関 する基礎的知見を得る た め の 実 験 系 と な り 得 る こ と を 明 ら か に し た も の で あ る 。
学 位 論 文 審 査 の 要旨 主 査
副 査 副 査 副 査
教 授 教 授 教 授 助 教授
原 田 喜 久田 佐 野 増 田
学 位 論 文 題 名
隆 嘉郎 芳雄 清
組 織 ・ 細 胞 培 養 法 に よ る ホ ウ レ ン ソ ウ 植 物 体 再 生 系 の 作 出 と そ の 利 用 に 関 す る 基 礎 的 研 究
本 論 文 は 、 緒 言 、 本 論7章 、 摘 要 、 引 用 文 献119、 図35お よ ぴ 表30を 含 む 153頁 の 和 文 論 文 で 、 別 に 参 考 論 文 4編 が 添 え ら れ て い る 。 ホ ウ レ ン ソ ウ の 栽 培 に お い て 望 ま れ て い る 優 良 株 の 栄 養 繁 殖 、 全 雌 性 系 統 の 作 出 お よ ぴ 性 表 現 の 解 析 に 応 用 で き る 確 実 な 植 物 体 再 生 系 は 、 こ れ ま で に 確 立 さ れ て い な い 。 本 研 究 は 、 組 織 お よ ぴ 細 胞 培 養 法 に よ る 再 現 性 の 高 い 植 物 体 再 生 系 を 作 出 し 、 そ の 系 に お い て 得 ら れ た 再 生 植 物 体 の 特 性 に つ い て 検 討 し た も の で 、 内 容 は 次 の よ う に 要 約 さ れ る 。
1． 組 織 ・ 細 胞 培 養 に よ る 植 物 体 再 生 系 の 作 出
（1） 高 い 植 物 体 再 生 率 を 示 す ホ ウ レ ン ソ ウ 品 種 お よ ぴ 組 織 片 採取 部 位 につ い て 検 討 し 、 品 種 次 郎 丸 の 根 組 織 片 が カ ル ス お よ ぴ 不 定 胚 形 成 に 優 れ て い る こ と が 明 ら か に な っ た 。 根 組 織 片 由 来 カ ル ス か ら の 不 定 胚 形 成 は 、 オ ー キ シ ン 単 用 培 地 で は み ら れ ず 、 オ ー キ シ ン と サ イ ト カ イ ニ ン の 併 用 培 地 に お い て 誘 起 さ れ た 。 さ ら に 、 不 定 胚 形 成 は 、 オ ー キ シ ン と ジ ベ レ リ ン の 併 用 培 地 に お い て 最 も 高 頻 度 で 起 こ り 、 か つ 再 現 性 の 高 い こ と が 明 ら か に な っ た 。 ま た 、 不 定 胚 形 成tよ1／2MS培 地 とNi tsch培 地の よ う に、 硝 酸 態窒 素 と ァン モ ニ ウ ム 態 窒 素 の 比 率 が2対 1で 、 全 窒 素 濃 度 が 30mMで あ る よ う な 培 地 に お い て 高 い 頻 度 で 誘 起 さ れ る こ と を 見 出 し た 。 添 加 す る 糖 質 は 、 フ ル ク ト ー ス お よ ぴ ラ フ イ ノ ― ス が 不 定 胚 形成 に 対 し て最 も 大 きな 効 果 を現 す こ とが わ か っ た 。
（2） ホ ウ レ ン ソ ウ 芽 生 え の 子 葉 、 胚 軸 、 お よ ぴ 根 組 織 の う ち 、プ ロ ト プラ
ス トの 収量 は子 葉組 織を用いた場合に最も多く、ブロトブラストからのコロ ニー形成には、2，4．D1メMとzeatin 10メMの組み合わせ添加が最も効果的で、
