感受 性 増強 骨肉腫 細胞 抗 癌剤 併 用 野 型 遺 伝 子 導 入

金 沢 大 学 十 全 医 学 会雑 誌 第1 0 7巻 第6 号 4 93 ^‑ 5 0 3 (1 9 9 8)

野^生型p5 3 遺伝子導入^{とカ フ ェ} イ ^ン併用^による

ヒト骨肉腫細 胞^の抗癌 剤感受性^の増 強

金沢 大 学 医学 部 医 学 科 整 形外 科学 講 座 ( 主 任^: 富田勝 郎 教 授)

毛 利 良 彦

4 9 3

痛 抑 制 遺 伝 子_{♪5 3} ^の状 態が異な る 3種 類^{の ヒ ト}骨 肉腫 細 胞 株に野生型p5 3遺 伝 子を リ ボフ^ェ ク ショ ン法で導入 し, p5 3 蛋 白^の発 現 量, 細 胞 増 殖 能, お よ び シ^スプ ラ チ^ンに よ る殺 細 胞 効 果^の変 化を検 討し た. さ ら に, D N A 修 復 阻 害 物質^{である カ}

フ^ェイ^ン併 用 時の p5 3 蛋白^の発 現 抑 制 効 果と殺 細 胞 効 果 増 強^に与 え^る影 響^についても検 討し た^. 正常p5 3 蛋 白 を 発現 す^{る O S T} 細 胞 株^{で は}, 野 生型_{♪5 3} 遺伝子^の導入前 後^でp5 3蛋 白の発 現 量, 細 胞 増 殖 能, お よ び シスプ ラ チン の殺 細 胞 効 果に変 化は認め ら れなか ^った^･ また, 野 生 塑_{♪5 3} 遺 伝 子 導入前か ら認め ら れ^{て い}た カ^フェ イ^ン併 周 時の p5 3蛋 白^の発 現 抑 制 効 果, な ら び に殺 細 胞 効 果 増 強に関し て変 化は認^{め ら れ な かった.} 変 異 型p53 蛋白 を 党 規 する H O S 細胞 株^{で は}, 野生型 が3遺 伝 子^の導入後に細 胞 増 殖 速 度^の低■_{下 が認め ら れ た が}

, p5 3 蛋 白^の発 現 量, 細 胞 増 殖 能, お よ び シ^スプ ラ チ^{ン の}殺 細 胞 効 果^に変 化^は認^{め ら れ}ず,

さ ら に, カフェ イ^ン併f耶寺の p5 3 蛋 白^の発 現抑 制効 果^{お よ び}殺 細 胞 効 果 増 強^に関し ても変 化は認め ら れなかった^. ♪⁵3 遺 伝 子 が欠 失^し, p5 3蛋 白^の発 現 を 全く 認め ないSa o s2細 胞 株で は, 野 生型P⁵3 遺 伝 子導入後^のSa o s2/p5 3細 胞株に おいて, P5 3蛋白

の党 規が認め ら れ る ようにな り, 細 胞 増 殖 適 度^の低下, お よ び シ^スプラチン の殺 細 胞効 果^の増 強^が認め ら れ た. また, カフ ェ

イ^ン併 用 時の p5 3 蛋 白^の発 現 抑 制 効 果な ら び に殺 細 胞 効 果^の増 強 も認め ら れ た^. さ ら に, Sa o s2/p5 3馴 包株で は Sa o s2細 胞 株 に比^べ, シ^スプ ラ チ^ン単 独 処理時, お よ び カフ ェイ^ン併 用 時^{の い}ずれ に お^いても, タ ^ー ミ ナ^{ル ･} デ オ キ シヌクレオ チ ジル ^･ ト ラ^{ン ス フエ} ラ ^ーゼ加ビ オ ナ^ンーデ オ キ シ ウ リ ジン^ー5^'一三 リン酸^{ニ ック}末 端 標 識 (^{te r min al de o x}yn u cle otidyltr a n sfe r a s e‑^{m ediated}

de o xy^{u r}id in^‑5^'‑tri_pho sphate^‑b iotin nick e nd^‑1abeling,T U N EU 法な ら び に D N A ラ ダ^{ー の}観 察に よりアポ ト^ー シ^ス誘導^の増 強^が 認め ら れ た^･ 以 上の結 果か ら, 正常 型p53 蛋 白^は細 胞 周 期^の調 節^{お よ び シスプ ラ チン}処理時の アポ ト^ー シ^ス誘 導を含む多機 能 な作 用^を有 す^{ること が}確 認さ れ た^･ さ ら に, カフ ェイ^ン併 用 時^のシスプ ラ チンに対 する殺 細 胞 効 果^の増 強に は, 正常p5 3蛋 白

の発 現^が必 要^であること が明ら か と な^った. こ の こと か ら, ♪5 3 遺伝 子^の異常^{のた め}, 化 学 療法^に抵 抗 性 を 示 す^ヒト骨 肉腫 症 例に対し て, 野 生型_{カ ㍊}遺 伝 子 を 用^{い た}遺 伝 子 治 療と カ^{フ ェ}イ^ン併 用 化 学 療 法^{に よ}り, さ ら に抗 癌 剤 感受 性が増 強さ れ る 可能 性が示 唆さ れ た^.

