博士（農学）高橋昌志 学位論文題名
牛 胚の体外 発生に及ぼすチオール化合物の 作用機 構に関 する研究
学位論文内容の要旨
哺 乳動 物 胚 を 体外 で 培 養 する と 、 動 物種 に よ り違い が認め られる が、種 に特有 な発育 段階 て 琴色生カ け．止 するこ とカ洳 られて いる。 牛胚でtま8‑16却黼 に発生が停止し、こ￠田譖魁ま in vitro blockと 呼 ば れ、 胚 を 体 外で 培 養 す ると きの大 きな障 害とな っている 。この ことは 体 外 で 培 養 する 胚 の 環 魔剰 翰 嗹 斟 蚋と 大 き な 隔た り が あ るこ と を 示 唆し て い る 。体 外 培 養 に おける胚 のin vitro blockを解除 し、そ の後の 胚の発 生を促進 する手 法とし て、卵 管ヒ皮 、 卵 丘 細 胞単 層 と の 共培 養 を 始 めと し て 、 培養 液 への 成長因 子、還 元物質 の添弧、 低酸索 分圧 条件下での培養等ガ罍￡みられているとともに、培養環境圍駆動び胚のボ謝に及ほづ噪う響、作用 機 序の解明 が強く 求めら れてい る。
胚 細 胞 内 で誼 、 エ ネ ルギ 二 産 生 部位 で あ る ミトコン ドリア におい て、ス ーパー オキサ イ ド 、 遏 酸化 水 素 等 の活 性 酸 素 が絶 え ず 産 生さ れ てお り、内 因性の 酸化ス トレスに 曝され てい る 。；柘誼 文でiま 、体外 受精で 得られ 体外培 養した 牛胚へ の酸化 ストレスの軽減を計り、発生 率 を 高 める こ と に 主眼 を 置 き 、培 養 液 を 還元 的 環暁 に整え る作用 を持つ チオール 化合物 が胚 発 生に及段 サ作用 とその 機構に ついて 検討し た。得 られた 主な成果Iま次のように要約される。
1．チオール化合物による牛胚の発生促進
体 外受 精 由 来 牛胚 の 体 外 培養 の 際 に 、還 元 作 用 を持 っ チ オ ールf臨 潮rで あ る ぉーメ ルカ プト エタノ ールお よびシ ステア ミンを 血清瀞 弧齬養 液に添み ロする ことに よって胚盤胞へ．の 発生 促進効 露幼電 謬6られ た。こ の発缶 ミ促進 効果はB丘細脆 との共 艤による 発生葺酎こ匹ivす る 結 果 であ っ た 。 この こ と か ら、チ オール 化合物 の添加 により 、従来 法であ った卵丘 細胞、
卵管、子宮ヒ皮鑞晒亀との災歯輔巻を行うことなく胚盤｜磐への発生率カ叩！進されることが明ちか に な っ た。 チ オ ー ル化 合 物 添 加の際 の適正 濃度は ローメ ルカプ トエタ 丿ール およびシ ステア ミ ン そ れ ぞ れ50 uMで あっ た 。 ま た、 高 濃 度 く500皿M） の 添 獅ま か え っ て胚 発 生 を 阻害 し た 。B‑メ ル カ プ ト エ タ 丿 ー ル を 添 細 し た 培 養 液 で 牛 胚 の3H ‑Thymidineの 取り 込 み を 潤 定 し た ところ 、対照区 である 血清添 加培養 液にお いて培 養したBlqtこjり虹 有意な 増加が 詔め られた。
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． チ オ ー ル 化 合 物 の 発 生 促 進 効 果 と 細 胞 内 ク っ レ タ チ オ ン 量 と の 関 係
声―メルカプトエタノールあるいはシステアミンを50 弘M の濃度で添軅した培養液で
24時 間 培 養 した 牛 胚 の 細胞 内 グ′レ タチオ ン量を 酵素法 を用い て灑定し たとこ ろ、無 譲lnrc 培 養し た 胚 に 比ぺ て 有 意 に増 加 し て いる こ と が 明ら か に な った 。
次 に 、 ロ ーメ ル カ プ トエ タ ノール あるい はシス テアミ ン存在 下でグル タチオ ン合成 阻害荊 で ある プ チ オ ニン ス ル ホ キシ イ ミ ンCBSO)を 培 養液 に 添加 して胚 の培養 を行っ たところ 、チ オ ー ル 化 合 物 カ 淳 在 し てい る に も かか わ ら ず 胚盤 ほ 釟 の 発生 率 は 低 下し た 。BSOに よる 発 生 阻害 を 受 け た胚 に つ い て、 少な くとも 一回の 細胞分裂 が見ら れた。 また、 チオー ル化合 物 存 在 下 でBSOを 添加 し た 培 養液 で24時 間 の 培 養を 行 い 、 その 後 、 細 胞内 グ ル タ チオ ン 量 を 測 定 し た と こ ろ 、 有 意 な 減 少 が 認 め ち れ た 。 ま た 、BSOを 添 加 す る こ と に よ っ て3H̲
