博 士 論 文 概 要
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(2) 生命を維持するために必須となる酸素は、肺で赤血球中のヘモグロビンに結合 し 、 血 液 循 環 に よ り 全 身 の 細 胞 に 供 給 さ れ る 。 ヒ ト の 末 梢 血 に は 約 25 兆 個 の 赤 血 球 が 存 在 す る 。 赤 血 球 の 産 生 量 は 1 日 に 約 2000 億 個 で あ り 、 1 日 に 同 数 が 破 壊されて末梢赤血球数が一定に保たれるよう厳密に制御されている。哺乳類の赤 血球産生（造血）の仕組みは、マウスがモデル動物の中心となって膨大な知見が 集積されてきた。南極に生息するアイスフィッシュやコオリウオ科の幼生などを 例外として、赤血球は脊椎動物に共通に備わっている。組織・細胞形態学的な観 察によって、血球産生を担う臓器（造血器、造血巣）は、生物種によって、ある いは発生時期によって異なることが知られている。このような造血を担う組織環 境の特性や、末梢血球数調節の組織環境動態については不明な点が多い。本研究 は 無 尾 両 生 類 ア フ リ カ ツ メ ガ エ ル （ Xenopus laevis） を 研 究 対 象 と し 、 組 織 構 造 の大規模なリモデリングを伴う変態期の肝臓において、赤血球前駆細胞の特性を 解析した。また、赤血球造血巣である成体肝臓における成熟赤血球と赤血球前駆 細胞の局在を組織化学的手法により明らかにした。さらに急性溶血性貧血及び急 性失血性貧血時における赤血球系細胞の質的・量的動態を詳細に解析した。 第 1 章では、脊椎動物の造血制御について概説している。特に各種動物の赤血 球造血における共通点と相違点、すなわち普遍性と多様性について述べ，また一 個体内で造血巣が移行する造血発生や、哺乳類における髄外造血の知見を解説し ている。本研究を進める上で必要となる実験血液学的な基礎解析では、血球系細 胞の同定法と計数法ならびに定量法の確立が重要であることや、哺乳類の末梢赤 血球数調節時における造血巣内の赤血球系細胞の局在や量的変動の捉え方を示し ている。以上を踏まえ、アフリカツメガエル肝臓における赤血球造血巣の量的変 動の解析に至った経緯を説明し、本研究の位置づけを提示している。 第 2 章では、変態期における赤血球前駆細胞の性状について示している。電子 顕微鏡による観察やフローサイトメトリー法による解析から、変態期以前のアフ リカツメガエル幼生の肝臓に血液細胞が多く存在することが知られており、幼生 期においても肝臓は造血巣の一つとして考えられている。哺乳類では胎子型肝臓 から成体型肝臓へ変化するにつれて造血巣は骨髄へ移行する。これに対し、アフ リカツメガエルでは肝臓の構造が変化するにも関わらず造血能を保持し続ける。 変態期肝臓の組織環境や肝臓に含まれる血液細胞の数や性質を理解することは、 哺乳類における造血巣移行の仕組みを理解する上で重要である。 変態初期 （ Nieuwkoop と Faber に よ る 発 生 段 階 56； NF56） 及 び 変 態 後 期 （ NF66） の 肝 臓 細 胞 を ア フ リ カ ツ メ ガ エ ル エ リ ス ロ ポ エ チ ン （ xlEPO） 存 在 下 で 培 養 し 、 経 時 的に細胞数と細胞集団の組成、および遺伝子発現を評価した。その結果、両発生 段階と も培 養開 始 5 日目に 芽球 様の 細 胞数が 最大 値に 達 し、ヘ モグ ロビ ン 陽性の 細 胞 数 は 6 日 か ら 7 日 後 に 最 大 値 と な っ た 。赤 血 球 前 駆 細 胞 に 発 現 す る ア フ リ カ ツ メ ガ エ ル E P O 受 容 体（ x l E P O R ）、 x l G ATA 1 ， x l G ATA 2 の m R N A 発 現 解 析 に よ No.1.
