博 士 論 文 概 要

早稲田大学大学院 先進理工学研究科

博 士 論 文 概 要

論 文 題 目

ヒト中心体タンパク質 Cep169/CRBP1 の 同定と機能解析

Identification and Functional Analysis of a Human Centrosomal Protein,

Cep169/CRBP1

申 請 者

森 勇介 Yusuke MORI

化学・生命化学専攻 分子生物学研究

2015 年 12 月

動 物 細 胞 に お け る 細 胞 内 小 器 官 で あ る 中 心 体 は 、 中 心 小 体 と そ れ を 取 り 囲 む 不 定 形 の p e r i c e n t r i o l ar m a t e r i a l ( P C M )で 構 成 さ れ て い る 。中 心 体 か ら 伸 長 す る 微 小 管 は 、 間 期 に は 細 胞 骨 格 と し て 細 胞 内 物 質 輸 送 や 形 態 維 持 、 分 裂 期 に は 紡 錘 体 を 構 築 し 、 染 色 体 を 娘 細 胞 に 分 配 す る 装 置 と し て 機 能 し て い る 。 そ の た め 、 紡 錘 体 の 形 成 異 常 は 染 色 体 不 安 定 性 を 誘 導 し 、が ん 化 に つ な が る こ と が 知 ら れ て い る 。 さ ら に 近 年 、 紡 錘 体 軸 決 定 が 幹 細 胞 分 化 時 の 、 対 称 ま た は 非 対 称 分 裂 を 制 御 す る 上 で 重 要 な 機 構 で あ る こ と が 報 告 さ れ て い る 。 神 経 細 胞 や 上 皮 系 の 細 胞 分 化 時 に は 、 軸 の 方 向 に 依 存 し て 、 娘 細 胞 の 分 裂 方 向 が 変 わ り 、 幹 細 胞 の 自 己 複 製 、 ま た は 、 分 化 細 胞 へ と 細 胞 の 運 命 が 決 定 さ れ る 。 そ の た め 、 軸 の 異 常 は 小 頭 症 の よ う な 発 生 不 全 や 多 発 性 嚢 胞 腎 な ど の 疾 患 を 引 き 起 こ す こ と が 示 唆 さ れ て い る 。 し か し 、 こ の よ う な 紡 錘 体 軸 の 方 向 性 を 決 定 す る 因 子 に つ い て の 動 物 細 胞 で の 報 告 は 少 な く 、 紡 錘 体 を 制 御 す る 分 子 の 探 索 と 、 詳 細 な 分 子 機 構 の 解 明 が 求 め ら れ て い る 。 本 研 究 で は 、 紡 錘 体 軸 の 位 置 決 定 に お け る 分 子 機 構 解 明 を 目 的 と し て 、 中 心 体 お よ び 微 小 管 の 制 御 に 関 連 す る タ ン パ ク 質 の 同 定 と 機 能 解 析 を 行 っ た 。

こ れ ま で 我 々 の 先 行 研 究 で は 、 シ ョ ウ ジ ョ ウ バ エ に お け る c e n t r o s o m i n ( C N N ) タ ン パ ク 質 が 中 心 体 成 熟 と 微 小 管 動 態 を 制 御 し て い る こ と を 報 告 し た 。 一 方 、 C N N の ヒ ト ホ モ ロ グ で あ る C D K 5 R A P 2 は 、 小 頭 症 の 原 因 因 子 と し て 発 見 さ れ 、 こ の 欠 損 変 異 は 、 神 経 幹 細 胞 の 分 化 異 常 に 伴 っ た 、 大 脳 皮 質 の 減 少 を 誘 導 す る こ と が 報 告 さ れ て い る 。 そ の た め 、 ヒ ト 細 胞 に お い て も CD K 5 R A P 2 が 微 小 管 動 態 や 紡 錘 体 形 成 制 御 の 機 構 に 大 き く 貢 献 し て い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ る が 、 詳 細 な 分 子 機 構 は 明 ら か に な っ て い な い 。そ こ で 本 研 究 で は 、C D K 5 R A P 2 に 結 合 す る 分 子 を 探 索 す る こ と で 、 紡 錘 体 軸 の 決 定 制 御 に お け る 未 知 の 機 構 を 明 ら か に す る こ と を 考 え た 。C D K 5 R A P 2 に は 種 を 超 え て 高 度 に 保 存 さ れ た モ チ ー フ( C M 1)が 存 在 し 、 こ の C M 1 に 結 合 す る 分 子 の 探 索 を 行 う こ と で 、 こ れ ま で 機 能 に つ い て 報 告 の な い 新 規 の タ ン パ ク 質 を 同 定 し 、 遺 伝 子 を 単 離 し た 。 こ の タ ン パ ク 質 を 、C e p 1 6 9 ( c e nt r o s o m a l p r o t e i n 1 6 9k D a) / C R B P 1 ( CD K 5 R A P 2 - b i n d i n g p r o t e i n 1)と 命 名 し 、 中 心 体 の 機 能 と 共 に 紡 錘 体 軸 の 配 向 性 と い う 観 点 か ら 、 分 子 機 構 や 機 能 の 解 析 を 行 っ た 。

