早稲田大学大学院 先進理工学研究科
博 士 論 文 概 要
論 文 題 目
DNA 鎖間の架橋修復に働く
FANCI-FANCD2 複合体の機能解析
Functional studies of DNA crosslink repair proteins, FANCI-FANCD2 complex
申 請 者
佐藤 浩一
Koichi SATO
電気・情報生命専攻 構造生物学研究
2012 年 11 月
No.1
生 物 の 遺 伝 情 報 を 担 う D N A は 、 紫 外 線 や 放 射 線 、 更 に は 細 胞 内 代 謝 な ど に よ り 絶 え ず 損 傷 を 受 け て い る 。D N A 損 傷 が 修 復 さ れ る こ と な く 蓄 積 す る と 、細 胞 に 機 能 障 害 が 起 こ り 、 細 胞 死 や 細 胞 の が ん 化 が 引 き 起 こ さ れ る 。 そ の た め D N A 損 傷 は 正 確 か つ 速 や か に 修 復 さ れ る 必 要 が あ る が 、 生 物 は D N A 損 傷 へ の 防 御 機 構 の 一 つ と し て D N A 修 復 を 進 化 さ せ て き た 。こ れ ま で の 研 究 で 、生 物 が 多 様 な D N A 損 傷 に 応 じ た 多 様 な D N A 修 復 機 構 を 有 し 、 そ の 修 復 機 構 の 多 く は 生 物 種 間 で 保 存 さ れ て い る こ と が 分 か っ て き た 。D N A 損 傷 の 中 で も D N A 鎖 間 架 橋 （D N A i n t e r s t r a n d c r o s s l i n k ; 以 下 I C L） は 細 胞 に と っ て 特 に 脅 威 と な る 。I C L は D N A の 両 ス ト ラ ン ド が 共 有 結 合 で 連 結 さ れ る D N A 損 傷 で あ り 、 細 胞 が 機 能 す る 上 で 必 要 不 可 欠 な 転 写 や D N A 複 製 を 、 二 重 鎖 の 開 裂 を 妨 げ る こ と に よ り 強 く 阻 害 す る た め で あ る 。 こ の 損 傷 の 細 胞 毒 性 の 強 さ は 、 大 腸 菌 や 酵 母 で は 1 個 の 、 ま た 哺 乳 類 細 胞 で は 4 0 個 の I C L が ゲ ノ ム に 蓄 積 す る だ け で 致 死 と な る こ と か ら も 分 か る 。I C L の 強 い 細 胞 毒 性 は 、 抗 が ん 剤 と し て 臨 床 応 用 さ れ て い る が 、 細 胞 内 代 謝 に よ っ て も I C L は 容 易 に 生 じ る 。特 に 脂 質 や ア ル コ ー ル の 細 胞 内 代 謝 の 過 程 で 生 じ る ア ル デ ヒ ド は 効 率 的 に D N A を 架 橋 し 、I C L を 引 き 起 こ す こ と が 明 ら か に さ れ て い る 。 ヒ ト に お い て は こ う し た 要 因 に よ り 1 細 胞 あ た り 1 日 1 0 個 の I C L が 生 じ る が 、 細 胞 毒 性 の 極 め て 強 い I C L が 形 成 さ れ て も 細 胞 が 生 存 で き る の は 、 細 胞 が I C L を 修 復 す る 機 構 を 有 し て い る た め で あ る 。
こ れ ま で に I C L は 、 主 と し て F a n c o n i a n e m i a（ 以 下 F A） 経 路 に よ り 修 復 さ れ る こ と が 明 ら か に さ れ て き た 。F A は 非 常 に 稀 な 小 児 性 の 劣 勢 遺 伝 性 疾 患 で あ り 、 患 者 共 通 の 臨 床 症 状 と し て 骨 髄 不 全 、高 発 が ん 、更 に は 骨 格 形 成 異 常 が み ら れ る 。 F A 患 者 細 胞 は 染 色 体 が 不 安 定 で あ り 、 染 色 体 の 断 裂 や 転 座 が み ら れ る 。 更 に 患 者 細 胞 を D N A 鎖 間 架 橋 剤 で 処 理 す る と 、 染 色 体 の 断 裂 や 、 染 色 体 が 放 射 状 に 連 結 し た 特 徴 的 な 構 造 体 が 高 頻 度 で 観 察 さ れ る よ う に な る 。 