博 士 論 文 概 要
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(2) Ｎｏ.1 脊椎動物の多くは、遺伝的に性が決定される。その後、性に依存した性分化関 連遺伝子群が働き、未分化生殖腺を精巣または卵巣へと分化させる。この時、分 化中の生殖腺より生産される性ステロイドホルモンが大きな要因となり、性分化 が進行する。生殖腺の性分化に関する研究は、これまで主に哺乳類・鳥類・魚類 を中心として行われてきた。両生類におけるこの分野に関する研究は、当研究室 の成果によって近年著しく進んだ。性決定・性分化機構は種の存続に関わる重要 な機構であり、これらの研究を行うことは進化を考える上で必要不可欠である。 そ の た め 、本 研 究 で は 両 生 類 ツ チ ガ エ ル ( R a n a r u g o s a ) を 用 い 、特 に 雄 化 機 構 に 着 目し、その解明を目的として研究を行った。 遺 伝 学 的 な ア プ ロ ー チ か ら 、 カ ジ カ ガ エ ル (Buergeria buergeri) で は GOT-1 ( G l u t a m a t e o x a l o a c e t a t e t r a n s a m i n a s e 1 ) 酵 素 が 性 と 連 鎖 し 、性 染 色 体 上 に そ の 遺伝子があると考えられている。そこで、我々の研究室で作製したツチガエル雄 (ZZ)ゲ ノ ム DNA ラ イ ブ ラ リ ー を 用 い 、 GOT-1 遺 伝 子 を マ ー カ ー と し て ゲ ノ ム ウ ォーキングを行うことにより、性決定遺伝子を探索することを目的とした。本研 究 で は 、 こ の 手 法 を 用 い 、 GOT-1 遺 伝 子 近 傍 配 列 の 単 離 と 解 析 を 行 っ た 。 ま た 、 他 の 脊 椎 動 物 で の 研 究 よ り 、G O T - 1 遺 伝 子 に 比 較 的 に 近 接 し た 領 域 に ス テ ロ イ ド 合 成 酵 素 遺 伝 子 CYP17 が 存 在 し て い る こ と が 確 認 さ れ て い る た め 、 こ の 遺 伝 子 の詳細な解析についても併せて行った。 第 1 章では、先行研究を基に、精巣分化機構の研究における本研究の位置づけ を示し、目的と意義について述べる。また、本研究の実験動物ツチガエルについ て、その特徴・発生段階分期法、雌雄判定法について説明する。 第 2 章 で は 、 G O T- 1 遺 伝 子 近 傍 配 列 の 単 離 、 解 析 結 果 に つ い て 述 べ る 。 ま ず 、 他 の 脊 椎 動 物 に お け る 報 告 を 参 考 に 、 ツ チ ガ エ ル G O T- 1 c D N A の 塩 基 配 列 1 , 4 0 4 b p 、 ア ミ ノ 酸 4 1 3 残 基 を 決 定 し た 。 こ の 配 列 を 基 に G O T- 1 遺 伝 子 特 異 的 プ ラ イ マ ー を 作 製 し 、ツ チ ガ エ ル ゲ ノ ム D N A ラ イ ブ ラ リ ー を 用 い た コ ロ ニ ー P C R 法 に よ る 段 階 的 ス ク リ ー ニ ン グ を 行 な っ た 。 そ の 結 果 、 G O T- 1 遺 伝 子 を 含 む 約 4 0 k b p の ゲ ノ ム D N A ク ロ ー ン ( C l o n e A ) を 得 る こ と に 成 功 し た 。こ の 塩 基 配 列 を 解 析 し た 結 果 、 C l o n e A は G O T- 1 遺 伝 子 全 長 ( エ ク ソ ン 1 ～ エ ク ソ ン 9 ) を 含 む こ と が 確 認 さ れ た 。次 に G O T- 1 遺 伝 子 隣 接 領 域 の 塩 基 配 列 を 決 定 す る た め 、C l o n e A の 下 流 の 塩 基 配 列 を 基 に プ ラ イ マ ー を 設 計 し 、 同 様 の 手 法 で G O T- 1 遺 伝 子 の エ ク ソ ン 8 、 エ ク ソ ン 9 を 含 む 約 40 kbpの ゲ ノ ム DNAク ロ ー ン (Clone B)を 得 た 。Clone Bに 関 し て は 、全 塩 基 配 列 を 決 定 し た 。 C l o n e A 及 び B の ク ロ ー ニ ン グ に よ っ て 、 G O T- 1 遺 伝 子 近 傍 配 列 約 70 kbpの 単 離 に 成 功 し た 。 次 に 、 FISH法 に よ り GOT-1遺 伝 子 の 遺 伝 子 座 を 解 析 し た 。そ の 結 果 、 G O T - 1 遺 伝 子 は 第 9 染 色 体 ( 常 染 色 体 ) 上 に 存 在 す る こ と が 判 明 し 、 性 染 色 体 に あ る と 考 え ら れ て い る カ ジ カ ガ エ ル GOT-1遺 伝 子 と は 局 在 が 異 な る こ と が 明 ら か と な っ た 。 し か し な が ら 、 同 時 に 行 っ た Clone Bの FISH解 析 で は 、 GOT-1遺 伝 子 座 と 異 な る 領 域 に 興 味 深 い シ グ ナ ル が 確 認 さ れ た 。 シ グ ナ ル を 1.