本 論 文 は 7 章 で 構 成 さ れ て い る 。 各 章 の 概 要 は 、 以 下 の 通 り で あ る 。 第 1 章 は 序 論 で あ り 、 本 研 究 背 景 と 目 的 に つ い て 述 べ る 。

第 2 章 は C D K 5 R A P 2 に 結 合 す る 、新 規 タ ン パ ク 質 C e p 1 6 9/ C R B P 1 の 同 定 と 細 胞 生 物 学 的 、 お よ び 、 生 化 学 的 な 性 質 に つ い て の 基 本 的 な 解 析 結 果 を 記 述 す る 。 CD K 5 R A P 2 は 、ヒ ト 以 外 の ホ モ ロ グ と の 相 同 性 比 較 に よ っ て 、高 度 に 保 存 さ れ た モ チ ー フ( C M 1 )を も つ こ と が 知 ら れ て い る 。 先 行 研 究 に よ り 、C M 1 は 微 小 管 重 合 に 重 要 な モ チ ー フ で あ る こ と が 明 ら か に な っ て お り 、 そ こ で 本 研 究 で は 、y e a s t t w o - h y b r i d 法 を 用 い て 、C D K 5 R A P 2 の C M 1 に 結 合 す る タ ン パ ク 質 の 探 索 を 行 っ た 。 探 索 の 結 果 、 こ れ ま で 機 能 に つ い て 報 告 の な い 、 新 規 タ ン パ ク 質 を 同 定 し 、

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分 子 量 が 1 6 9k D a の 中 心 体 タ ン パ ク 質 で あ る こ と か ら 、C e p 1 6 9/ C R B P 1 (以 下 、 C e p 1 6 9 と 表 記)と 命 名 し た 。 ヒ ト 細 胞 を 用 い た 免 疫 沈 降 実 験 に お い て も 、 同 様 に CD K 5 R A P 2 と C e p 1 6 9 の 結 合 が 確 認 さ れ 、ま た 、C e p 1 6 9 の N 末 端 が C D K 5 R A P 2 と の 相 互 作 用 に 重 要 な ド メ イ ン で あ る こ と が 明 ら か に な っ た 。C e p 1 6 9 の ア ミ ノ 酸 配 列 の 相 同 性 検 索 か ら 、C e p 1 6 9 の N 末 端 が 種 を 超 え て 高 度 に 保 存 さ れ て い る こ と が わ か り 、 こ の 保 存 領 域 を 抗 原 と し て 抗 体 を 作 製 し た 。 作 製 し た 抗 体 を 用 い た ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ ト 法 に よ り 、培 養 細 胞 に お け る 内 因 性 の C e p 1 6 9/ C R B P 1 の 検 出 お よ び 、 C e p 1 6 9/ C R B P 1 に 対 す る R N A 干 渉 に よ る s m a l l i nt e r f e r i n g R N A ( s i R N A )の タ ン パ ク 質 発 現 抑 制 効 果 を 確 認 し た 。 次 に 、 免 疫 染 色 お よ び 生 細 胞 観 察 に よ り 、C e p 1 6 9 の 局 在 が 中 心 体 の み な ら ず 、 微 小 管 伸 長 端 に 局 在 す る こ と を 確 認 し 、C e p 1 6 9 が m i c r o t u b ul e p l us - e n d - t r a c k i n g p r o t e i ns ( + T I P s )の メ ン バ ー で あ る こ と が 明 ら か と な っ た 。 多 く の+ T I P s は 、E B 1 を 足 場 に し て 微 小 管 伸 長 端 に 局 在 す る こ と が 報 告 さ れ て お り 、 C e p 1 6 9 に も E B 1 と の 結 合 モ チ ー フ ( S / T ) x ( I/ L ) P (以 下 S x I P モ チ ー フ) が 3 箇 所 存 在 し て い る 。 リ コ ン ビ ナ ン ト E B 1 タ ン パ ク 質 を 用 い た C e p 16 9 と の プ ル ダ ウ ン 実 験 か ら 、S x I P モ チ ー フ に 変 異 を 導 入 し た C e p 1 6 9 で は 、E B 1 と の 結 合 が 低 下 し た 。 ま た 、9 2 5 – 9 2 8 a a の S x I P 変 異 体 で は 、 微 小 管 伸 長 端 へ の 集 積 が 顕 著 に 抑 制 さ れ た 。 以 上 の 結 果 か ら 、C e p 1 6 9 は S x I P モ チ ー フ を 介 し て E B 1 と 結 合 し 、+ T I P s と し て の 局 在 を 示 す こ と が 明 ら か に な っ た 。