以 上 の よ う に F A 患 者 細 胞 が I C L へ 著 し く 高 い 感 受 性 を 示 す こ と は 、F A 原 因 遺 伝 子 産 物 が I C L へ の 応 答 お よ び そ の 修 復 に お い て 重 要 な 機 能 を 有 し て い る こ と を 示 し て い る 。F A に は 複 数 の 遺 伝 的 相 補 性 群 が 存 在 し 、 現 在 ま で に 1 5 個 の 原 因 遺 伝 子 が 同 定 さ れ て い る 。 原 因 遺 伝 子 は そ れ ぞ れ F A N C A、- B、- C、- D 1、- D 2、- E、- F、- G、- I、- J、 - L、- M、- N、- O、- P と 名 付 け ら れ て お り 、 い ず れ の 遺 伝 子 が 欠 損 し て も 同 様 の 表 現 型 が み ら れ る た め 、こ れ ら 1 5 個 の 遺 伝 子 産 物 は 同 一 の F A 経 路 で 協 同 的 に 機 能 し て い る と 考 え ら れ て い る 。 実 際 に こ の 経 路 が 不 活 性 化 さ れ る と 、I C L が 修 復 さ れ な く な る こ と が 明 ら か に な っ て い る 。 こ れ ま で の 知 見 か ら 、F A 経 路 に よ る I C L 修 復 は 以 下 の 過 程 に 従 っ て 進 行 す る と 考 え ら れ て い る 。S 期 に D N A 複 製 装 置 で あ る レ プ リ ソ ー ム が I C L に 衝 突 す る と 、 二 重 鎖 D N A を 開 裂 で き な い た め に そ の 進 行 が 停 止 す る 。 複 製 フ ォ ー ク が 停 止 す る と 、8 個 の F A 原 因 遺 伝 子 産 物 か ら な る 巨 大 な F A コ ア 複 合 体 が 停 止 し た 複 製 フ ォ ー ク に 集 積 し 、 も う 一 つ の F A 原 因 遺 伝 子 産 物 複 合 体 で あ る F A N C I - F A N C D 2 複 合 体 （ 以 下 I D 複 合 体 ） の 両 サ ブ
ユ ニ ッ ト を モ ノ ユ ビ キ チ ン 化 す る 。 モ ノ ユ ビ キ チ ン 化 さ れ た I D 複 合 体 は 、 損 傷 箇 所 近 傍 の 染 色 体 領 域 へ 局 在 す る よ う に な る 。損 傷 部 位 へ 集 積 し た I D 複 合 体 は 、 ユ ビ キ チ ン 分 子 を 介 し て ヌ ク レ ア ー ゼ を リ ク ル ー ト し 、そ れ に よ り I C L の 両 側 の D N A 鎖 が 切 断 さ れ 、I C L が 切 り 出 さ れ る 。 そ の 後 、 切 り 出 さ れ た I C L 領 域 を 損 傷 乗 り 越 え ポ リ メ ラ ー ゼ が 合 成 す る こ と で I C L 修 復 が 行 わ れ る 。こ の 修 復 反 応 の 過 程 が 一 部 で も 阻 害 さ れ れ ば 染 色 体 が 不 安 定 化 し 、 高 発 が ん が 引 き 起 こ さ れ る 。 こ の こ と か ら 、F A 経 路 が 典 型 的 な が ん 抑 制 経 路 で あ り 、 染 色 体 の 安 定 維 持 に 必 要 不 可 欠 で あ る こ と が 分 か る 。 し か し 、I C L 修 復 の 詳 細 な メ カ ニ ズ ム に つ い て は 未 だ 明 ら か に な っ て い な い 点 が 多 い 。 こ の 経 路 の 分 子 機 構 を 解 明 す る こ と は 、 が ん の 発 症 機 構 に 大 き な 知 見 を も た ら す だ け で な く 、 が ん や F A 治 療 に 対 し て も 多 大 な 貢 献 が 期 待 で き る た め 、 極 め て 重 要 で あ る 。
