早稲田大学大学院 先進理工学研究科
博 士 論 文 概 要
論 文 題 目
ヒト化マウスの麻疹ウイルス感染モデル及び 麻疹ウイルスを利用した組換えワクチン評価
系への応用
Application of humanized mice for the infection model of measles virus and evaluation of the recombinant measles
vaccine
申 請 者
池野 翔太 Shota IKENO
共同先進健康科学専攻 ゲノム生命工学研究
2015 年 12 月
【第 1 章 緒言】
麻疹ウイルスはパラミクソウイルス科に属する RNA ウイルスで、麻疹の原因であり、その病原性や 用いる受容体の違いから野生株とワクチン株の 2 種類に分類される。麻疹ウイルスワクチン株（以下 麻疹ウイルス）を用いた麻疹ワクチン接種による麻疹防御効果は広く知られているが、ワクチンとし ての非常に高い安全性や安定性、及び麻疹抗原と同時に別の抗原の免疫を賦与出来ることなど優れた 特長を有することから、麻疹に対するワクチンだけでなく、ウイルスベクターへの応用が期待されて おり、これまでヒト免疫不全ウイルス 1 型（HIV-1）を始めとする様々な感染防御抗原遺伝子を挿入し た組換え麻疹ワクチンが報告されている。
この組換え麻疹ワクチンの評価をするために、これまでサルや受容体（CD46 もしくは Signaling lymphocytic activation molecule（SLAM））発現遺伝子組換えマウス等が動物モデルとして用いられ てきた。霊長類であるサルは組換え麻疹ワクチンの評価に有用である一方、コスト面、倫理面からそ の使用には大きな制限があり、ワクチン評価には主に受容体発現遺伝子組換えマウスが用いられる。
しかしながら、受容体発現遺伝子組換えマウスはウイルス増殖のために１型 IFN 受容体が欠損してい るため自然免疫系が機能せず、ヒトと異なる病態を示す可能性がある。また、あくまでもマウスであ るため HIV-1 等のヒト指向性ウイルスに対する組換え麻疹ワクチンを評価しようとする場合、攻撃試 験によるワクチン評価が不可能である。そこで、本研究ではヒト化マウスの応用を試みた。ヒト化マ ウスとは、重度免疫不全マウスにヒト造血幹細胞を移殖することで、マウス体内にヒト免疫細胞を構 築したマウスのことであり、移殖したヒト造血幹細胞からはヒト B 細胞、T 細胞、単球、NK 細胞など が分化する。ヒト化マウスを用いるメリットとして、①ヒト免疫細胞を有するため、in vivo でのヒト 細胞を用いた研究が可能である、②既に HIV-1 を始めとしたヒト指向性ウイルスの感染動物モデルへ の応用がなされている、③サルよりも安価かつ扱いやすい小動物モデルである、といった点が挙げら れる。しかしながらデメリットも存在し、分化する環境がマウス環境であること、特にヒト T 細胞は マウス胸腺で教育されるため、その機能や分化に制限があることが知られ、抗原特異的 T 細胞応答は 微弱とされる。
本研究の最終目標は、HIV-1 に対する組換えワクチンとしての HIV-1 Gag 発現麻疹ウイルスの有効性 評価を行うことである。そこで本論文では、ヒト免疫細胞を有するヒト化マウスを麻疹ウイルス感染 動物モデルとし、ヒト化マウスが麻疹ウイルスに対し感受性を有すること及び麻疹ウイルス感染モデ ルとしての有用性、更に、HIV-1 Gag 発現麻疹ウイルスを評価するモデルとして本ヒト化マウス系の応 用が可能かどうか、を検討した。
【第 2 章 ヒト化マウスを用いた麻疹ウイルス感染モデルの確立】
2-1．ヒト化マウスにおける麻疹ウイルス受容体の発現
これまで、ヒト造血幹細胞を移殖することで構築したヒト化マウスにおける麻疹ウイルスの感染は 報告されていない。そこでまず、麻疹ウイルスの侵入に必要な受容体である CD46 及び SLAM の発現に ついて、ヒト化マウスの末梢血、脾臓、骨髄を用いてフローサイトメトリー解析した。なお、本研究 では全てヒト細胞に着目し、解析を行っている。解析の結果、それぞれの B 細胞、CD4+ T 細胞、CD8+ T 細胞の、①ほぼ全てに CD46 は発現するが B 細胞では発現強度が低いこと、②それぞれの細胞で SLAM 発現細胞が存在し、その中でも活性化している Memory T 細胞で発現細胞の割合が高いこと、が示され、
ヒト化マウスにおける麻疹ウイルス感染に繋がる基礎情報を得た。
2-2. ヒト化マウスにおける麻疹ウイルス感染の分布と動態