(3) り、増加した芽球様の細胞は赤血球前駆細胞であると考えられた。また生合成さ れ た ヘ モ グ ロ ビ ン は 、 NF56 で は 幼 生 型 で あ っ た が NF66 で は 成 体 型 で あ っ た 。 こ れ ら の こ と か ら 、ア フ リ カ ツ メ ガ エ ル 幼 生 肝 臓 に お い て も xlEPOR 応 答 性 の 赤 血球前駆細胞が存在し、肝臓の組織構造が大きく変化する変態期であっても赤血 球前駆細胞が維持されることが明らかとなった。 第 3 章では、造血巣の組織形態学的特性を概説し、アフリカツメガエルの肝臓 における赤血球系細胞の同定法と計数法について述べている。哺乳類成体の骨髄 造血における至適微小環境は、骨内膜や類洞血管周囲によって形成される。マウ ス 骨 髄 の 有 核 細 胞 の う ち 、 約 7 % が 赤 血 球 前 駆 細 胞 で あ る 。 受 精 後 11 日 か ら 1 7 日 の マ ウ ス 胎 子 肝 臓 で は 、肝 臓 中 の 約 30%か ら 70%が 血 球 系 細 胞 で あ る 。こ の よ うな哺乳類の大腿骨の断面は赤色髄を呈する。しかしアフリカツメガエル成体の 骨髄は脂肪で満たされ黄色髄を呈し、顕微鏡下では少数の白血球系細胞のみが認 められるに過ぎず，主要な造血巣は肝臓である。このことはアフリカツメガエル 成体の肝臓では、哺乳類骨髄とは異なる組織環境で造血が制御されると考えられ た 。 肝 臓 は 、 肝 実 質 細 胞 や 類 洞 内 皮 細 胞 、 胆 管 上 皮 細 胞 、 ク ッ パ ―細 胞 、 星 細 胞 などの細胞で構成される。しかしマウスでみられる一層の肝実質細胞からなる肝 細胞索や類洞の構造は、アフリカツメガエルでは不明瞭であり、メラノマクロフ ァージが存在するなどの相違点がある。そこでアフリカツメガエル成体の肝臓の 赤 血 球 系 細 胞 の 動 態 を 明 ら か に す る こ と に し た 。 o-ジ ア ニ シ ジ ン に よ る ヘ モ グ ロ ビ ン 染 色 と 、 xlEPOR を 認 識 す る ウ サ ギ 抗 xlEPOR ポ リ ク ロ ー ナ ル 抗 体 に よ る 免 疫染色を用いて、アフリカツメガエル肝臓の成熟赤血球及び赤血球前駆細胞を同 定 し 、 肝 臓 に 含 ま れ る 数 を 計 数 し た 。 そ の 結 果 、 肝 臓 の 全 有 核 細 胞 の 約 25% が. x l E P O R 発 現 赤 血 球 前 駆 細 胞 で あ っ た 。マ ウ ス 骨 髄 と 比 較 す る と 約 3 . 7 倍 で あ り 、 赤血球造血の組織内動態が大きく異なる可能性が示された。 第 4 章では、各種の貧血モデルの作出と、それらの比較について示している。 溶 血 剤 フ ェ ニ ル ヒ ド ラ ジ ン （ PHZ） を 実 験 動 物 に 投 与 す る と 、 赤 血 球 の 酵 素 や 膜 蛋白質、リン脂質、ヘモグロビンの酸化を起し、急性溶血性貧血を引き起こす。 こ の よ う な 貧 血 の ア フ リ カ ツ メ ガ エ ル 成 体 の 肝 臓 の xlEPOR 陽 性 赤 血 球 前 駆 細 胞 の 数 は 、 正 常 個 体 の 約 2.4 倍 に 増 加 し た 。 し か し 、 PHZ に よ っ て 肝 臓 、 脾 臓 、 腎 臓 に 組 織 傷 害 が 発 生 す る 可 能 性 や 、肝 臓 や 脾 臓 に お け る P H Z に よ り 酸 化 し た 赤 血 球のマクロファージ貪食によって、赤血球産生の真の動態を捉えきれない危険性 があった。そこで新たに、瀉血、すなわち急性失血よる貧血モデルを作出した。 急性失血性貧血モデルの肝臓を観察すると、急性溶血性貧血モデルでみられる損 傷 赤 血 球 は 著 し く 減 少 し 、 xlEPOR 陽 性 赤 血 球 前 駆 細 胞 の 増 加 は 約 2.2 倍 で あ っ た 。 さ ら に 、 末 梢 赤 血 球 数 と 肝 臓 内 の 成 熟 赤 血 球 数 及 び xlEPOR 陽 性 赤 血 球 前 駆 細胞数の相関を解析した。その結果、アフリカツメガエル肝臓に存在する成熟赤 血 球 は 、末 梢 赤 血 球 数 と 正 の 相 関 を 示 し 、赤 血 球 前 駆 細 胞 数 は 負 の 相 関 を 示 し た 。 No.2.