F A 経 路 の D N A 修 復 反 応 は 、I D 複 合 体 が モ ノ ユ ビ キ チ ン 化 さ れ る こ と で 開 始 さ れ る 。 し た が っ て 、I D 複 合 体 の モ ノ ユ ビ キ チ ン 化 反 応 は F A 経 路 の 中 で 特 に 重 要 で あ る 。 ま た 、 モ ノ ユ ビ キ チ ン 化 さ れ た I D 複 合 体 は ヌ ク レ ア ー ゼ の リ ク ル ー ト だ け で な く 、D N A 修 復 に 関 与 す る 様 々 な 因 子 と 相 互 作 用 す る こ と が 分 か っ て い る 。 こ れ ら の こ と か ら 、I D 複 合 体 は I C L 修 復 の 中 心 的 役 割 を 担 っ て い る と 考 え ら れ て き た が 、I D 複 合 体 が ど の よ う に し て モ ノ ユ ビ キ チ ン 化 さ れ 、染 色 体 に 集 積 し 、そ し て ど の よ う な メ カ ニ ズ ム よ っ て I C L 修 復 反 応 を 触 媒 す る の か は 未 だ 明 ら か に な っ て い な い 。 そ こ で 本 研 究 で は 、I C L 修 復 で 中 心 的 役 割 を 担 う I D 複 合 体 に 着 目 し 、I D 複 合 体 の モ ノ ユ ビ キ チ ン 化 の 反 応 機 構 、 更 に は I D 複 合 体 の 機 能 の 解 明 を 目 的 と し て 、 生 化 学 的 及 び 細 胞 生 物 学 的 解 析 を 行 っ た 。 具 体 的 に は 、 ま ず I D 複 合 体 の モ ノ ユ ビ キ チ ン 化 機 構 を 解 明 す る た め に 、そ の モ ノ ユ ビ キ チ ン 化 反 応 に 必 要 な 、E 2 酵 素 （U B E 2 T）、E 3 酵 素 （F A N C L）、 そ し て 基 質 で あ る F A N C I、 F A N C D 2 を リ コ ン ビ ナ ン ト タ ン パ ク 質 と し て 大 腸 菌 内 で 発 現 さ せ 、高 純 度 に 精 製 す る 系 を 確 立 し た 。次 に 精 製 し た タ ン パ ク 質 を 用 い て 、I D 複 合 体 の モ ノ ユ ビ キ チ ン 化 反 応 を 試 験 管 内 で 再 構 成 し た 。 こ の 反 応 系 を 用 い て 、F A N C D 2 と F A N C I の モ ノ ユ ビ キ チ ン 化 反 応 に 必 要 な 条 件 、 更 に は 因 子 の 探 索 を 行 っ た 。 こ れ ら の 解 析 を 踏 ま え 、I D 複 合 体 の モ ノ ユ ビ キ チ ン 化 機 構 、 更 に は I D 複 合 体 の ク ロ マ チ ン 集 積 メ カ ニ ズ ム を 考 察 し た 。 次 に 損 傷 部 位 へ 集 積 し た I D 複 合 体 の 機 能 を 明 ら か に す る た め に 、I D 複 合 体 が 染 色 体 構 造（ ク ロ マ チ ン ）に 及 ぼ す 影 響 を 調 べ た 。ま ず 、 F A N C D 2 が ク ロ マ チ ン 構 成 因 子 で あ る コ ア ヒ ス ト ン と 相 互 作 用 す る こ と を 生 化 学 的 手 法 に よ り 明 ら か に し た 。 次 に 、F A N C D 2 が 損 傷 部 位 の コ ア ヒ ス ト ン に 与 え る 影 響 を 生 化 学 、 細 胞 生 物 学 、 そ し て 遺 伝 学 的 手 法 に よ り 明 ら か に し た 。 更 に 、 こ の F A N C D 2 と ク ロ マ チ ン と の 関 係 に 、F A N C I が 与 え る 影 響 を 生 化 学 的 に 解 析 し た 。 こ れ ら の 結 果 を も と に 、I D 複 合 体 が 損 傷 部 位 に 集 積 し た 後 、 ど の よ う に し て I C L 修 復 に 寄 与 す る の か を 考 察 し た 。
本 論 文 は 四 章 で 構 成 さ れ る 。 第 一 章 は 序 論 で あ り 、I C L、F A、 更 に は F A 経 路
No.3