K ey ^{w o r}ds wild^Mtyp^e p5 3,tr a n Sfectio n_,Cisplatin_,C affein e_,hu m a n o ste o s a r c o m a

骨 肉腫は若 年 者^の四肢に発生 し, 悪 性 骨 腫 瘍^の中^で最 も 頻度 が高^い. 従 来は, 発 見と同時^{に 四}肢^の切 断 ^･ 縦 断 術^が行わ れ て おり, 5年生存 率 も2 0 % 以 下 と極めて不 良であった が^{1 )}, 近 年^の 化学療 法^の導入 に伴^い治 療 成 績は飛 躍 的に向上 し た. 最 近で は シスプ ラ チン の術 前 動 脈 内投 与が有 効と さ れ^{2 ) :1 )}, 5年生存 率は 5 0 ^､6 0 % ま で に な^っ ている^{̀1 = )}. し か し な が ら, 2 0 ^､ 3 0 % の骨 肉 腫は抗 癌 剤^に抵 抗 性 を 示^し, そ^の克 服^のた め に は既 存^の抗 癌 剤^の効 果 を 増 強 する ⊥夫や新た な抗 癌 剤^の開発, 発 見が求め ら れ ている.

近年, 痛 抑 制 遺 伝 子^{と し て}注目 さ れ て^い る卵3 遺 伝 子は, 多 く^の悪 性 腫 瘍で そ^の変 異が報 告さ れ て^いる^{7) 8)}. D N A損 傷^{に よ} り 過剰 発 現 す^るp5 3蛋 白^は, D N A 損 傷が軽 度の時に は細 胞 周 期

を G l 期で停^｣としてD N A損 傷^を修 得 す^{る が}, D N A損 傷が高 度 で修復 不能 時に は細 胞をアポ ト^ー シスに誘 導する機能がある ^{佃 .} こ の ようにp5 3 は細 胞 増殖^の調 節^{ヤアポ ト ー シ ス}誘 導^{に おいて} 重 要^な役 割^を担^って お り, p5 3 ^の変 異が悪 惟 腫 瘍^の予後にも 悪 影 響 を 与え る といわ れ ている⁼ . す な わち 抗灘捕りや放 射 線^は膿 瘍 細 胞^{のD N A} 損 傷 を 起^こし, そ^の損 傷が^アポ ト^ー シ^ス性 細 胞 死 をもた らすが^{1 2)}, 悪 性 腫 瘍 細 胞は_p5 3

̲^{の変 異に よ りアポ ト}

ー

シ^スを 回 避^し, 化 学療 法^や放 射 線 療 法^に対し^て抵 抗 惟を有する ようにな^って^いる と考え ら れ て^い る^{1 ユ).} 骨 肉 腫に おいても_p5 3 は高 率に変 異が認め ら れ^‖ト㌧^川)

, ♪5 3 遺 伝 子^の異 常^が予 後^と相 関 す^{る と}言^{わ れ ている1 = 0).} また, ヒト骨 肉腫 細 胞に野生型♪ββ 遺 伝 子 を 導入する と, 細 胞 増 殖は抑 制さ れ, 放射 線 感 受 性^が増

平 成1 0年1 1月1 2 日 受付, 平 成^{1 0}年^{1 2}月^{1 0} 日 受 理

A b br eviatio n s : A ･U･, a ng^Str O m e u ni_t; C D D P ,Cisplatin_, Cis^‑dia m min edichlo r oplatin u m; G A P D H_, gly^{c e r a}ldeh_yd^e‑3^‑ Ph_{o sp}h ate^‑deh_ydr og^{e n a s e};I C₅₀, C O n C e ntr atio n of C D D P thatinh ibits c ell _gr o wth b_y5 0 %; P B S, Pho sphate^‑buffe r ed

S alin e;R T, r e V e r S e tr a n S C rip tio n;T d T ,te rm in al de o xy^{n u c}le otid_yltr a n sfe r a s e; T U N E L,te r min al de o xy^{n u c}le otid_yl t_{r a n s}ftr a s e^‑m ediated d U T P^‑biotin nick e nd^‑1ab^eling ;U ,u nit

