博 士 （ 医 学 ） 石 坂 明 人
学 位 論 文 題 名
ヒト末梢血リンパ球におけるインターリュウキン4 に よ る IgG4 お よ び IgE 産 生 の 誘 導
学位論文内容の要旨
I．はじめに
イ ンタ ーリ ュウ キン4(以下IL―4)がBおよびTリンパ 球に種々の作用を有するこ とは広 く知られている。マウスでは，IL―4がりポポリサッカライド刺激B細胞のポリク口ーナルな IgEお よ びIgGl産 生誘導を 促す一方，IgG2bおよびIgG3の産生を抑制することが知 られて いる。一方，ヒトではIL―4が健常人末梢血リンパ球のIgE産生を誘導することが知られてい るが，特異的かつ精度の高 いIgGサブクラス測定法がないために，IL―4がヒトIgGサブクラ ス産生に影響を与えるか否かにっいては明かではなかった。著者は，ヒトIgGサブクラスに対 するマウスモノク口一ナル 抗体(MoAB)を用いることによ り，ヒト単核球培養上清中 の4つ のIgGサブクラスの定量が可 能な特異的かっ精度の高いELISAを確立した。更に本方法を用 いて ，ヒ 卜末 梢血 単 核球(PBL)に おい ては ，IL―4がIgEばかりではなくIgG4の産 生を誘 導し ，か っこ のIL―4によ り誘導されたIgE/IgG4産生 は7−イン夕一フェ口ン(IFN ‑ア）
によって抑制されることを明らかにした。
JI.材料と方法
リ コン ビ ナン トIL―4はGenzyme社 ，リ コン ビ ナン 卜IFN‑ア は， 塩 野義製薬KK，マウ ス抗ヒトIL―4モノク 口一ナル抗体は，小野薬品KKより得た。健常成人より得たへパリン加 末梢血をFicoll−Hypaqueを用いた比重遠心法に よりPBLを得，10％不活化牛 胎児血清，2 mMグ ル タ ミン ，50 U/mlペ ニシ リ ン，50ルg/mlス トレ プト マイ シン を 加え たRPMI1640 培地 に浮 遊 した 。培 養は細胞の最終濃度2 x10e7ml，総量1mlで，12x 75mmFalconチュー ブを用い，37℃，5％C02大気下でおこなった。培養終了後，チュ―ブを450g，5分間遠心し 培養上清を集め，ELISAによる測定まで―20℃で凍結保存した。培養上清中のIgE定量はマウ ス抗 ヒトIgE MoAB（ ヤマ サ 醤油KK） を抗 原と して用いたELISAによ った。培養上清中の
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IgG総 量 ．IgGサ ブク ラス の 定量 はマ ウス 抗ヒ トIgGあ る いはIgGサ ブ クラ スMoAB (Ox‑
oid社 ） を 用 い たELISAに よ っ た 。
m．結 果
IgGサ ブ ク ラ スELISAの 検 量 線 ・ 特 異 性 ・ 精 度 ：WHO―REFーSERA (67/97)を も ち い た 検 量 線 か らそ の測 定下 限 はそ れぞ れ，IgGl，10ng7ml，IgG2，5ng／ml，IgG3，2 ng7ml，IgG4，2ng7mlで あっ た。 そ の特 異性 を精 製IgGサ ブク ラ スを 抗原 として用い検 討した時，そのcross―reactivityfま4％以下で あった。ヒトPBLのpokeweed mitogen培養 上清 に っき その 総IgG量 と，同一検体の4っのIgGサブクラス量を測定した時 ，総IgGサブ ク ラ ス 量 の 総 和 と の 相 関 は ， き わ め て 高 か っ た （r =0. 990，pく0．001)。 ヒ 卜PBLによ る114誘 導IgGサ ブク ラス 産 生の 培養 期間 ： 本ELISAを 用 いて ，IL―4が IgE産生を誘導する 条件下で，IgGサブクラス産生に与える影響にっき検討を加えた。2x106 個のPBLを400単 位/mlのILー4の 存在 ・非 存在 下 に培養すると，培養上清中 には，IL一4 非存在下では培養期 間が長くなるに伴いspontaneousなIgGl，およびIgG2産生を認めたが，
IgG3，IgG4，およびIgEの産生は認められない。 一方，400単位／mlの1L―4存在下におい ては，IgE産生の誘 導とともにIgG4産生の誘導が認められ，培養9日から12日目にその誘導は プラ ト ーを 示し た。IL一4の添加は，IgGlある いはIgG2のspontaneousな産 生にadditive な効果を何等示さな かった。