Thymidine取 り 込 み 量も 減 少 の 傾向 を 示 し た。 こ れ ら のことよ り、細 胞内グ ルタチ オンは 、 胚 発 生 及 びDNA合 成 を 含 め た 細 胞 増 殖 に 深 く 関 わ っ て い る こ と カ 苛 箇 甅 さ れ 党 。
3．胚の酸化ストレスに関わるグルタチオンの役割
BSO添 如 に よル グ ル タ チオ ン 合 成 阻害 を お こ ない 、 胚 細 胞内 の 還 元 状態 を 崩 し た際 の 細 胞内過巒f匕7Jc素量を螢う目票謌閉オ質によって瀧したところ、グルタチオンカ韓舗曷した尠遵蒙で
；ま 過 缶HりK素 量 の 有意 な増 加ガ勸 られた 。また 、細胞 ミクロ 電気i承 重法に よって胚 のDNA 損傷の 程度を 澳腱し たとこ ろ、ク ヮレタ す・オ ン合成が 阻害さ れるこ とによ ってDNA損 傷の程 度 が 黯 に 増 加 し た 。 ま た 、DNAの 損 傷 程 度 は チ オ ー ル 化 合 物 の 添 弧 に よっ て 減 少 する 傾 向が 認 め ら れた 。 以 上 のこ と か ら 、細 胞 内 グ ルタ チ オ ン 量の 減 少 に より 還 元曝嚇 嘲れた 結 果 、 酸 化 ス ト レ ス に よ り 細 胞 内 鵐 晦 劼 懶 を 受 け 、 そ れ に よ っ てDNAが 露 疆 閤 懈 を 受 け ることカ涛．えられ党。
4． 牛胚の シスチ ン、シ ステイ ン利用性 に及ば すチオ ーリレ イb舗誑 甜キ彌と共培養細胞の役割 グ ルタ チ オ ン の構 成 物 質で あり、 その合 成に最 も影響 するア ミノ酸 であるシ スチン 、シス テ イ ン の 取り 込 み に 及ぼ す チ オ ール 化 合 物 の効 果 を 放 射性 標 識 シ スチ ン を 用いて 検討し た と こ ろ 、 牛胚 絃 シ ス テイ ン の 酸 化二 量 体 で ある シ ス チ ンを 取 り 込 むこ と が 匪黻あ ること が 明 ら か に なっ た 。 し かし 、B一メル カプト エタノ ールあ るいは システア ミンを 培養液 に・ぬH す る こ と によ っ て 、 細胞 内 への放 射性標 識シス チン取 り込み量 が有意 に増加 した。 チオー ル イ 匕台 物の添 加によ る放射 性鱗シ スチン 取り遜 み量の促 進錢甥 試ま、BSOによる クンレ タチオ ン 合 成 阻 害に よ っ て 減少 し たこと から、 細胞内 グルタ チオン代 謝とシ ステイ ン取り 込みと の 間 に何ら かの関 連があ ることが 考えち れた。
HPLC法 に よる 分 析 よ り、 培 養 液 中の シ ス チ ンは チ オ ー ル化 合 物 と の反 応 によ って異 なっ た 状 態 で 培養 液 中 に 存在 す ること が明ら かにな った。 チオール 化合物 は強カ な還元 作用を 持 つ こ と か ら、 胚 が 利 用で き な い シス チ ン を 還元 す る こ とに よ っ て 、細 胞 内 への取 込カ儺 さ れ たと考 えられ る。ま た、牛胚 の培養 に有効 とされ ている 卵丘一 ．X1騰I珊包との共培養の果 た す 役 削 につ い て 検 討し た 結果、 胚が取 り込む ことが 困難であ ったシ スチン を共培 養細胞 が 取 り 込 ん で利 用 し 、 培養 液 中に放 出する ことに よって 、胚がそ れらを 取り込 んで利 用でき る こ とカi考 えられ た。
以 上 の こ と か ら 、 チオ ー‑H醒F賊 ま、 培 養 液 内に 存 在 す るシ ス テ イ ンの 胚 へ の 取込 を 促
。ぶ3kれirがRN ‑ぬニレ Jゼ昧榊韃霧匹筆ぬや柚u麗衛綴讙やH：：鐘鉛彊￠vNくI，露盤G避斑VN(IGヰ最K /l‑IK盡，盤函賞鬣野麟沿藷坦唖雲，レPHu→Nり両缶衛囓おr八太小ヘュぐ叭ぞ靈，j蝋