強 す^{る こ と}も 報 告さ れ て^い る^{2 Ⅰ) 2 2)}. し か し, ヒト骨 肉 腫 細 胞に 野生 型j 娼3 遺 伝 子を導入 し て, 抗 癌 剤に対 する感 受 性^の変 化 を 検 討^{し た}報 告^は未^{だ ない.} 本 研 究^{で は}, ヒト骨 肉 腫 細 胞^に野^生 型♪∂3 遺 伝 子 を 導^入する こ と に よ る細 胞増 殖 能, お よ び骨 肉腫 に村 する重 要 な 抗 癌 剤^である シ^ス プ ラ チン の殺 細 胞 効 果^の変化

つ い て検 討し た^. さ ら に, D N A 修 復 阻 害 物 質^である カフ^ェ イ ン併 用 時の p5 3 蛋 白^の発 現 抑 制 効 果と殺 細 胞 効 果 増 強に与 える 影 響^についても検 討し た^.

対 象^{お よ}び 方 法

Ⅰ^. 実 験^に用^いた培 養 細胞 株

ヒト骨 肉 腫 培 養 細 胞 株^{O S T}, H O S, Sa o s2 の3 株^を周^{い た,} O S T に^{つ い}て は当教 室で樹 立, 継 代 培 養^{し た}ものを 用^い, H O S と Sa o s2 について は米 国 標 準 培 養 株 保 存 機 関 (^{Ro ck vi 11e}, U S A) より 入取し た^. O S T で は ♪占3 遺伝 子^は野 生 型^で, 正常 型p5 3 蛋 白 を 発 現し, H O S で は_j坤³遺 伝 子は変異 型で_, 変 異 型p5 3 蛋 白 を 発 現^し, Sa o s2 で は P 5 3 遺伝 子^は欠失し, p5 3蛋 白^の発 現^は全 く 認^{め ない こと が}報 告さ れ て^い る2 3 ) 2 4 )

. 各細 胞 株は, 加 熱 失 活 処 理し た1 0%仔 牛 胎 児^血清 (^{f b tal bovin e s e ru m}) (大^日本 製薬, 大 阪), 10 0単 位 (u nit,U)/ml ペニシ リ^ン( 寓 有 製薬, 東京), 10 0

〃 g/ml ス ト^レプトマイ シ^ン (明 治 製 薬, 束 京) を 含^んだダル ベ ツ コ変 法 イ^ー グ^ル培 地 (^{Dulbe c c o's m}･^{Odified Eagle's m ediu m) (日} 水 製 薬, 束 京) を 用^{い て,} 湿 潤37 ℃, 5% C O 2 ^の条件下 で培 養し た. 細 胞 浮 遊 液^の調 整^{に は}ト^{リ プ シン}(^{0.2 5 %}溶 液) ^のみ, また はトリ プ シ^ンーE D T A溶 液を用^いた^.

Ⅰ. 薬 剤

薬 剤と し て シ^スプ ラ チ^ン(cisplatin, C D D P) (日本 化 薬, 東 京) ^{と カフ ェイン}( 無 水^カフェ イ^ン) (和 光 純 薬, 大 阪) を 用^い

た.

Ⅱ^. _pcD N A と_p5 3 発 現プ ラ^スミ ドpN S n

ネ^{オマイ シン}耐 性 遺 伝 子^{をコ ー} ドす^る発 現^ベク タ ^ー pCD N A bcD N A 3^.1(+),In vitr og^{e n,}S an D ieg^o, U S A) とネオマイ シ^ン耐 性 遺 伝 子, お よ び野 生 型♪5 3^cD N A を担 うpN S X R ( 金 沢 大 学痛 研 究 所, 病 態生理 部, 山 本 健^一 教 授より 供 与^{さ れ た}) を使 用し た. pcD N A とpN S X R はと もに サ イ トメガロ スウ イル スプロ モ

ー タ ^ー/ ^{エ ンハ ン}サ ^ー とS V｡ ｡ プ^{ロ モ ー} タ ^ー を^{コ ー} ド し, 両プ ラ

スミ ド^のネオマ イシン耐 性 遺 伝 子は S V｡ ｡プ^{ロ モ ー} タ ^{ー の} 下流 に,

d 方, 少5 3^cD N A は サ イ トメガロ ス ウイ^{ル ス} プ^{ロ モ ー} タ ^ー/

エ ンハ ンサ ^ー の下 流に挿入 さ れ て^いる. pN S X R ^の大 量 調 整に あたっ て, 大 腸 菌JM l O 9 に D N A を ト ラン ス フェ ク シ^{ョ ン}し,