第 3 章 で は 、C e p 1 6 9 の 微 小 管 動 態 に お け る 機 能 に つ い て 記 述 す る 。C e p 1 6 9 を 細 胞 内 で 過 剰 発 現 さ せ る と 、 太 い フ ィ ラ メ ン ト 形 成 が 観 察 さ れ た 。 免 疫 染 色 に よ っ て 、 こ の フ ィ ラ メ ン ト は 、 微 小 管 が 束 化 し た も の で あ る こ と を 確 か め た 。 さ ら に 、 こ の 束 化 し た 微 小 管 の 性 質 を 解 析 し た と こ ろ 、 束 化 し た 微 小 管 を 構 成 す る t u b u l i n が 高 度 に ア セ チ ル 化 さ れ て い る こ と が 明 ら か に な っ た 。 ま た 、 微 小 管 動 態 を タ イ ム ラ プ ス 撮 影 に よ り 観 察 し た と こ ろ 、束 化 し た 微 小 管 は ほ と ん ど 動 か ず 、 微 小 管 先 端 で の 伸 長 や 脱 重 合 の 頻 度 が 低 下 し て い た 。こ の 微 小 管 の 束 化 の 現 象 は 、 前 章 で 作 製 し た S x I P 変 異 体 に よ っ て も 誘 導 さ れ る こ と か ら 、E B 1 を 介 さ な い C e p 1 6 9 の 微 小 管 結 合 の 機 構 が 示 唆 さ れ た 。C e p 1 6 9 の 免 疫 沈 降 に よ る ド メ イ ン 解 析 か ら 、C e p 1 6 9 は 、 ① 微 小 管 構 成 因 子 で あ る t u b u l i n と の 直 接 的 な 結 合 ド メ イ ン と 、 ②C e p 1 6 9 同 士 で 二 量 体 も し く は 多 量 体 を 形 成 す る ド メ イ ン を も つ こ と が わ か り 、 こ れ ら の ド メ イ ン に よ っ て 、 微 小 管 同 士 を 架 橋 す る こ と で 安 定 化 さ せ る 機 能 を も つ と 考 え ら れ た 。 実 際 、 内 因 性 の C e p 1 6 9 を 発 現 抑 制 し た 細 胞 で は 、 微 小 管 の 脱 重 合 が 亢 進 し て い る こ と か ら 、C e p 1 6 9 は 微 小 管 骨 格 の 維 持 に 重 要 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た 。

第 4 章 で は 、 分 裂 期 に 活 性 化 す る キ ナ ー ゼ と C e p 1 6 9 の 関 係 の 解 析 結 果 に つ い て 記 述 す る 。C e p 1 6 9 は 分 裂 期 に お い て 、 中 心 体 か ら 細 胞 質 に 解 離 す る こ と が 観

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察 さ れ た 。 分 裂 期 で は 、 多 く の キ ナ ー ゼ の 活 性 が 上 昇 す る こ と が 知 ら れ て お り 、 C e p 1 6 9 と 分 裂 期 キ ナ ー ゼ と の 関 連 を 確 認 し た 。C e p 1 6 9 は 、 細 胞 質 に 解 離 す る タ イ ミ ン グ で 、S D S - PAG E に お け る バ ン ド シ フ ト が 起 き て お り 、 こ の バ ン ド シ フ ト が キ ナ ー ゼ を 介 し た リ ン 酸 化 修 飾 に よ る も の か を 明 ら か に す る た め 、 ホ ス フ ァ タ ー ゼ 実 験 お よ び 各 種 キ ナ ー ゼ 阻 害 剤 を 用 い た 実 験 を 行 っ た 。こ れ に よ り 、C e p 1 6 9 は C D K 1 か ら 特 異 的 に リ ン 酸 化 を 受 け 、中 心 体 か ら 解 離 す る 機 構 が あ る こ と が 示 唆 さ れ た 。 ま た 、 質 量 分 析 を 用 い た 解 析 に よ り 、C e p 1 6 9 タ ン パ ク 質 の 中 央 付 近 の 領 域 で 7 箇 所 の リ ン 酸 化 セ リ ン を 同 定 し た 。 こ れ ら の リ ン 酸 化 部 位 は 、 全 て CD K 1 に よ る コ ン セ ン サ ス 配 列 と 一 致 す る こ と か ら 、C D K 1 に よ る リ ン 酸 化 が C e p 1 6 9 の 局 在 を 制 御 し て い る こ と が 示 唆 さ れ た 。