(3) Ｎｏ.2 生 じ る 領 域 を 特 定 す る た め 、C l o n e B を 3 k b p ～ 9 k b p の 9 つ に 断 片 化 し 、再 度 F I S H 解 析 を 行 っ た 。 そ の 結 果 、 隣 接 し た 2つ の 断 片 に お い て 異 な る シ グ ナ ル が 確 認 さ れたため、さらに詳細な解析を行った。塩基配列の解析により、これら断片の上 流 に は 41 bpの 配 列 が 53回 (Frag A)、 ま た 下 流 で は 31 bpの 配 列 が 29回 (Frag B)繰 り 返 さ れ て い る こ と が 明 ら か と な っ た 。そ こ で こ れ ら 反 復 配 列 を 用 い て F I S H 解 析 を 行 っ た 結 果 、F r a g A で は シ グ ナ ル は 全 て の 常 染 色 体 末 端 に 見 ら れ 、F r a g B で は シ グ ナ ル は 全 て の 常 染 色 体 と Z 性 染 色 体 末 端 、及 び W 性 染 色 体 の 長 腕 動 原 体 付 近 と 末 端 に 確 認 さ れ た 。 Frag Bに つ い て は 、 性 染 色 体 上 に 強 度 の 異 な る 2つ の シ グ ナ ル が 存 在 し 、Z 及 び W 性 染 色 体 で 異 な る シ グ ナ ル パ タ ー ン を 得 た こ と か ら 、ツ チ ガ エル性染色体の逆位の起きた位置を同定することによって、性染色体の進化を研 究する上で非常に有効なマーカーとなる可能性が示唆された。 第 3 章 で は 、 G O T- 1 遺 伝 子 近 傍 に 存 在 す る C Y P 1 7 遺 伝 子 の 解 析 結 果 に つ い て 述 べ る 。 こ れ ま で の 研 究 よ り 、 他 の 動 物 種 で は G O T- 1 遺 伝 子 近 傍 に C Y P 1 7 遺 伝 子が存在していることが明らかとなっている。また、両生類生殖腺の性決定及び 性分化には性ステロイドホルモンが重要であることが知られており、雄性ホルモ ン で あ る ア ン ド ロ ゲ ン の 合 成 に は 、 合 成 酵 素 CYP17 が 不 可 欠 で あ る 。 従 っ て 、 両 生 類 の 雄 化 に CYP17 遺 伝 子 の 関 与 が 考 え ら れ た た め 、 そ の 解 析 を 行 っ た 。 ま ず 、 既 に 得 ら れ て い る ツ チ ガ エ ル CYP17 遺 伝 子 の 塩 基 配 列 を 用 い 、 上 記 と 同 様 の 手 法 に よ り CYP17 遺 伝 子 を 含 む ゲ ノ ム DNA 断 片 の 単 離 を 試 み た 。 こ の 結 果 、 ツ チ ガ エ ル に は CYP17 機 能 遺 伝 子 と 偽 遺 伝 子 の 2 つ の 遺 伝 子 (CYP17 及 び pseudo. C Y P 1 7 ) が 存 在 し て い る こ と が 明 ら か と な っ た 。そ こ で 、そ の 塩 基 配 列 を 詳 細 に 解 析 し た 結 果 、 CYP17 は 他 の 脊 椎 動 物 の CYP17 タ ン パ ク 質 と 相 同 な ア ミ ノ 酸 配 列 を コ ー ド し て い た の に 対 し 、p s e u d o C Y P 1 7 は C Y P 1 7 と 塩 基 配 列 が ほ ぼ 一 致 し て いるものの、多くの場所で塩基の挿入・欠失があり、機能を持たない短く異なっ た ア ミ ノ 酸 配 列 を コ ー ド し て い る こ と が 推 定 さ れ た 。 ま た 、 ゲ ノ ム DNA の 解 析 に よ り C Y P 1 7 は 複 数 の エ ク ソ ン か ら 構 成 さ れ て い る の に 対 し 、p s e u d o C Y P 1 7 は 単 一 の エ ク ソ ン で あ る こ と も 明 ら か と な っ た 。 さ ら に FISH 法 に よ り 2 つ の 遺 伝 子 座 を 解 析 し た 結 果 、C Y P 1 7 及 び p s e u d o C Y P 1 7 は 、そ れ ぞ れ 第 9 及 び 第 4 染 色 体 (共 に 常 染 色 体 )に 局 在 し て い る こ と が 確 認 さ れ た 。 