1 5 0 ml L B 培 地 ( トリプト^ン1 0 g^, イ ^ー ス ト イ クス ト ラ ク ト 5_g,

塩 化ナ ト リ ウ^ム5 臥 ア ンピ シ リン5 0_{〃 g}/^ml, pH 7.6) ^{で 3 7 ℃},

1 2時 間培^{養し た.} 集 菌 後, ペ レ_ッ トを壊 衝 液^I[5 0m M Tr is^‑H Cl

b^{H 8.0}), 1 0mM E D T A, 1 0 0_FJg/ml R Na s e A(^Sigm a,St. Le uis,

ロS朗 1 ^{1 0m}l に懸 濁し た^. ア^ルカ リ液 (^{2 0 0m M} 水 酸 化ナ ト リ ウ ム_, 1 % S D S) 1 0mlを 加 え, 室 温で 5分 静 置し た. こ の溶 液に 3 M 酢 酸^{カ リ ウム} b ^{Ⅲ5.5)1 0mlを 加 え, 氷 冷2 0分 後, ペックマ}

ン6 0 Ti ^{ロ ー} タ ^ー (Be ckm a n In str^.,Fu.^{11e rto n, U SA) を 用いて,}

4℃, 3 5,0 0 0rpm , 3 0分 間 遠 心 を^おこなっ た. 上清 を 取 り, プ ラ^スミ ド精 製 用キッ トQI A G E N^‑ti p 5 0 0 (QI A G E N ,Vale n cia,

U S A) ^{カ ラムで分 画し た.} 溶 出^は綾 衝 液^H[^{5 0m M Tris‑H Cl}(p H 8^.5), 15 % ^エ タ ノ ^ー ル

, 1^.2 5 M NaC l] 1 3ml で行っ た^. プラスミ ド溶 出液 (12mD に 8.4mlのイ^ソプ^{ロ パ ノ ー ル}を混 合 後, 直 ちに 4℃, 2,0 00rp^{m ,} 3 0分 間遠 心 を 行^っ た^. 沈 殿 を7 0 % ^エ タ^{ノ ー ル}

で 1 回^{リン ス し て}風 乾^{し た･} 少 量^{の T E} 【1 0m M Tris^‑H C l(pH 8^.0), 1m M E D T A】に溶 解し, 濃 度4mg/ml に調 整し た.

Ⅳ. 野 生 型p5 3 遺 伝 子^の安 定導 入

各骨 肉腫 細 胞 株を 2 ^×1 0⁵個/mlの密 度で 6 0m m シャ ^ー レ (^{Co r nin}g, Ca mbri dge,U S A) ^に播 種^し, 2 4時 間培 養 後,

1) ポフ

エ ク ショ ン法で野生塑j娼3 遺 伝 子の導^{入 を}行^った^. リン酸緩 衝 生理食塩 水 b^{ho s}phate^‑bufEe r ed s alin e,P B S)^{1ml に}, pN S X R 20

〃 gを 溶 解^し, 1_/̀m Ol のカ チ オ^ニ ッ ク リ ポソ ^ー ム (^{ジー ン}ト ラ ン ス ファ ^ー , 和 光 純 薬) ^と混 合し て作^った リ ポ^{ソー ム}懸 濁 液を 各^{々1 0 0}/^ノ1ずつ デイシュ に添 加^し, さ ら に 1 6 時 間 培 養し た^. 対照プ ラ^スミ ド と し てpcD N A を 同 様^に導入 し た^. 1 6時 間培 養 後に新鮮 培 地に交 換し, さ ら に 2 4 時 間培 養 後, 細 胞^{を2 5}c m²の フラ^スコ (Co r ning) に移し換 え, 最 終 濃 度5 0 0_FLg/ mlのG 41 8 (^{Ge n eticin,Si}gm a) 添 加 培 地^{で 4} 週 間 選 択 培 養^{し た.} そ れ ぞ れ 生じ た 3 ^〜8 個^{のG 4 1 8}耐 性^{コ ロ ニ ー} か ら単^{一 コ ロ ニ ー} を 分 離し た^. 得ら れ た細 胞 株 を 親 細 胞 株と区 別し て, p5 3発 現プ ラスミ ドpN S X R を 導^{入 し た}細 胞 株 を^{O S T}/p5 3, H O S/ p5 3,

Sa o s2/p53 と し,

一方, 対 照プ ラスミ ド_pcD N Aを 導入 し た細 胞 株をO S T/pcD N A,H O S/pcD N A,Sa o s2/pcD N A と し て以_下の実 験に用^いた^.