実際に、ヒト化マウスにおいて麻疹ウイルス感染が成立するかどうか、enhanced green fluorescent protein （EGFP）を発現する麻疹ウイルスを用いて感染実験を行い、感染細胞内で産生される EGFP を フローサイトメトリーで解析することで感染を確認した。その結果、末梢血、脾臓、リンパ節、骨髄 の B 細胞、CD4+ T 細胞、CD8+ T 細胞のそれぞれにおいて感染細胞が確認され、ヒト化マウスは麻疹ウ イルスに感受性を有すること及び全身性の感染を引き起こすことが示された。また、B 細胞、CD4+ T 細胞、CD8+ T 細胞の感染効率を解析したところ、Memory CD4+ T 細胞に最もよく感染する一方、B 細胞
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ではその効率は低かった。次に、麻疹ウイルス感染（1×105 pfu）による B 細胞、CD4+ T 細胞、CD8+ T 細胞数の変動について解析したところ、感染早期からそれぞれ大幅な細胞数減少が認められ、ヒト同 様にヒト化マウスにおいてもリンパ球減少症を観察した。この細胞数減少は接種ウイルス量依存的で あり、2×103 pfu 以下であれば半数以上で細胞数が 1 週間以上維持された。また、最も接種量の低い 2
×101 pfu であっても麻疹ウイルスの感染が成立していた。これらから、ヒト化マウスは麻疹ウイルス に感受性を有し、in vivo におけるヒト細胞での解析が可能な新しい麻疹ウイルス感染モデルとして応 用可能であることが示された。
2-3. ヒト化マウスにおける高感度麻疹ウイルス検出系の確立
蛍光タンパク質を発現しない組換え麻疹ウイルスを用いてワクチン評価を行うことを考えると、ヒ ト化マウスにおける麻疹ウイルス検出について、蛍光タンパク質に依存せずかつ少量の血液でも高感 度に麻疹ウイルスを検出可能な検出法が必要であった。そこで、qRT-PCR を用いた麻疹ウイルス検出系 の確立を試みた。まず、ヒト化マウスがヒト細胞とマウス細胞混在下にあることから、検出精度を高 めるためにヒト細胞の補正用遺伝子として human CD45 RNA 及び human RNase（hRNase） P RNA を候補 とし、その後細胞間での発現量にばらつきがない hRNase P RNA を補正用遺伝子に設定した。麻疹ウイ ルス検出には遺伝子構造の先端にある N タンパク質 RNA を標的とし、麻疹ウイルス N タンパク質 RNA の発現量を hRNase P RNA の発現量で除することで麻疹ウイルスを検出した。次に、予備実験として、
EGFP 発現麻疹ウイルス野生株及びその受容体を発現する Jurkat/human SLAM 細胞を用いて in vitro でフローサイトメトリー解析との比較を行ったところ、麻疹ウイルス量と感染細胞の割合に正の相関 が認められ、本検出系は in vitro においてフローサイトメトリー解析と同様の結果を得られることが 示された。この結果はヒト化マウスを用いた in vivo での試験でも同様に得られた。更に検出感度に ついて細胞数を指標に解析したところ、qRT-PCR では 2000 個程度でも解析可能であることが示された ことから、ヒト化マウスにおいて少量の血液でも高感度に麻疹ウイルスを検出可能な qRT-PCR を用い た検出系を確立した。また、実際にヒト化マウス末梢血における麻疹ウイルスの複製動態を解析した ところ、2 回のピークが存在することが示された。
以上の結果から、麻疹ウイルスを利用した組換えワクチンの免疫応答を解析するための土台を得た。
【第 3 章 ヒト化マウスを用いた組換え麻疹ワクチン評価系の評価】
3-1. ヒト化マウスにおける麻疹ウイルス特異的 T 細胞応答の解析
ヒト化マウスが組換え麻疹ワクチン評価モデルに応用できるかどうか解析するため、感染マウス脾 臓由来の T 細胞を同ドナー単球由来の樹状細胞と混合し、麻疹ウイルス抗原存在下で共培養した。そ の後、抗原刺激により産生されるサイトカイン（IL-2 及び IFN-γ）をフローサイトメトリーで解析す ることで麻疹ウイルス特異的 T 細胞応答の検出を試みた。しかしながら、通常のヒト化マウスでは、
麻疹ウイルス特異的 T 細胞応答は認められなかった。
3-2. 麻疹ウイルス特異的 T 細胞応答を検出するための改善
ヒト化マウスにおける免疫不応答性は、MHC の不一致やサイトカインの種差などマウス環境でヒト細 胞が分化することに起因すると考えられている。そこで、マウス MHC とヒトサイトカインに着目し、
