歯髄細胞の自然免疫反応における
IDO 誘導を介した IFN-γ の調節的役割
武川 大輔
キーワード：歯髄細胞，interferon-γ，toll-like receptors，nucleotide-binding oligomerization domain， indoleamine 2, 3-dioxygenase
Modulatory Roles of Interferon-γ through Indoleamine 2, 3-dioxygenase Induction
in Innate Immune Response of Dental Pulp Cells
Daisuke TAKEGAWA
Abstract：In the progression of pulpitis, marked infiltration of inflammatory cells such as activated T cells producing interferon-γ (IFN-γ) is observed. Indoleamine 2, 3-dioxygenase (IDO) is a regulator of immune responses and the IDO expression is induced by IFN-γ in a variety of cells, whose expression in dental pulp is unknown. Dental pulp cells have a capacity to produce various pro-inflammatory cytokines through microbial pattern recognition receptors (PRRs) such as toll-like receptors (TLRs) or nucleotide-binding oligomerization domain (NOD) like receptors. We hypothesized that IFN-γ can modulate immune response to PRRs ligands on the dental pulp cells. The purpose of this study was to determine the role of IFN-γ in the innate immune response on production of pro-inflammatory cytokines such as C-X-C motif chemokine 10 (CXCL10) and interleukin (IL)-6 and IDO expression in cultured human dental pulp cells (HDPC). Enzyme-linked immunosorbent assay revealed that IFN-γ significantly up-regulated CXCL10 and IL-6 production in the HDPC stimulated with ligands for PRRs such as TLR2, TLR4, NOD1 and NOD2 in a concentration-dependent manner. Immunohistochemistry demonstrated expression of IDO in inflamed pulp tissue. In addition, IFN-γ in combination with the PRR ligands enhanced IDO expression in the HDPC compared with IFN-γ alone. Moreover, CXCL10 production in IFN-γ-stimulated HDPC was inhibited by an IDO inhibitor. Taken together, this study demonstrated the synergistic effects by IFN-γ on CXCL10 and IL-6 production and expression of IDO in HDPC. These findings suggest that IFN-γ may modulate the innate immune response of dental pulp cells.
徳島大学病院歯科保存学分野
Conservative Dentistory, Tokushima University Hospital 受付：平成 25 年 12 月５日／受理：平成 26 年１月 10 日
緒 言