V . 逆 転 写^‑P C R(r e v e r s e tl^･an S Criptio n^‑P C R, m ^‑P C R) ^法 を 用^いたp5 3 m R M 発 現^の検 索

総R N A の抽 出 精 製は, C ho m c zyn ski ら^{2 5)の}方 法に基づい て調 整さ れ た R N A 抽 出用 試 薬, アイ^{ソジュ ン}(^{ニ ッポンジー ン}, 束 京) を用^いた^･ R T^･P C R 反 応は, D Na s e 処理後5_Flg のR N Aを 鋳 型と し, ラ^ンダ^ム ヘキ サ マ ^ー を プ ラ イマ ^ー と し て逆 転 写 酵 素 (Li 鈷 Te chn ologi e sIn c^.,Ro ckville, U S A) に よりcD N A を合 成し た. 次に ア ポ ト ^ー シ^ス関 連 遺 伝 子 群 増 幅 周キ ッ ト A P O^‑M O 5 0 (^{M B I},San Fr a n ci_{s c o}

,U S A) を用^いて, Taq E X D N A ポ リ^メラ^ー ゼ( 宝 酒 造, 草 津) ^{でcD N A} 断 片^の増 幅を行^っ た. 内部コ ント

ロ ^ー ルに は グ リ セ ル ア ルデ ヒ ド^ー3^‑リ ^ン酸 脱 水 素 酵 素 也¹yc e r aldeh_yde^‑3^‑_pho sphate^‑deh_ydr og^{e n a s e}, G A P D H) を 用^い,

プ ラ イマ ^ー と し て は既 製 品 (C L O N T E C H h bo r ato rie sIn c.,Palo

A lto, U S A) を使 用し た^. その塩 基 配 列^{と し て}, セン スプ ラ イ^マ

ー は 5^'‑T G A A G G T C G G A G T C A A C G G H I T r G G T 3^', ア ンチ^{セ ン} スプ ラ イマ ^ー は 5^,‑C A T G T G G G C C A T G A G G T C C A C C A C^‑3^,であ

っ た^. P C R 反 応に は サ ^ー マ ル ^･ コ ントロ ^ー ラ ^ー P T C^‑1 0 0(^MJ Re s a r ch,W at_{e r}to w n,U S A) を 用^いて, 9 4℃で 5分 間^の熱 変 性後,

9 4℃で 1分 間, 6 0℃で 1分 間, 7 2℃で 2分 間^の3 ^ステップ を1 サ イ クルと し て 3 5回 増 幅^{し た.} 増 幅 後^{のP C R} 反 応 産 物^{を 2 % アガ}

ロ ^ー スゲ^ルで電 気 泳 動^し, エナ ジ ウムブ^{ロ マ}イ ドで染 色 後, 紫 外線 照射 装 置F N^‑2 6 6 0^‑0 0 (^{フナコ シ}, 東 京) ^を用^{い て}検 出^{し た.} 各^{バ ン}ド^の同定に は, 上記キッ ト^の陽 性 対 照 を 用^いた.

Ⅵ. ウ^{エ ス}タ ンプ^ロッ ト

各 細 胞 株^の細 胞 数 を1 ^×1 0⁷/血 に調 節し, P B S で洗 浄 後, 卵 胞溶 解 液A【5 0m M Tris^‑H C l(pH 7.5), 1 5 0m M 塩 化ナ ト リ ウ^ム, 1 % ノニデ ッ ト P^‑4 0, 1 % デ オ キ シコ ^ー ル酸ナ ト リ ウ^ム, 0.05 % S D S]5 0 0_iLl に溶 解 後, 超 音 波 処理 し, 0 ℃, 1 5,0 0 0回転, 1 0分

間遠 心し た. 得^{ら れ た 上}清 を採 取^し,

一 部 を^{プロテ インアツセ}

イキッ ト ￠io^‑Rad I且bo r atorie s,Rich m o nd, U S A) を 用^いて蛋白 定量を行った. 電 気 泳動^{は h e m mli ら2 6〉のS D S‑P A G E} 法で行^っ た. 得ら れ た蛋 白 (⁵F^Lg) を 試 料溶_{解 液 【}5 0m M T^ris^‑H C l

b ^{H 6.8),} 1 0 % グ リ セ^{ロ ー ル}, 2 % S D S,0.0 3 % ブ^{ロ モ フ}ェノ ^{ー ル}ブ ル ^ー , 6 % β^{‑メル カ}プト^エ タ^{ノ ー} ル1 ^と混 合し, 9 0 ℃, 5分間^の