(4) これらの結果より、正常時と各種の貧血との比較において、末梢循環における成 熟赤血球数と、造血巣における赤血球産生の量的解析を進めることができた。 第 5 章では、成体肝臓における赤血球産生の動態 と前駆細胞の組織内局在につ い て 示 し て い る 。 核 酸 に 取 り 込 ま れ る 蛍 光 物 質 5- ブ ロ モ -2’- デ オ キ シ ウ リ ジ ン （ BrdU） を 用 い て 急 性 溶 血 性 貧 血 及 び 急 性 失 血 性 貧 血 モ デ ル 肝 臓 で の 24 時 間 以 内 の 細 胞 増 殖 を 解 析 し た 。 両 モ デ ル と も 細 胞 増 殖 が 正 常 時 に 比 べ て 約 10 倍 亢 進 し た 。 抗 BrdU 抗 体 と 抗 xlEPOR 抗 体 の 二 重 免 疫 染 色 の 結 果 、 肝 臓 内 の 全 BrdU 陽 性 細 胞 の う ち 60%以 上 が xlEPOR 陽 性 で あ り ， 末 梢 赤 血 球 減 少 の 後 、 肝 臓 の. xlEPOR 陽 性 赤 血 球 前 駆 細 胞 は 増 殖 し た こ と が 判 明 し た 。 赤 血 球 前 駆 細 胞 の 肝 臓 内局在を光学顕微鏡および透過型電子顕微鏡を用いて観察したところ、検出され た x l E P O R 陽 性 細 胞 の う ち 約 8 0 % が 類 洞 の 内 壁 に 隣 接 し て い た 。こ の よ う な 肝 臓 の類洞内壁では、接着分子マーカーであるビンキュリンの発現が亢進していた。 さ ら に in situ ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン 法 に よ っ て 、 類 洞 内 皮 細 胞 に は 哺 乳 類 の 赤 血 球 造 血 に 必 須 な 接 着 分 子 v c a m - 1 、i n t e g r i n 5 、m a e a の 発 現 も 見 ら れ た 。し たがって接着分子を介して類洞内皮細胞が足場として機能していると考えられた。 類 洞 の 内 壁 は xlEPO 産 生 細 胞 で あ る 肝 実 質 細 胞 と 組 織 形 態 学 的 に 近 接 し て い る 。 以 上 の 結 果 は 、ア フ リ カ ツ メ ガ エ ル 肝 臓 に お け る x l E P O の 傍 分 泌 に よ る 赤 血 球 造 血制御の存在を裏付けた。さらに、赤血球前駆細胞より未熟な段階の造血前駆細 胞 の 検 出 を 行 な っ た 。 細 胞 分 裂 の 頻 度 が 少 な い 特 徴 を も つ 造 血 前 駆 細 胞 （ slow c y c l i n g 細 胞 ）は 、取 り 込 ん だ B r d U を 長 期 間 保 持 す る こ と が 知 ら れ て い る 。B r d U 投 与 後 に 70 日 間 飼 育 を 行 い slow cycling 細 胞 の 検 出 を 行 な っ た 結 果 、 類 洞 の 内 壁 に s l o w c y c l i n g 細 胞 が 検 出 さ れ た 。貧 血 に よ り s l o w c y c l i n g 細 胞 の 分 裂 が 促 さ れたことから、肝臓の類洞内壁に造血前駆細胞が存在する。 第 6 章では、本研究の成果を総括して考察している。本研究はアフリカツメガ エ ル の in vivo モ デ ル を 用 い て 、 循 環 赤 血 球 の 恒 常 性 維 持 に と も な う 赤 血 球 造 血 の質的・量的変動を明らかにするために、造血巣内の赤血球前駆細胞の数と組織 局在の両面から解析を進めた。