各 塩 基 配 列 か ら 特 異 的 な プ ラ イ マ ー を 作 製 し 、ツ チ ガ エ ル 成 体 各 組 織 で の 発 現 解 析 を 行 っ た と こ ろ 、pseudo. CYP17 は 多 く の 組 織 で 非 常 に 弱 い 発 現 が 見 ら れ る の に 対 し 、 CYP17 は 精 巣 で 強 く 発 現 し て い る こ と が 分 か っ た 。ま た 、ツ チ ガ エ ル 発 生 過 程 の 生 殖 腺 で は p s e u d o. CYP17 は 発 現 に 雌 雄 差 が な い の に 対 し 、 CYP17 は 性 決 定 期 の 雄 生 殖 腺 に 強 く 発 現していることが明らかになった。この遺伝子発現パターンの違いは、転写調節 機構の違いによると思われた。そこで、2 つの遺伝子のプロモーター領域の塩基 配 列 を 決 定 し 、そ の 比 較 を 行 っ た 。こ の 結 果 、両 者 の 間 に 全 く 相 同 性 は 見 ら れ ず 、 2 つの遺伝子の発現はそれぞれ異なる転写因子により制御されていることが示唆 2.
(4) Ｎｏ.3 さ れ た 。 本 研 究 に よ り 、 ツ チ ガ エ ル に お け る CYP17 機 能 遺 伝 子 と 偽 遺 伝 子 の 存 在 を 見 出 し た が 、 そ の 発 現 パ タ ー ン と コ ー ド さ れ る ア ミ ノ 酸 配 列 か ら 、 pseudo. CYP17 は ツ チ ガ エ ル 雄 化 に 直 接 関 与 し な い と 思 わ れ る 。 第 4 章 で は 、 ツ チ ガ エ ル 性 分 化 機 構 に 重 要 な 役 割 を 担 う と 考 え ら れ る CYP17 遺伝子のプロモーター領域の解析について述べる。本研究では、ツチガエルゲノ ム D N A ラ イ ブ ラ リ ー を 用 い て C Y P 1 7 遺 伝 子 領 域 を 単 離 し 、そ の プ ロ モ ー タ ー 領 域 4,097bp の 塩 基 配 列 を 決 定 し た 。 そ こ で 、 生 殖 腺 の 分 化 に 関 わ る 転 写 因 子 に 注 目 し 、得 ら れ た 配 列 内 で の 結 合 配 列 の 存 在 を 調 べ た 。こ の 結 果 、CYP17 プ ロ モ ー タ ー 領 域 に は ス テ ロ イ ド 合 成 酵 素 遺 伝 子 の 発 現 に 深 く 関 わ る SF-1 結 合 配 列 が 1 箇 所 、 G ATA 結 合 配 列 が 4 箇 所 、 F o x L 2 結 合 配 列 が 6 箇 所 、 A R ( ア ン ド ロ ゲ ン 受 容 体 )結 合 配 列 が 2 箇 所 、 SOX 結 合 配 列 が 4 箇 所 存 在 す る こ と が 予 想 さ れ た 。そ れ ら の 因 子 が プ ロ モ ー タ ー 領 域 に 結 合 し て CYP17 の 発 現 を 制 御 す る か ど う か を 解 析 す る た め 、C Y P 1 7 プ ロ モ ー タ ー ベ ク タ ー と 各 転 写 因 子 の 発 現 ベ ク タ ー を 作 製 し、ルシフェラーゼアッセイ法でプロモーター解析を行った。しかし、各転写因 子 は CYP17 の 転 写 を 促 進 し な か っ た 。 今 後 、 さ ら に CYP17 遺 伝 子 の 転 写 制 御 機 構を解明するため、他の転写因子の関与を探索していく必要がある。 第 5 章 で は 本 研 究 の 総 括 に つ い て 述 べ る 。 G O T- 1 遺 伝 子 近 傍 配 列 ( F r a g B ) の F I S H 解 析 結 果 か ら 、性 染 色 体 上 の シ グ ナ ル パ タ ー ン は 性 染 色 体 の 進 化 ( 逆 位 ) の し くみを明らかにする上で、非常に有効なマーカーとなる可能性が示唆された。ツ チガエルの実験動物としての特徴として、地方集団により異なった染色体型 ( X X / X Y 、Z Z / Z W ) が 存 在 す る こ と が 挙 げ ら れ る 。性 染 色 体 の 進 化 過 程 に つ い て は 、 これまでに染色体の形態により多くの研究が行われてきたが、本研究結果はこれ までの報告に加え分子レベルで実証することができ、より詳細な染色体研究と性 決 定 遺 伝 子 の 探 索 に つ な が る 重 要 な 発 見 で あ る と 期 待 さ れ る 。 