免疫不応答性の改善を試みた。まず、ヒト化マウスの T 細胞はマウス胸腺で発生、分化するため、ヒ ト T 細胞がマウス MHC を認識できる可能性を考え、抗原との共培養にマウス抗原提示細胞を用いて解 析を行った。しかしながら、麻疹ウイルス特異的 T 細胞応答は検出されなかった。また、ヒト化マウ スでは種差によりヒトサイトカインが不足しており、その結果樹状細胞が少なく、B 細胞、T 細胞も未
熟な状態であることが知られている。そのため、ヒトサイトカインを補うことで免疫誘導環境の向上 を行い、麻疹ウイルス特異的 T 細胞の誘導を試みた。Hydrodynamic tail vein injection 法を用いて ヒト化マウス体内にヒト GM-CSF、IL-4 及び Flt3-L をそれぞれ発現するプラスミドを導入することで、
一過性にヒトサイトカインを発現する GM-CSF、Flt3-L 及び IL-4 導入ヒト化マウスを作製した。その 結果、ヒト化マウスの末梢血で高いサイトカイン濃度を認め、サイトカインの効果により骨髄におい
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て抗原提示細胞の一種である CD11c+ Conventional dendritic cell の顕著な増加が認められた。従っ て、GM-CSF、Flt3-L 及び IL-4 導入ヒト化マウスでは抗原提示機能が向上し、麻疹ウイルス特異的 T 細胞応答が誘導されることが期待された。
3-3. GM-CSF、IL-4 及び Flt3-L 導入ヒト化マウスにおける麻疹ウイルス特異的免疫応答の検出 GM-CSF、IL-4 及び Flt3-L 導入ヒト化マウスを用いて麻疹ウイルス特異的 T 細胞応答の検出を試みた。
その結果、樹状細胞からの麻疹ウイルス抗原刺激により IL-2 を産生する CD4+ T 細胞及び CD8+ T 細胞 を検出し、GM-CSF、IL-4 及び Flt3-L 導入ヒト化マウスにおいて麻疹ウイルス特異的 T 細胞応答を認め た。しかし、更に 5 匹を用いて麻疹ウイルス特異的 T 細胞応答の検出を試みたが、麻疹ウイルス特異 的 T 細胞応答を認めた個体は存在しなかった。次に、液性免疫について、ELISA を用いて解析を試みた。
その結果、サイトカイン未処置ヒト化マウスでは抗麻疹ウイルス IgM を検出できない一方、GM-CSF、
IL-4 及び Flt3-L 導入ヒト化マウスでは感染 14 日目の血漿において抗麻疹ウイルス IgM を検出した。
更に、抗麻疹ウイルス IgG についても同様に解析を行った結果、微弱ではあるもの抗麻疹ウイルス IgG を検出した。これらから、GM-CSF、IL-4 及び Flt3-L 導入ヒト化マウスを用いることで組換え麻疹ワク チンの液性免疫についてワクチン評価を行える可能性が示唆された。
【第 4 章 総括】
ヒト化マウスは麻疹ウイルスに感受性を有し、またリンパ球減少症も再現したことから、ヒト細胞 における麻疹ウイルス感染を解析可能な麻疹ウイルス感染小動物モデルとして有用なツールであるこ とが示された。そして、少量の末梢血から高感度に麻疹ウイルスを検出及び定量可能な qRT-PCR 検出 を確立した。これらから、本論文は、ヒト化マウスを用いて麻疹ウイルス及び麻疹ウイルスを利用し た組換えワクチンの解析を行う際の、基礎情報を提示するものである。また、GM-CSF、IL-4 及び Flt3-L 導入ヒト化マウスでは麻疹ウイルス特異的免疫応答を誘導し、抗麻疹ウイルス抗体を検出可能である 一方、細胞性免疫応答を検証するには不十分であることが示された。つまり、GM-CSF、IL-4 及び Flt3-L 導入ヒト化マウスを用いることで、ヒト化マウスを組換えワクチンの液性免疫を評価するモデルとし て応用できる可能性が示唆された。しかしながら、更なる強固な免疫応答を誘導するには HLA の導入 が不可欠であり、レシピエントマウスの改善が必須であるだろう。
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Ｎｏ.1
早稲田大学 博士（生命科学） 学位申請 研究業績書
氏 名 池野 翔太 印
（2015 年 12 月 現在）
種 類 別 題名、 発表・発行掲載誌名、 発表・発行年月、 連名者（申請者含む）
論文
論文
講演
講演
講演
講演
◯ Sensitive detection of measles virus infection in the blood and tissues of humanized mouse by one-step quantitative RT-PCR.