に つ い て こ れ ま で の 研 究 報 告 に 基 づ い て 詳 述 す る 。 更 に 、 本 研 究 の 背 景 と 概 要 に つ い て 述 べ 、 当 該 分 野 に お け る 本 論 文 の 意 義 を 示 す 。 第 二 章 で は 、I D 複 合 体 、 特 に F A N C D 2 の モ ノ ユ ビ キ チ ン 化 機 構 の 解 析 に 主 眼 を 置 い て 記 述 す る 。ま ず 一 般 的 な ユ ビ キ チ ン 化 反 応 に つ い て 記 述 し 、 そ の 後 F A 経 路 の モ ノ ユ ビ キ チ ン 化 反 応 に つ い て こ れ ま で の 研 究 報 告 に 基 づ い て 詳 述 す る 。 次 に 本 研 究 で 新 た に 確 立 し た F A N C D 2、F A N C I、U B E 2 T、F A N C L を リ コ ン ビ ナ ン ト タ ン パ ク 質 と し て 発 現 ・ 精 製 す る 方 法 に つ い て 記 述 す る 。 そ の 後 、F A N C D 2、F A N C I の 試 験 管 内 モ ノ ユ ビ キ チ ン 化 反 応 を は じ め と し た 生 化 学 的 解 析 の 手 法 を 記 述 す る 。 続 い て 、 こ れ ら の 精 製 タ ン パ ク 質 を 用 い た 生 化 学 的 解 析 の 結 果 を 示 す 。 ま ず 、U B E 2 T、F A N C L、 F A N C D 2 及 び F A N C I を 用 い て 、 試 験 管 内 で モ ノ ユ ビ キ チ ン 化 反 応 を 行 っ た 。 そ の 結 果 、F A N C D 2 の 部 位 特 異 的 な モ ノ ユ ビ キ チ ン 化 は 、F A N C I と 適 切 な 複 合 体 を 形 成 し た 際 に の み 行 わ れ る こ と が 明 ら か に な っ た 。 更 に 、I D 複 合 体 が D N A に 結 合 し た 際 に 、F A N C D 2 の モ ノ ユ ビ キ チ ン 化 が 著 し く 活 性 化 さ れ る こ と を 発 見 し た 。 こ の 結 果 か ら 、D N A が F A N C D 2 の モ ノ ユ ビ キ チ ン 化 反 応 に お け る 重 要 な 因 子 で あ る こ と が 明 ら か に な っ た 。こ れ ら の 結 果 を も と に 、I D 複 合 体 の モ ノ ユ ビ キ チ ン 化 機 構 を 考 察 す る 。 第 三 章 で は 、 ク ロ マ チ ン に お け る I D 複 合 体 の 機 能 解 析 に つ い て 記 述 す る 。 ま ず 、 こ れ ま で の 研 究 に よ り 提 唱 さ れ て い る I D 複 合 体 の 機 能 仮 説 に つ い て 記 述 す る 。 次 に 、 コ ア ヒ ス ト ン の 精 製 を は じ め と す る タ ン パ ク 質 の 精 製 、I D 複 合 体 の 生 化 学 的 解 析 、 細 胞 生 物 学 的 解 析 、 及 び 遺 伝 学 的 解 析 の 手 法 に つ い て 記 述 す る 。 そ の 後 、 こ れ ら の 解 析 結 果 を 詳 述 す る 。 本 研 究 で は 、 ま ず F A N C D 2 と コ ア ヒ ス ト ン で あ る h i s t o n e H 3 / H 4 複 合 体 が 相 互 作 用 す る こ と を 発 見 し た 。 そ し て 生 化 学 的 解 析 に よ り 、F A N C D 2 が コ ア ヒ ス ト ン を D N A 上 へ と ア セ ン ブ リ ー す る ヒ ス ト ン シ ャ ペ ロ ン 活 性 を 有 す こ と を 見 い だ し た 。 次 に 、 こ の F A N C D 2 の ヒ ス ト ン シ ャ ペ ロ ン 活 性 を 生 細 胞 内 に お い て 検 証 す る た め に 、 h i s t o n e H 3 の 動 態 解 析 を 行 っ た 。 そ の 結 果 、F A N C D 2 が ノ ッ ク ダ ウ ン さ れ た 細 胞 で は 、h i s t o n e H 3 の 動 態 が 低 下 す る こ と が 明 ら か に な っ た 。 次 に F A N C D 2 と h i s t o n e H 3 / H 4 複 合 体 と の 相 互 作 用 は F A N C D 2 の C 末 端 領 域 で 行 わ れ る こ と を 明 ら か に し た 。 