IL―4の容 量反 応 性：2 xl06個 のPBLを 種々 の 濃度のIL―4存在下で培養 し，培養10日 目に培養上清中のIgEおよびIgGサブクラスを定 量すると，添加するIL→4の 濃度が増加す るにっれ，IgEとと もにIgG4の産生量は増加し，400単位／mlで両者の最大の産生誘導を認 めた。
IL―4誘 導IgG4産 生 の抗IL―4抗 体．IFNアに よる 抑制 ：10〃g／mlの 濃度 の抗IL―4 抗体を加えることに より，IL―4誘導IgG4． IgE産生は完全に抑制されるが，IgGl．IgG2の spontaneousな産生 は抗IL―4抗体により抑制さ れないことからIgG4産生の誘 導がIL―4特 異的 で ある こと が示 され た 。ま た100UZ mlのIFN‑7の存在により，IL―4誘 導IgG4．IgE 産生は，完全に抑制 された。
IV． 考 按
本研究において著 者は，ヒトPBL培養上清中の4っのIgGサプクラス定量を 可能とする
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特異 的かつ 感度の 高いELISAを 確立し た。本ELISAの測定 下限は ，それ ぞれIgGlで10n g/
ml， IgG2で 5ng7ml，IgG3お よ びIgG4で 2ng/mlで あ っ た 。 本ELISAに 用 い た MoABのIgGサ ブク ラ ス 特 異性tま ， 性 格 の異 な る 数 種類 のassayを用 いたIUIS7WHO協同 研究によりすでに明かにされているが本研究においても，それぞれのIgGサブクラスが98％以 上に精製された精製IgGサブクラス蛋白を用いた場合その交差反応性は4％を越えず，特異性 は十 分と考 えられ た。っ ぎにこのELISAを用 いてヒ トPBL培養上清中のIgGサブクラスを定 量 す るこ と に よ り， ヒ トPBLに及 ぼ すIL―4の効果 を検討 した。IL―4をヒ トPBLに 加え て培 養する とIgE産生 に加え ，IgG4の著 しい産 生が認められた。このとき他の3っのIgGサ ブク ラスの産生には，影響が認められなかった。このIL―4で誘導されたIgG4産生は抗IL― 4 MoAB添 加によ り，IgE産 生と共に抑制された事から，IL―4特異的であるものと考えられ た。
ヒトにおいて，血清IgG4とIgEとが共通の調節を受けているらしいことが，いくっかの病 的状 態においてすでに示唆されている。すなわち，1）慢性寄生虫感染においては，特異的 IgG4とIgE抗体が 産生さ れる，2）アレル ギ一患 者において血清IgG4．IgE値はともに高値 と な る，3）IgA欠乏 症患者 におけ る血清IgG4．IgE値 はパラ レルに 変動する ，4）高IgE 症候 群の患者血清中のIgG4とIgEとは，きわめて高い正の相関が認められる，などである。
IL一4がいかなる機序でIgG4合成を増強するかにっいては，まだ不明であるものの，マウス に お いて は ，ILー4は，IgE．IgGl産生 にcommitさ れた細胞 の増殖 ではな く，IgGl．IgE へのクラススイッチを強く誘導することにより，IgGl．IgE産生の増強を促すことがあきらか にされており，ヒトにおいても同様の機序が働いている可能性が示唆される。本研究では，IFN
―ア によるIgG4産生の抑制効果は，IgEに対する抑制効果より弱いことが認められた。ヒト PBLのin vitro抗体産 生系として従来より用いられている，PWM，あるいは，Staphylococ‑
cus aureus CowanI刺激系 では，IgE産生の誘導は認められておらず，この刺激系における IgE産生 の抑制 は，mitogenにより誘導されるIFNー7による抑制によるものと考えられてい る。しかしながら，この2っの抗体産生系においても，IgG4産生が認められることから，IgG4 産生 の調節には，IL―4・IFN‑アに加えて，細胞間の相互作用あるいは，他のサイ卜カイン が，複雑に関与している可能性が示唆される。
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学位論文審査の要旨
イ ンター リュウ キン4(以 下IL―4)がBおよびTリンパ 球に種 々の作用を有することは広 く知られている。ヒトではIL―4が健常人末梢血リンパ球のIgE産生を誘導することが知られ ているが，特異的かつ精度の高いIgGサプクラス測定法がないために，IL―4がヒトIgGサブ クラス産生に影響を与えるか否かにっいては明らかではなかった。著者は，ヒトIgGサブクラ ス に対す るマウ スモノク口一ナル抗体(MoAB)を用いることにより，ヒト単核球培養上清中 の4っのIgGサ ブクラ スの定 量が可 能な特 異的かっ精度の高いELISAをまず確立した。更に 本 方法を 用いて ，ヒト末 梢血単 核球（PBL)にお いては，IL―4がIgEばかりでなくIgG4の 産 生 を誘 導し， かっこ のIL―4に より誘 導され たIgE／IgG4産生は7―イン ターフ ェ口ン (IFN‑7）によって抑制されることを明らかにした。