歯髄は硬組織に囲まれ，周囲組織と根尖孔で交通する という閉鎖的な環境下にある。そのため，生体の防御反 応，異物除去や組織の修復機転が起こりにくく1），歯髄 炎の進行に伴い歯髄組織が不可逆的な変化をたどりやす いとされている2）。事実，温熱刺激による疼痛など急性 症状のある歯髄炎は，歯髄充血などのごく初期のものを 除き，不可逆性歯髄炎と診断され3-5），抜髄処置の適応 とされている。一方，術前に症状のない症例では直接覆 髄処置による歯髄の保存が可能であることも報告されて おり6-8），う蝕除去中に露髄した場合の覆髄の適否につ いては現在もなお明確な基準はない。近年，可能な限り 生活歯髄を保存しようとする機運が高まってきており， どのような歯髄の状態なら歯髄保存が可能なのかを正確 に知ることは非常に重要な課題である。また，臨床所見 に頼らない定量的，定性的な歯髄炎の病態把握が可能に なれば，新たな歯髄保存治療の開発にもつながると考え られる。 歯髄炎は，主にう蝕細菌による侵襲に対して歯髄の生 体防御機構が作動することにより惹起される9-11）。すな わち，象牙質に侵入した細菌や，その細菌が産生する成 分が象牙細管を通じて抗原刺激となり，象牙質近傍に分 布している樹状細胞やマクロファージといった免疫担当 細胞を活性化することにより歯髄炎が発症するとされて いる12）。さらに，う蝕の進行に伴い，歯髄にリンパ球浸 潤が顕在化する13, 14）とともに，歯髄組織の大半を占め る歯髄細胞から様々な炎症関連メディエーターが産生さ れ，炎症反応がさらに拡大していく。一般に，生体にお ける免疫反応は自然免疫と獲得免疫に大別され，自然免 疫は細菌などの病原体の侵入に対し，生体が病原因子の 構造パターンを受容体で感知することにより発動する即 応性の応答であると言われている。この病原因子構造パ タ ー ン はPathogen-Associated Molecular Patterns（ 以 下， PAMPs と略す）と総称され，いずれの構造パターンも， 広い範囲の微生物グループの間で長く保存されている。このPAMPs を認識するのが自然免疫関連受容体（pattern
recognition receptors，以下 PRRs と略す）であり，Toll-like receptor（以下，TLR と略す）や Nucleotide-binding oligomerization domain（以下，NOD と略す）が知られて いる。PRRs は，PAMPs を認識することで細胞内にシグ ナルを伝達し，炎症関連メディエーターが発現される。 当教室では，歯髄細胞がTLR や NOD を発現しており， これらの受容体が歯髄炎における免疫応答にも積極的に 関与している可能性があることを報告した15）。自然免疫 は，生体防御機転の早期から応答する第一線の生体防御 機構であり，歯髄炎の病態形成においても重要な役割を 果たしていると考えられる。 インターフェロン γ（以下，IFN-γ と略す）は，T 細 胞のほか，ナチュラルキラー（NK）細胞・樹状細胞・ マクロファージなどで産生され，免疫系に対して調節 作用を有することが知られている。歯髄炎においてもT 細胞が病態形成に重要な役割を果たしていることが示 唆されており16），浅在性および深在性う蝕を有する歯髄 において１型ヘルパーT 細胞（以下，Th1細胞と略す） が多く認められること17），歯髄炎において活性化され たTh1細胞から産生される IFN-γ の産生量が優位に増加 していること18）などが報告されている。さらに，当教 室においてIFN-γ 関連サイトカインである C-X-C motif chemokine 10 （以下，CXCL10と略す）のレセプターで あるCXCR3陽性 T 細胞が，炎症歯髄において認められ たことを報告した19）が，歯髄細胞の自然免疫応答に対 するIFN-γ の役割については明らかにされていない。 イ ン ド ー ル ア ミ ン 酸 素 添 加 酵 素（Indoleamine 2, 3- dioxygenase，以下 IDO と略す）は，トリプトファン代 謝の初期に発現する酵素で20, 21），ヒトの肺，小腸，胎盤 など多くの組織に分布し，種々の感染症や炎症性疾患で 強く誘導されることが報告されている22）。また，樹状細 胞，マクロファージ，好酸球，線維芽細胞，内皮細胞な ど幅広い細胞種に発現しており23-27），リウマチなどの炎 症性疾患において発現が認められている28）。IDO は感染 細胞や腫瘍細胞内でIFN-γ により100倍酵素活性が上昇 し，著明に誘導されることから29, 30），歯髄内で産生され るIFN-γ と関連し，歯髄炎の進展や制御に重要な役割を 果たしている可能性がある。 そこで本研究では，活性化されたT 細胞で産生さ れ，免疫系に対して調節作用を有するIFN-γ に着目し， PRRs リガンド刺激した歯髄細胞での IFN-γ に対する炎 症関連因子，とくに歯髄炎の病態形成におけるリンパ球 浸潤において重要な役割を担っていることが示唆されて いるIL-6および CXCL10の発現について検討するとと もに，IFN-γ により強く誘導され，生体内の免疫調節に 関与すると言われるIDO に着目し，歯髄細胞における IFN-γ と IDO 発現との関連性について検討を行った。
材料と方法
う蝕および歯周炎を有さない健全智歯あるいは矯正 目的のため便宜抜歯された健全小臼歯より歯髄を採取 し，細切した組織片から遊走した細胞を歯髄細胞とし て初代培養し，５∼ 10 代継代したものを実験に使用し た。PRRs リガンドとして Pam3CSK4（TLR2リガンド），Escherichia coli Lipopolysaccharide（TLR4 リ ガ ン ド ），