第 5 章 で は 、 細 胞 周 期 分 裂 期 に お け る 、C e p 1 6 9 に よ る 紡 錘 体 制 御 機 構 に つ い て 解 析 結 果 を 記 述 す る 。C e p 1 6 9 を 発 現 抑 制 し た 分 裂 期 の 細 胞 で は 、 分 裂 異 常 を 引 き 起 こ す こ と が 明 ら か と な っ た 。 分 裂 期 紡 錘 体 の 観 察 か ら 、 紡 錘 体 を 構 成 す る 微 小 管 の 短 縮 が 起 き て お り 、 さ ら に 紡 錘 体 の 軸 に 関 し て 、 ① 紡 錘 体 が 細 胞 の 中 心 か ら 偏 っ た 位 置 に 形 成 、 ② 本 来 、 細 胞 外 基 質 表 面 に 対 し 平 行 な 紡 錘 体 が 、 大 き く 角 度 が 傾 く 異 常 が 明 ら か と な っ た 。こ れ ら の 表 現 型 は 、C e p 1 6 9 発 現 抑 制 に よ る 、 微 小 管 の 安 定 性 低 下 に 起 因 す る も の で あ る と 考 え 、 さ ら に 詳 細 な 機 能 解 析 の た め に 、C e p 1 69 を 発 現 抑 制 し た 細 胞 に C e p 1 6 9 の 野 生 型 と S x I P 変 異 体 の 遺 伝 子 を そ れ ぞ れ 導 入 す る こ と に よ り 、 表 現 型 の 回 復 実 験 を 行 っ た 。 微 小 管 の 短 縮 は 野 生 型 と 変 異 体 の 両 方 で 回 復 が 認 め ら れ 、 紡 錘 体 が 偏 る 異 常 も 回 復 し て い た 。 し か し 、 紡 錘 体 の 角 度 異 常 は 、 野 生 型 で は 回 復 さ れ る が 、 変 異 体 で は 回 復 さ れ な い と い う 結 果 を 得 た 。S x I P 変 異 体 導 入 に よ る 結 果 は 、C e p 1 6 9 発 現 抑 制 細 胞 の t a x o l 処 理 に よ る 強 制 的 な 微 小 管 の 安 定 化 と 同 様 の 表 現 型 で あ っ た 。 以 上 の 結 果 か ら 、 C e p 1 6 9 は 、 紡 錘 体 を 構 成 す る 微 小 管 の 安 定 化 の 機 能 を も ち 、 さ ら に そ れ 以 外 に も 、S x I P モ チ ー フ を 介 し た 紡 錘 体 角 度 の 調 節 機 能 が あ る と 考 え ら れ た 。紡 錘 体 の 角 度 調 節 に は 、 細 胞 膜 に 局 在 す る d y n e i n / d y n a c t i n 複 合 体 が 星 状 体 微 小 管 を 捕 捉 し 、 細 胞 膜 に 固 定 す る 機 構 が 重 要 で あ る と 報 告 さ れ て い る 。 そ こ で 、d y n ac t i n の 構 成 因 子 と の 相 互 作 用 を 調 べ た と こ ろ 、a r p 1 タ ン パ ク 質 と C e p 1 6 9 と の 間 に 複 合 体 形 成 が 認 め ら れ た 。C e p 1 6 9 は 、d y n e i n / d y n a c t i n と 微 小 管 先 端 の E B 1 を 仲 介 す る こ と で 、 星 状 体 微 小 管 を 細 胞 膜 へ 固 定 さ せ 、 紡 錘 体 の 角 度 を 制 御 し て い る こ と が 示 唆 さ れ た 。 以 上 の 結 果 か ら 、C e p 1 6 9 は 、 ① 微 小 管 を 安 定 化 す る 機 能 と ② 紡 錘 体 角 度 を 決 定 す る 二 つ の 機 能 を 有 し 、 さ ら に 、 角 度 の 決 定 に は S x I P モ チ ー フ に よ る E B 1 と の 相 互 作 用 が 重 要 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た 。

第 6 章 で は 、総 括 で あ り 、本 研 究 に よ り 明 ら か と な っ た 結 果 に つ い て 考 察 す る 。 第 7 章 は 、 本 研 究 に 用 い た 実 験 手 法 、 マ テ リ ア ル 、 参 考 文 献 を 記 載 す る 。

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Ｎｏ.1

早稲田大学 博士（理学） 学位申請 研究業績書

氏 名 森 勇介 印

（2016 年 2 月 現在）

種 類 別 題名、 発表・発行掲載誌名、 発表・発行年月、 連名者（申請者含む）

論文 ○ “Phosphorylation of the centrosomal protein, Cep169, by Cdk1 promotes its dissociation from centrosomes in mitosis”

Mori, Y.; Inoue, Y.; Taniyama, Y.; Tanaka, S.; Terada Y.