アフリカツメガエル成体の肝臓は、赤血球が産生 さ れ て 血 液 循 環 に 移 行 す る の と 同 時 に 、 200 日 以 上 も 血 液 を 循 環 し て 寿 命 の 尽 き た赤血球が破壊、代謝される。アフリカツメガエル肝臓は、いわば「細胞の生と 死」が隣り合う現場である。 本研究は、アフリカツメガエルの赤血球前駆細胞が幼生から成体にいたるまで 一貫して肝臓の類洞内壁に局在することを示し，赤血球産生をおこなう肝臓の組 織環境の基本的性質を明らかにした。哺乳類における知見に加え、造血制御の普 遍性と多様性を探求する上で，アフリカツメガエルは極めて有望な造血解析動物 であることを示した。. No.3.
(5) Ｎｏ.1. 早稲田大学 氏 名. 奥井. 武仁. 博士（理学）. 学位申請. 研究業績書. 印 （2016 年 10 月. 種 類 別 論文. 題名，. 発表・発行掲載誌名，. 発表・発行年月，. 現在）. 連名者（申請者含む）. ○. Okui T, Hosozawa S, Kohama S, Fujiyama S, Maekawa S, Muto H, Kato T. Development of erythroid progenitors under erythropoietin stimulation in Xenopus laevis larval liver. Zoolog Sci. 2016（掲載決定：2016 年 9 月 1 日 WEB 公開）. ○. Okui T, Yamamoto Y, Maekawa S, Nagasawa K, Yonezuka Y Aizawa Y, Kato T. Quantification and localization of erythropoietin receptor expressing cells in the liver of Xenopus laevis. Cell Tissue Res. 2013 Jul;353(1):153-64. Nagasawa K, Tanizaki Y, Okui T, Watarai A, Ueda S, Kato T. Significant modulation of the hepatic proteome induced by exposure to low temperature in Xenopus laevis. Biol Open. 2013 Aug 23;2(10):1057-69. Maekawa S, Iemura H, Kuramochi Y, Nogawa-Kosaka N, Nishikawa H, Okui T, Aizawa Y, Kato T. Hepatic confinement of newly produced erythrocytes caused by low-temperature exposure in Xenopus laevis. J Exp Biol. 2012 Sep; 215(Pt17):3087-95.. 講演. 奥井武仁，加藤尚志．赤血球減少症ツメガエル肝臓における赤血球産生の動態．第 6 回 日本ツメガエル研究会/首都圏支部会（XCIJ-ALL/MA）研究集会，東京，2012 年 7 月 奥井武仁，小濱聖佳，加藤尚志．アフリカツメガエル肝臓の赤血球造血に関わる接着分 子の発現．第 36 回日本比較内分泌学会大会，東京，2011 年 11 月 奥井武仁，神保杏林，永澤和道，米塚友香，加藤尚志．赤血球造血を支持するアフリカ ツメガエル肝臓の組織微小環境における接着分子の発現．第 82 回日本動物学会大会，旭 川，2011 年 9 月 奥井武仁，加藤尚志．赤血球造血を支持する肝微小環境の探索－両生類からのアプロー チ－．WANCO 研究会，東京，2010 年 11 月 奥井武仁，別府美穂，神保杏林，前川峻，山本雄介，加藤尚志． Localization of Erythroid Progenitors and Their Response to Anemic Stress in Xenopus laevis．