γ-D-glutamyl-meso-diaminopimelic acid（NOD1リガンド）， muramyl dipeptide（NOD2リガンド）を用い，これらで 刺激した歯髄細胞におけるIFN-γ の影響を検討した。す なわち，歯髄細胞に対しPRRs リガンドとともに IFN-γ を一定時間作用させ，培養上清中のIL-6および CXCL10 濃度をELISA 法にて測定した。さらに，歯髄組織にお けるIDO 発現を検討するため，歯髄炎病変部における IDO の局在を免疫組織化学的に検討した。続いて，歯髄 細胞におけるIDO 発現および PRRs リガンド刺激した
歯髄細胞におけるIDO 発現の変化と IFN-γ の影響につ いて検討するため，歯髄細胞でのIDO タンパクの発現 をウエスタンブロッティングにて解析した。また，IDO インヒビターが歯髄細胞に及ぼす影響を検討するため， IFN-γ 刺激を行った歯髄細胞に IDO インヒビターを作用 させ，培養上清中のIL-6 および CXCL10 濃度を ELISA 法にて測定した。
結 果
１．PRRs リガンドで刺激した歯髄細胞における IFN-γ の影響 歯髄細胞の自然免疫応答に対するIFN-γ の影響を検討 するため，歯髄細胞にPRRs リガンドと IFN-γ を共刺激 させ，IL-6 および CXCL10 の産生量への影響を ELISA 法にて解析した。 １）TLR2リガンドで刺激した歯髄細胞の IFN-γ に対す る反応性 TLR2リガンドである Pam3CSK4で単独刺激を行った 場合，CXCL10 産生は Pam3CSK4 濃度に依存して増加 した。また，IFN-γ 単独刺激を行った場合においても， IFN-γ 濃度に依存して CXCL10産生は増加した。さらに， Pam3CSK4と IFN-γ を共刺激させることで，CXCL10の 産生量がIFN-γ 濃度に依存して相乗的に増加した（図 １−Ａ）。一方，IL-6産生は IFN-γ によって誘導されない が，pam3CSK4単独刺激では濃度に依存して IL-6産生が 増加した。また，pam3CSK4と IFN-γ を共刺激させるこ とで，pam3CSK4単独刺激に比べ，IL-6産生が相乗的に 増加した（図１−Ｂ）。 ２）TLR4リガンドで刺激した歯髄細胞の IFN-γ に対す る反応性 TLR4リガンドである LPS で単独刺激を行った場合， CXCL10産生は LPS 濃度に依存して緩やかに増加した。 また，LPS と IFN-γ を共刺激させることで，CXCL10の 産生量はIFN-γ 濃度に依存して相乗的に増加した（図１ −Ｃ）。一方，IL-6 の産生量も LPS 濃度に依存して緩や かに増加し，さらにLPS と IFN-γ を共刺激させること で，LPS 単独刺激に比べ，産生量が相乗的に増加した （図１−Ｄ）。 ３）NOD1リガンドで刺激した歯髄細胞の IFN-γ に対す る反応性 NOD1リガンドである iE-DAP で単独刺激を行った場 合，CXCL10の発現は全く認められなかった。しかし， IFN-γ と共刺激させることで，CXCL10の産生量は IFN-γ 濃度に依存して相乗的に増加した（図１−Ｅ）。また， IL-6産生については，IFN-γ 単独刺激，iE-DAP 単独刺激 いずれにおいても産生は全く認められなかった。しか し，IFN-γ と iE-DAP を共刺激させることで，その産生 量はIFN-γ 濃度に依存して相乗的に増加した（図１−Ｆ）。 ４）NOD2リガンドで刺激した歯髄細胞の IFN-γ に対す る反応性 NOD2リガンドである MDP 単独の刺激では，iE-DAP 単独刺激と同様にCXCL10 の発現は全く認められな かったが，IFN-γ と共刺激させることで，その産生量は IFN-γ 濃度に依存して相乗的に増加した（図１−Ｇ）。ま た，IL-6 産生についても，IFN-γ 単独刺激，MDP 単独 刺激いずれにおいても産生は全く認められなかったが， IFN-γ と MDP を共刺激させることで，その産生量は IFN-γ 濃度に依存して相乗的に増加した（図１−Ｈ）。 ２．歯髄組織における IDO 陽性細胞の局在 図１の結果から，IFN-γ が歯髄細胞の PRRs に対する 反応を修飾していることが確認された。そこで，歯髄局 所におけるIFN-γ の役割をさらに検討するため，IFN-γ によって誘導され，免疫応答に関与することが示唆され ているIDO の歯髄炎病変部における局在を，ヒト歯髄 組織を用いて免疫組織化学的に検討した。その結果，炎 症歯髄組織においてIDO 陽性細胞の局在が確認された 図１ PRRs リガンドで刺激した歯髄細胞における IFN-γ の影響（図２−Ａ）。染色された細胞は，形態的にリンパ球やマ クロファージなどの免疫細胞を中心に，一部歯髄細胞が 染まっている像が認められた。なお，正常歯髄組織にお いては，陽性細胞はほとんど確認されなかった（図２− Ｃ）。また，抗IDO 抗体と同じ陰性のコントロール抗体 を１次抗体とした場合，炎症歯髄組織，正常歯髄組織と もに特異的な染色は認められなかった（図２−Ｂ，Ｄ）。 ３．歯髄細胞における IDO タンパクの発現 免疫組織化学的解析により，IDO が炎症歯髄組織にお いて発現していることが明らかとなった。