更 に 、F A 患 者 由 来 の F A N C D 2 変 異 体 で は ヒ ス ト ン シ ャ ペ ロ ン 活 性 が 低 下 し て お り 、そ の 変 異 体 を 発 現 し た 細 胞 は I C L 修 復 に 部 分 的 な 欠 損 を 示 す こ と が 分 か っ た 。こ れ ら の こ と か ら 、本 研 究 で 明 ら か に し た F A N C D 2 の ヒ ス ト ン シ ャ ペ ロ ン 活 性 は 、I C L 修 復 に 重 要 で あ る こ と が 考 え ら れ た 。 第 四 章 で は 、 第 二 章 、 第 三 章 で 示 し た 研 究 結 果 を 総 括 し 、I D 複 合 体 の ク ロ マ チ ン 集 積 の 機 構 、I D 複 合 体 の I C L 修 復 に お け る 機 能 、更 に は I C L 修 復 の 分 子 機 構 を 考 察 し 、今 後 の 展 望 に つ い て 記 述 す る 。
Ｎｏ.1
早稲田大学 博士（理学） 学位申請 研究業績書
氏 名 佐藤 浩一 印
（2012 年 10 月 現在）
種 類 別 題名、 発表・発行掲載誌名、 発表・発行年月、 連名者（申請者含む）
論文 講演
○Koichi Sato, Masamichi Ishiai, Kazue Toda, Satoshi Furukoshi, Akihisa Osakabe, Hiroaki Tachiwana, Yoshimasa Takizawa, Wataru Kagawa, Hiroyuki Kitao, Naoshi Dohmae, Chikashi Obuse, Hiroshi Kimura, Minoru Takata, Hitoshi Kurumizaka
Histone chaperone activity of Fanconi anemia proteins, FANCD2 and FANCI, is required for DNA crosslink repair
The EMBO Journal, vol. 31, pp3524-3536 (2012 Jul.)
○Koichi Sato, Kazue Toda, Masamichi Ishiai, Minoru Takata, Hitoshi Kurumizaka DNA robustly stimulates FANCD2 monoubiquitylation in the complex with FANCI Nucleic Acids Research, vol. 40, pp4553-4561 (2012 May)
学会発表
・国際学会（ポスター発表）
○Koichi Sato, Masamichi Ishiai, Kazue Toda, Satoshi Furukoshi, Akihisa Osakabe, Hiroaki Tachiwana, Yoshimasa Takizawa, Wataru Kagawa, Hiroyuki Kitao, Naoshi Dohmae, Chikashi Obuse, Hiroshi Kimura, Minoru Takata, Hitoshi Kurumizaka
Histone chaperone activity of FANCD2-FANCI complex, the key proteins for the Fanconi anemia pathway
23rd Annual Fanconi Anemia Research Fund Scientific Symposium, Barcelona, Spain, 2011 Oct.
○Koichi Sato, Masamichi Ishiai, Kazue Toda, Satoshi Furukoshi, Akihisa Osakabe, Hiroaki Tachiwana, Naoshi Dohmae, Chikashi Obuse, Hiroshi Kimura, Minoru Takata, Hitoshi Kurumizaka
Functional analyses of the Fanconi anemia protein, FANCD2
International Symposium Physicochemical Field for Genetic Activities, Awaji, Japan, 2011 Jan.