培 養上清 中のIgE定 量はマ ウス抗 ヒ卜IgE MoABを抗原 として 用いたELISAにより行い，
一 方培養 上清中 のIgG総量 ．IgGサブ クラス の定量 はマウ ス抗ヒ トIgGあるいはIgGサブク ラスMoABを用いたELISAによった。
っ ぎに 本ELISAを 用 い て ，IL―4がヒ トPBLにin vitroの系でIgE産生 を誘導 する条件 下で，IgGサブクラス産生に与える影響にっき検討を加えた。培養上清中には，IL―4非存在 下では培養期間が長くなるに伴いspontaneousなIgGl，およびIgG2産生を認めたが，IgG3， IgG4， およびIgEの産生 は認め られな い。一 方，400単位／mlのIL―4存在下においては，
IgE産 生の誘 導とと もにIgG4産生の誘導が認められ，培養9日から12日目にその誘導はプラ ト ーを示 した。IL―4の添 加は，IgGlあるい はIgG2のspontaneousな産生にadditiveな効 果 を何等 示さな かった。IL―4誘 導によ るこのようなIgG4とIgEの産生は10〃 g/mlの濃度 の 抗ILー4抗 体を加 えることにより，完全に抑制されるが，IgGl゜IgG2のspontaneousな産 生 は抗ILー4抗体に より抑制されないことからIgG4産生の誘導がILー4特異的であることが 示 さ れた 。一方 また100U7mlのIFN‑アの 添加に よって も，IL―4誘導IgG4゜IgE産生 は，
完全に抑制された。
本研究において著者はこのように抗ヒトIgGサブクラスモノクローナル抗体を用いた特異的
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三 彦紀 脩 邦知 本林 川 松小 皆 授授 授 教教 教 査査 査 主副 副
か っ 高 感 度 のELISA法 に よ り ， ヒ ト リ ン パ 球 培 養 上清 中 の4っ のIgGサ ブ クラ ス の 定 量 法を 確 立 し た 。 こ のELISAの 測 定 下 限 は ， そ れ ぞ れIgGlで10n g/ml，IgG2で5ng/ml，IgG3 お よ びIgG4で2ng7mlで あ っ た 。 本 方 法 を 用 い て ＠ ヒ ト114に よ る 末 梢 血 リ ン パ 球 のIgG サ ブク ラ ス 産 生 に 及ぼ す 効 果 を 検討 し た 結 果 ，114は ，IgE産 生 の増 強 に加え て，IgG4産生を 強 く誘 導 し た が ，IgGl，IgG2， ある い はIgG3産 生 に は 影響 を 与 え な かっ た 。 ◎IL―4に よ り 誘 導 さ れ るIgG4お よ びIgE産 生fま ，IFNア あ る い は ， 抗114モ ノク 口 ナ ― ル 抗体 に よ り 用 量 依 存性 に 抑 制 さ れ た。 ◎114がIgE産 生の み な ら ずIgGサ ブ クラ ス 産 生 に も 重要 な 調 節 的 役割 を演 じてい ること が明ら かにな った 。
以 上 の よ う に ヒ トPBL培 養 上 清 中 の4っ のIgGサ ブ ク ラ ス定 量 を 可 能 と する 特 異 的 且 つ感 度 の 高 いELISA法 を 確 立 し た 点 と そ れ を 用 い てr−IL4及 びrーIFN‑ア のIgG4疾 患 に 及 ぼ す 影響 を は じ め て 検討 し ， 上 記 の如 く ，IgG4とIgEが 共通の 調節 を受け ている と考え られ る結 果を 得たこ とはこ の種の 領域の 研究 として 十分評 価し得 るも のと考 えられ る。副査の小林・皆川 両 教授 か ら はIgGサ ブ ク ラ ス測 定 上 の 方 法論 と サ イ ト カ イン に よ るIgE，IgG4産 生抑制 のメカ ニズ ム等に っき質 問がな され， さらに皆川教授・小野江教授からも幾っかの御討議を頂戴したが，
いず れに関 しても 正確な 答えが なさ れたも のと判 断され た。
よっ て博士 の学位 授与 に充分 値する ものと 判定さ れる 。
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