第 72 回日本血 液学会，横浜，2010 年 10 月 Takehito Okui， Miho Beppu， Yosuke Mano， Satoka Kohama， Shun Maekawa， Yusuke Yamamoto， Takashi Kato． The production and destruction of erythroids in the liver of Xenopus laevis． International Society for Experimental Hematology 39th Annual Scientific Meeting， Melbourne， Australia， September， 2010 奥井武仁，真野陽介，山本雄介，加藤尚志．貧血時アフリカツメガエル肝臓における赤 血球前駆細胞の局在．第 62 回日本動物学会関東支部大会，筑波，2010 年 3 月.
(6) Ｎｏ.2. 早稲田大学 種 類 別 講演 (つづき). 題名，. 博士（理学）. 学位申請. 発表・発行掲載誌名，. 発表・発行年月，. 研究業績書 連名者（申請者含む）. Takehito Okui， Yusuke Yamamoto， Yoichi Aizawa， Takashi Kato， Morphological analysis of adult hepatic microenvironment for erythropoiesis． American Society of Hematology 51st Annual Meeting， New Orleans， USA， December， 2009， Publication-Only 奥井武仁，前川峻，山本雄介，谷崎祐太，小坂（野川）菜美，會沢洋一，加藤尚志．ア フリカツメガエルの赤血球前駆細胞の組織分布．第 79 回日本動物学会，福岡，2008 年 9 月 奥井武仁，西川裕展，小坂（野川）菜美，前川峻，岩崎麻衣，會沢洋一，加藤尚志．ア フリカツメガエル肝臓における赤血球前駆細胞の同定と局在解析．第 60 回日本動物学会 関東支部，東京，2008 年 3 月 細沢咲湖，奥井武仁，小濱聖佳，佐藤圭，加藤尚志．変態期におけるツメガエル肝臓の 赤血球前駆細胞数の推移．日本動物学会第 85 回仙台大会，仙台，2014 年 9 月 小濱聖佳，奥井武仁，目黒瑞枝，加藤尚志． Dynamics of erythropoiesis in Xenopus larval liver during metamorphosis．第 74 回日本血液学会学術集会，京都，2012 年 10 月 真野陽介，木下紗也香，小濱聖佳，奥井武仁，加藤尚志．アフリカツメガエルの細胞接 着因子 ESAM の構造と発現．第 64 回日本動物学会関東支部大会，東京，2012 年 3 月 小濱聖佳，奥井武仁，横田直樹，加藤尚志．変態に伴うアフリカツメガエル赤血球造血 関連因子の発現と局在解析．第 82 回日本動物学会大会，旭川，2011 年 9 月 小濱聖佳，奥井武仁，加藤尚志．変態期のツメガエル組織における血球関連遺伝子の発 現．第 63 回日本動物学会関東支部大会，東京，2011 年 3 月 武藤洋史，廣瀬崇行，神保杏林，栗城遥，奥井武仁，加藤尚志．ツメガエル肺における エリスロポエチン受容体の発現．第 63 回日本動物学会関東支部大会，東京，2011 年 3 月 真野陽介，奥井武仁，小濱聖佳，前川峻，木下紗也香，谷崎祐太，田原彩香，加藤尚志． アフリカツメガエル造血器における細胞接着因子 ESAM の発現．第 35 回日本比較内分 泌学会大会，静岡，2010 年 11 月 廣瀬崇行，永澤和道，奥井武仁，加藤友啓，須貝龍久，小坂（野川）菜美，加藤尚志． アフリカツメガエルエリスロポエチン遺伝子の定量的発現解析法の最適化．第 62 回日本 動物学会関東支部大会，筑波，2010 年 3 月 別府実穂，奥井武仁，小坂（野川）菜美，會沢洋一，加藤尚志．アフリカツメガエルに おける赤血球系細胞の免疫染色と細胞蛋白質変動の検出．第 80 回日本動物学会大会，静 岡，2009 年 9 月.