・国内学会（口頭およびポスター発表）
○Koichi Sato, Masamichi Ishiai, Kazue Toda, Satoshi Furukoshi, Akihisa Osakabe, Hiroaki Tachiwana, Yoshimasa Takizawa, Wataru Kagawa, Hiroyuki Kitao, Naoshi Dohmae, Chikashi Obuse, Hiroshi Kimura, Minoru Takata, Hitoshi Kurumizaka
Histone chaperone activity of the FANCI-FANCD2 complex and its importance in repair of inter-strand DNA crosslinks by the Fanconi anemia pathway
第34回日本分子生物学会年会、横浜、2011年12月
・国内学会（口頭発表）
○Koichi Sato, Masamichi Ishiai, Minoru Takata, Hitoshi Kurumizaka
Histone chaperone activity of FANCD2 plays an important role in the Fanconi anemia pathway 第71回日本癌学会学術総会、札幌、2012年9月
○佐藤浩一、戸田和江、石合正道、高田穣、胡桃坂仁志
FANCD2-FANCI複合体のモノユビキチン化機構
第29回染色体ワークショップ、仙台、2012年1月
Ｎｏ.2
早稲田大学 博士（理学） 学位申請 研究業績書
種 類 別 題名、 発表・発行掲載誌名、 発表・発行年月、 連名者（申請者含む）
その他
○佐藤 浩一、戸田 和江、古越 聡、越阪部 晃永、立和名 博昭、堂前 直、石合 正道、
小布施 力史、木村 宏、高田 穣、胡桃坂 仁志
DNA組換え修復に重要なFANCD2及びFANCIの生化学的機能解析 第20回DNA複製・組換え・修復ワークショップ、彦根、2009年11月
○佐藤 浩一、木村 宏、越阪部 晃永、立和名 博昭、滝沢 由政、小布施 力史、高田 穣、
胡桃坂 仁志
Fanconi貧血原因遺伝子FANCD2の機能解析
第26回染色体ワークショップ、姫路、2009年1月
・国内学会（ポスター発表）
○佐藤 浩一、戸田 和江、古越 聡、越阪部 晃永、立和名 博昭、香川 亘、堂前 直、石 合 正道、小布施 力史、木村 宏、高田 穣、胡桃坂 仁志
ファンコニ貧血原因遺伝子産物FANCD2およびFANCIの複合体形成と機能解析
第 33 回日本分子生物学会年会・第 83 回日本生化学会大会合同大会、神戸、2010 年 12 月
○佐藤 浩一、石合 正道、戸田 和江、古越 聡、越阪部 晃永、立和名 博昭、堂前 直、
小布施 力史、木村 宏、高田 穣、胡桃坂 仁志
Fanconi貧血原因遺伝子FANCD2及びFANCIの機能解析
第９回核ダイナミクス研究会、修善寺、2010年5月
○佐藤 浩一、戸田 和江、古越 聡、越阪部 晃永、立和名 博昭、堂前 直、石合 正道、
小布施 力史、木村 宏、高田 穣、胡桃坂 仁志
Fanconi貧血原因遺伝子FANCD2およびFANCIの生化学的機能解析
第32回分子生物学会年会、横浜、2009年12月
○佐藤 浩一、木村 宏、越阪部 晃永、立和名 博昭、滝沢 由政、北尾 洋之、小布施 力 史、高田 穣、胡桃坂 仁志
Fanconi貧血相補性群D2原因遺伝子，FANCD2の生化学的解析
第 31 回日本分子生物学会年会・第 81 回日本生化学会大会合同大会、神戸、2008 年 12 月
＜論文＞
Tomoko Shigechi, Junya Tomida, Koichi Sato, Masahiko Kobayashi, John K. Eykelenboom, Fabio Pessina, Yanbin Zhang, Emi Uchida, Masamichi Ishiai, Noel F. Lowndes, Kenichi Yamamoto, Hitoshi Kurumizaka, Yoshihiko Maehara, and Minoru Takata
ATR-ATRIP kinase complex triggers activation of the Fanconi anemia DNA repair pathway Cancer Research, vol.72, pp1149-1156 (2012 Mar.)
Nobuko Matsushita, Yujiro Endo, Koichi Sato, Hitoshi Kurumizaka, Takayuki Yamashita,Minoru Takata, Shigeru Yanagi
Direct Inhibition of TNF-α Promoter Activity by Fanconi Anemia Protein FANCD2 PLoS One, vol.6, e23324 (2011 Aug.)