そこで，歯髄 細胞におけるIDO 発現および PRRs リガンド刺激した 歯髄細胞におけるIDO 発現の変化と IFN-γ の影響を検 討するため，培養歯髄細胞におけるIDO タンパクの発 現をウエスタンブロッティングにて解析した。 無刺激時の歯髄細胞におけるIDO タンパクの発現は 認められず，またPRRs リガンド単独刺激を行っても， IDO タンパクの発現は誘導されなかった（図３−Ａ）。一 方，IFN-γ 単独刺激を行った歯髄細胞において，IDO タ ンパクの発現は認められ，さらにIFN-γ と Pam3CSK4， LPS（図３−Ａ），iE-DAP，MDP（図３−Ｂ）をそれぞれ 共刺激させることで，IDO タンパクの発現はさらに増強 した。 ４．歯髄細胞における IDO インヒビターの影響 IFN-γ 刺激を行った歯髄細胞に IDO のインヒビターで あるMT を加えることで，CXCL10産生の低下が認めら れた（図４）。IL-6については，IFN-γ 単独刺激では産生 は認められず，MT を加えても，なんら変化は認められ なかった。
ま と め
本研究により，歯髄細胞にPRRs リガンドと IFN-γ を 共刺激させることで，IL-6および CXCL10といった炎症 関連メディエーターの産生が相乗的に増加することが示 された。この結果から，歯髄炎の病態形成および歯髄炎 の進行においてIFN-γ が重要な役割を果たしている可能 性が示された。また，歯髄組織におけるIDO 発現，産 生が明らかにされ，IDO が歯髄細胞からの CXCL10 産 図２ 歯髄組織におけるIDO 陽性細胞の局在 Ａ：炎症歯髄組織 Ｂ：炎症歯髄組織における陰性コントロールを用 いた染色像 Ｃ：正常歯髄組織 Ｄ：正常歯髄組織における陰性コントロールを用 いた染色像 歯髄組織よりパラフィン包埋切片を作成し，IDO の歯髄炎病変部における局在を免疫組織化学的に 検討した。臨床的炎症歯髄組織にIDO の発現が 認められ，染色された細胞は形態的にリンパ球や マクロファージなどの免疫細胞を中心に，一部歯 髄細胞が染色されている像が確認された（Ａ）。 なお，正常歯髄組織においては，陽性細胞はほと んど確認されなかった（Ｃ）。また，抗IDO 抗体 と同じ陰性のコントロール抗体を１次抗体とした 場合，炎症歯髄組織，正常歯髄組織ともに特異的 な染色は認められなかった（Ｂ，Ｄ）。 図３ 歯髄細胞におけるIDO タンパクの発現 歯髄細胞におけるIDO 発現および PRRs リガン ド刺激した歯髄細胞におけるIDO 発現の変化を 検討するため，培養歯髄細胞にてIDO タンパク の発現をウエスタンブロッティングにて解析し た。IFN-γ で刺激を行わなかった歯髄細胞につ いては，IDO タンパクの発現は認められなかっ た。IFN-γ 単独刺激を行った歯髄細胞において， IDO タンパクの発現が認められ，さらに IFN-γ と Pam3CSK4，LPS（Ａ），iE-DAP，MDP（Ｂ）を それぞれ共刺激させることで，IDO タンパクの発 現はさらに増強した。生に関与している可能性が示された。これらの事実から IFN-γ によって誘導された IDO が歯髄細胞をさらに刺激 し，炎症性サイトカインの産生および発現を誘導するこ とにより，歯髄炎の病態形成に関与していることが示唆 された。
結 論
IFN-γ が歯髄細胞の IDO 発現や IL-6 CXCL10産生に影 響を与えていることが明らかとなり，IFN-γ が歯髄炎に おける歯髄細胞の生体反応において重要な役割を果たし ていることが示唆された。
謝 辞
稿を終えるにあたり，終始御指導，御高閲を賜った歯 科保存学分野 松尾敬志教授に深甚なる謝辞を表しま すとともに，直接御指導と御助言を戴いた歯科保存学 分野 中西 正講師に厚く御礼申し上げます。最後に， 数々の御教示と御助言を戴いた歯科保存学講座の諸先生 方に深謝致します。参 考 文 献
１） 前田勝正，相田宜利： 歯髄・根尖性歯周組織と免 疫学 ．エンドドンティクス 21．須田英明，戸田忠 夫，恵比寿繁之，西川博文，林 善彦，前田勝正編． 第１版．京都，永末書店，2000，87-89．２） Simon J H S: Periapical Pathology . Pathways of the Pulp. Cohen S and Burns R C ed. 7th ed. Saint Louis, Mosby, 1998, 425-462. ３） 石橋眞澄： 歯髄の保存的療法 ．歯内療法学．石橋 図４ 歯髄細胞におけるIDO インヒビターの影響 IFN-γ 刺激を行った歯髄細胞に IDO のインヒビ ターであるMT を加えることで，CXCL10産生の 低下が認められた。 眞澄編．第１版．京都，永末書店，1986，128-137． ４） 中村恭政： 歯髄の保存療法 ．歯内療法学．青野正 男，岡田 宏，岡本 莫，長田 保，川崎孝一，砂 田今男，中村治郎，中村恭政，西川博文，西塚忠義， 福地芳義，堀内 博，松尾 繁，松本光吉，向山嘉 幸，安田英一，山本博武編．第３版．京都，永末書 店，1983，105-123．
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