Frontiers in Microbiology, 4:298 2013 Oct
Ikeno S, Suzuki MO, Muhsen M, Ishige M, Kobayashi-Ishihara M, Ohno S, Takeda M, Nakayama T, Morikawa Y, Terahara K, Okada S, Takeyama H, Tsunetsugu-Yokota Y.
Expansion of activated memory CD4+ T cells affects infectivity of CCR5-tropic HIV-1 in humanized NOD/SCID/JAK3null mice.
PLoS One, 8(1):e53495 2013 Jan
Terahara K, Ishige M, Ikeno S, Mitsuki YY, Okada S, Kobayashi K, Tsunetsugu-Yokota Y.
◯Induction of human cytokines in humanized mice improves myeloid cell development and antigen-specific antibody production
第 43 回日本免疫学会学術集会 2014 年 12 月、京都
SHOTA Ikeno, KAZUTAKA Terahara, KATSUHIRO Komase, MAKOTO Takeda, YUKO Morikawa, HARUKO Takeyama, YASUKO Tsunetsugu-Yokota
◯ヒト化マウスの麻疹ウイルスベクター評価系への応用（３）
第 62 回日本ウイルス学会学術集会 2014 年 11 月、横浜
池野 翔太、寺原 和孝、駒瀬 勝啓、竹田 誠、森川 裕子、竹山 春子、横田（恒次）恭 子
◯Application of humanized mice for the evaluation of measles virus vector International Symposium on Integration of Chemistry and Bioscience
2014 年 1 月、新宿区
Shota Ikeno, Haruko Takeyama, Yasuko Tsunetsugu-Yokota
◯ヒト化マウスの麻疹ウイルスベクター評価系への応用 第 61 回日本ウイルス学会学術集会
2013 年 11 月、神戸
池野 翔太、鈴木 基臣 、寺原 和孝、石毛 真行、駒瀬 勝啓、竹田 誠、森川 裕子 、中 山 哲夫 、柳 雄介 、竹山 春子 、横田（恒次）恭子
Ｎｏ.2
早稲田大学 博士（生命科学） 学位申請 研究業績書
種 類 別 題名、 発表・発行掲載誌名、 発表・発行年月、 連名者（申請者含む）
講演
講演
講演
その他（講 演）
その他（論 文）
その他（講 演）
その他（学 会発表）
Humanized mice as an animal model for human-tropic virus infection.
Keystone symposium: Immunological Mechanisms of Vaccination December 13—18, 2012, Ottawa
Yasuko Tsunetsugu-Yokota, Masayuki Ishige, Shota Ikeno, Kazutaka Terahara
◯ヒト化マウスの麻疹ウイルスベクター評価系への応用 第 60 回日本ウイルス学会学術集会
2012 年 11 月、大阪
池野 翔太、寺原 和孝、石毛 真行、鈴木 基臣、光木 裕也、森川 裕子、中山 哲夫、横 田（恒次）恭子
◯Application of humanized mice for the evaluation of measles virus vector 第 11 回あわじしま感染症・免疫フォーラム
2012 年 9 月、淡路島
Shota Ikeno, Kazutaka Terahara, Masayuki Ishige, Motoomi Suzuki, Yu-ya Mitsuki, Yuko Morikawa, Tetsuo Nakayama, Yasuko Tsunetsugu-Yokota
アンチセンス鎖を介した HIV-1 潜伏化制御について
第 38 回日本分子生物学会年会、第 88 回日本生化学会大会 合同大会 2015 年 12 月、神戸
小林-石原 美栄、寺原 和孝、池野 翔太、阿戸 学、横田-恒次 恭子
Humanized mice dually challenged with R5 and X4 HIV-1 show preferential R5 viremia and restricted X4 infection of CCR5(+)CD4(+) T cells.
Microbes and Infection, 17(5):378-86 2015 Apr
Terahara K, Ishige M, Ikeno S, Okada S, Kobayashi-Ishihara M, Ato M, Tsunetsugu-Yokota Y.
R5・X4 HIV-1 混在感染ヒト化マウスの感染早期にみられる R5 ウイルス優位性とその要因 の検討
第 62 回日本ウイルス学会学術集会 2014 年 11 月、横浜
寺原 和孝、石毛 真行、池野 翔太、小林（石原）美栄、岡田 誠治、横田（恒次）恭子
恒常的に培養維持された CD4 陽性 T 細胞への HIV-1 の感染とその転写制御機構の解明 第 62 回日本ウイルス学会学術集会
2014 年 11 月、横浜
和田 倭、小林（石原）美栄、寺原 和孝、池野 翔太、徳永 研三、立川（川名）愛、山 岸 誠、竹山 春子、横田（恒次）恭子