(7) Ｎｏ.3. 早稲田大学 種 類 別. 題名，. 博士（理学）. 学位申請. 発表・発行掲載誌名，. 発表・発行年月，. 研究業績書 連名者（申請者含む）. 講演 (つづき). 西川裕展，會沢洋一，野川菜美，上原信明，奥井武仁，加藤尚志．アフリカツメガエル 赤血球前駆細胞に対するモノクローナル抗体の作製及びその単離． 第 78 回日本動物学 会大会，2007 年 9 月. 講演 (招聘). 加藤尚志，前川峻，永澤和道，奥井武仁，谷崎祐太． Experimental exploration on erythropoiesis in aquatic amphibians: a comparative perspective. 第 77 回日本血液学 会学術集会，金沢，2015 年 10 月 Takashi Kato, Kazumichi Nagasawa, Takahito Okui, Yuta Tanizaki, Shun Maekawa. Environmental responses of hematopoiesis in Xenopus laevis. 8th International Symposium on Amphibian and Reptilian Endocrinology and Neurobiology (ISAREN), Okazaki, Japan, November, 2014 小坂（野川）菜美，前川峻，永澤和道，家村仁美，奥井武仁，加藤尚志．両生類に学ぶ ～アフリカツメガエル血球産生のダイナミクス～．第 21 回日本比較免疫学会学術集会， シンポジウム「リンパ球の起源と分化」，神奈川，2009 年 8 月. 講演 (その他). 奥井武仁，永澤和道，目黒瑞枝，吉岡祐亮，前川峻，小坂（野川）菜美，上田しのぶ， 加藤尚志．造血の分子制御機構：アフリカツメガエル肝臓における血球産生．2009 年度 ハイテク成果シンポジウム，東京，2009 年 8 月 Ayaka Tahara， Yuta Tanizaki， Takehito Okui， Mizue Meguro， Sayaka Kinoshita， Shun Maekawa，Motoki Yamauchi，Miyako Obuchi-Shimoji，Takako Ishida-Iwata， Yutaka Nagai， Ryota Kuroki， Takashi Kato． Characterization of Xenopus laevis thrombocytic cells stimulated by thrombopoietin in liquid culture， International Society for Experimental Hematology 39th Annual Scientific Meeting， Melbourne， Australia， September， 2010 Tanizaki Y， Nogawa-Kosaka N， Nagasawa K， Tahara A， Maekawa S， Okui T， Kato T． Thrombocyte-erythrocyte progenitors identified in African clawed frog Xenopus laevis． 2009 ISEH-Society for Hematology and Stem Cells． Athens， Greece， September， 2009 前川峻，竹下直樹，石井靖則，家村仁美，奥井武仁，藤井十三，小泉博郎，田原彩香， 宗田孝之，加藤尚志．ラインスキャン平面分光装置による非侵襲的なアフリカツメガエ ル血流変動の評価．第 61 回日本動物学会関東支部，埼玉，2009 年 3 月 加藤ゆか，小渕（下地）美也子，目黒瑞江，奥井武仁，會沢洋一，坂本明彦，船津隆， 加藤尚志． Binding characteristics of thrombopoietin and c-Mpl in Xenopus laevis． 第 80 回日本生化学会大会，横浜，2007 年 12 月.
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