Biochem. Biophys. Res. Commun., 2015, doi:10.1016/j.bbrc.2015.11.004.

○ “Microtubule-bundling activity of the centrosomal protein, Cep169, and its binding to microtubules”

Mori, Y.; Taniyama, Y.; Tanaka, S.; Fukuchi, H.; Terada Y.

Biochem. Biophys. Res. Commun., 2015, 467, 754-759.

○ “Cep169, a novel microtubule plus-end-tracking centrosomal protein, binds to CDK5RAP2 and regulates microtubule stability”

Mori, Y.; Inoue, Y.; Tanaka, S.; Doda, S.; Yamanaka, S.; Fukuchi, H.; Terada Y.

PLoS One, 2015, 10, e0140968.

“Asymetric and highly stereoselective synthesis of the DEF-ring moiety of (-)-FR182877 and its derivative inducing mitotic arrest”

Kobayakawa, Y.; Mori, Y.; Okajima, H.; Terada, Y; Nakada, M.

Org. Lett., 2012, 14, 2086-2089.

Ｎｏ.2

早稲田大学 博士（理学） 学位申請 研究業績書

種 類 別 題名、 発表・発行掲載誌名、 発表・発行年月、 連名者（申請者含む）

講演 (1) “新規中心体タンパク質 CRBP1/Cep169 による一次繊毛形成の制御機構の解析”

寺田 泰比古、森 勇介、谷山 ゆき、井上 陽子、中村 秀樹、井上 貴文、

成田 啓之、竹田 扇

東京、細胞生物学会: シンポジウム、2015年7月

(2) “CRBP1, a novel centrosomal protein, suppresses primary cilia formation with Cep97 and CP110”

Yuki Taniyama; Yusuke Mori; Naoki Kishida; Shota Yamanaka; Hideki Nakamura;

Takafumi Inoue; Keishi Narita; Sen Takeda; Yasuhiko Terada

The 37th Annual Meeting of the Molecular Biology Society of Japan, Kanagawa, November 2014.

(3) “一次繊毛形成を抑制する新規中心体タンパク質・CRBP1の同定と機能解析”

森 勇介、 谷山 ゆき、 岸田 尚樹、 山中 翔太、 中村 秀樹、 井上 貴文、

成田 啓之、 竹田 扇、 寺田 泰比古 静岡、繊毛研究会、2014年5月

(4) “CRBP1, a novel microtubule plus-end-tracking protein, regulates cell polarization including directional migration and neurite extension”

Yusuke Mori; Satoka Doda; Naoki Kishida; Shota Yamanaka; Yuki Taniyama;

Satomi Aoki; Hideki Nakamura; Takafumi Inoue; Naoya Takeda; Yasuhiko Terada International Symposium on Integration of Chemistry and Bioscience, Tokyo, January 2014.

(5) “Isolation and analysis of CRBP1, a novel microtubule plus-end-tracking protein”

Yusuke Mori; Satoka Doda; Naoki Kishida; Shota Yamanaka; Yuki Taniyama;

Yasuhiko Terada

The 36th Annual Meeting of the Molecular Biology Society of Japan, Hyogo, December 2013.

(6) “Identification and characterization of a novel microtubule plus-end-tracking protein interacting with CDK5RAP2”

Yusuke Mori; Sayori Tanaka; Satoka Doda; Hiroki Fukuchi; Yasuhiko Terada

The 35th Annual Meeting of the Molecular Biology Society of Japan, Fukuoka, December 2012.

(7) “(-)-FR182877のファーマコフォアの不斉全合成”

小早川 優、岡島 秀樹、森 勇介、寺田 泰比古、中田 雅久 日本化学会第92春季年会、神奈川、2012年3月

(8) “Enantioselective Synthesis and Biological Evaluation of the Pharmacophore of Antitumor Antibiotic (-)-FR182877”

Yu Kobayakawa; Yusuke Mori; Hideki Okajima; Yasuhiko Terada; Masahisa Nakada The 6th GCOE International Symposium on “Practical Chemical Wisdom”, Tokyo, December 2011.