培地の浸透価は、マンニトー少O．5Mが至適であることが明らかになった。コ ロ ニー は、 カザ ミノ 酸を添加した液体培地に懸濁するとカJkスを形成し、こ の カル スをNAAとGA3を併用 した 培地 に移 植す ると 、不 定胚 およ ぴ不 定根 が 形 成さ れた 。そ の後 、不定胚は発育して幼植物となり、また、不定根から外 殖 片 を 取 っ て 培 養 す る と 、 植 物 体 を 再 生 す る こ と が わ か っ た 。 2!植物体再生過程の解析
ホウ レン ソウ 根組 織由来であり、不定胚を形成しつつあるカルスを用いて 内 部物 質の 変化 を経 時的に調べるとともに、植物体再生過程を組織学的に観 察した。
（1） ラ フ イ ノ ー ス を 添 加 し た 液 体 培 地（NAA 10pMお よ びGA30．lpMを 含 む ）で 根組 織片 を培 養した 場合 、ラ フイ ノー スが 分解 され て生 じる と思 わ れ る フル クト ース が優 先的に 利用 され てい るこ とが わか った 。ジ ペレ リン 添 加 培 地に おい て形 成さ れたカ ルス （不 定胚 形成 能を もつ ）お よぴ 無添 加培 地 に お ける カル ス（ 不定 胚形成 能を もた ない ）か らは20種 類の 遊離 アミ ノ酸 が 検 出 され 、不 定胚 を形 成しつ つあ るカ ルス では 、植 物体 再生 に伴 うグ ルタ ミ ン 酸 含 量 の 減 少が 顕 著 で あ り 、 こ れ が不 定胚 形成 に関与 する 要因 の1つで あ るこ とが 示唆 され た。 まIた 、不 定胚 形成 のみ られ ないカルスでは各種タンバ ク質の合成がほとんど抑制されないことがわかった。
（2） ホ ウ レ ン ソ ウ の 根 組 織 をNAAとGA3を組 み合 わせ て添 加し た培 地で 培 養 す る と 、 中 心柱 組 織 か ら 容 易 にembryo ge niccallus（EC）が 誘導 され 、 ECが 胚様 体を 形成 し、 この胚様体から不定胚が形成されることが明らかになっ た。
3.再生植物体の性表現の解析
（1） ホウ レン ソウ の雌 性株 およ び雄 性株 の根 を培養して得た再生植物体 （ 第1代 ）に おけ る雌 雄性 を検 討し た結 果、 雌性 株由来の再生植物体は全て 雌性を示したが、雄性株由来のものでは雄性のほか．にll．7％の低頻度である が 間 性が 出現 した 。さ らに、 これ らの 雌性 株お よぴ 雄性 株の 根を 培養 して 得 た 第2代 目 の 再 生 植 物 体 で は 、 と もに 低率 なが ら間 性が 出現 した が、 いず れ の 場 合に も、 雌性 から 雄性、 また は雄 性か ら雌 性へ の性 の転 換は 起き てい な いことが確認された。
（2）培養系における再生植物体の着花およぴ開花は、長日条件で促進され、
短日条件では抑制されるなど、種子由来植物と同様の生育特性を示した。ま た、再生植物体の性表現は培地ヘ添加したGA3濃度によって変化し、特に、
雄性から間性への変化が促進されることがわかった。
以上のように、本研究は、組織・細胞培養法によるホウレンソウの植物体 再生系を作出し、この培養系が、一般栽培における優良株の栄養繁殖、なら ぴに採種栽培に有用な雌性株の作出と栄養繁殖に利用できることを示すとと もに、雌雄性発現機構の検討に有効であることを明らかにしたもので、新た な ホ ウ レ ン ソ ウ 栽 培 技 術 の 確 立 に 寄 与 す る も の と 考 え ら れ る 。 よって審査員一同tま、最終試験の結果と合わせて、本論文の提出者駒井史 訓は博士（農学）の学位を受けるのに十分な資格があるものと認定した。
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