ま た 、 G O T- 1 遺 伝 子 近 傍 に 存 在 す る C Y P 1 7 遺 伝 子 の 解 析 に よ り 、ツ チ ガ エ ル に は C Y P 1 7 機 能 遺 伝 子 と 偽 遺 伝 子 が 存 在 す る こ と が 明 ら か と な っ た 。 実 験 結 果 よ り 、 pseudo CYP17 は CYP17 と 塩 基 配 列 が ほ ぼ 一 致 し て い る が 単 一 の エ ク ソ ン で 構 成 さ れ て お り 、 機 能 的 な CYP17 タ ン パ ク 質 を コ ー ド し て い な い こ と が 予 想 さ れ た 。 こ の 結 果 か ら 、 pseudo CYP17 は 第 9 染 色 体 上 の CYP17 遺 伝 子 か ら 転 写 さ れ た mRNA、 若 し く は mRNA が 逆 転 写 さ れ た cDNA が 、 第 4 染 色 体 に 挿 入 さ れ て 生 じ た 偽 遺 伝 子 (processed pseudogene) で あ る と 推 測 さ れ た 。 本 研 究 で は 、 両 生 類 に お い て 1 つ の 遺 伝 子 が 偽 遺 伝 子 に 変 化 す る 可 能 性 を 初 め て 示 し た 。 pseudo CYP17 の ツ チ ガエル雄化への関与の可能性は低いことが推測されたが、その機構における. CYP17 遺 伝 子 の 役 割 、 発 現 調 節 、 相 関 関 係 等 は 未 だ 不 明 な 部 分 が 多 い 。 今 後 は 、 ゲノム上の繰り返し配列が性染色体の進化に関与するかどうかの研究を進めてい く と と も に 、 C Y P 1 7 遺 伝 子 に つ い て 、そ の 発 現 制 御 と 雄 決 定 の 仕 組 み を 明 ら か に していく必要がある。 3.
(5) Ｎｏ.1. 早稲田大学 氏 名. 須田 茉莉. 博士（理学）. 学位申請. 研究業績書. 印 （２０１１. 種 類 別. 題名、. 発表・発行掲載誌名、. 発表・発行年月、. 年２. ○ (1) Steroidogenic gene expression during sex determination in the frog Rana rugosa. Maruo K, Suda M, Yokoyama S, Oshima Y, Nakamura M. Gen Comp Endocrinol. 2008 Aug;158:87-94 Androgen receptor of the frog Rana rugosa: molecular cloning and its Characterization. Yokoyama S, Oshima Y, Tokita J, Suda M, Shinozuka T, Nakamura M. J Exp Zool Part A Ecol Genet Physiol. 2009 Aug;311A:796-812. ○ (3) Molecular cytogenetic characterization of telomere-specific repetitive DNA sequences in Rana rugosa. Suda M, Uno Y, Mori Y, Matsuda Y, Nakamura M. J Exp Zool Part A Ecol Genet Physiol. 2011.(掲載決定). 4. 現在）. 連名者（申請者含む）. 論文. (2). 月.
(6) Ｎｏ.2. 早稲田大学 種 類 別 講演. 題名、. 博士（理学） 発表・発行掲載誌名、. 学位申請. 研究業績書. 発表・発行年月、. 連名者（申請者含む）. (1) ツチガエル(Rana rugosa)に存在する 2 つの CYP17 遺伝子の解析 Identification of two types of CYP17 genes in the frog, Rana rugosa 日本動物学会第 80 回大会 (静岡) 2009.9 須田 茉莉、大島 裕希、中村 正久 (2) Identification and Analysis of Two CYP17 genes at Distinct Loci Expressed in the Frog Rana rugosa. Society for the Study of Reproduction 43rd Annual Meeting (Milwaukee,Wisconsin) 2010.8 Suda M, Oshima Y, Nakamura M. (3) ツチガエル(Rana rugosa)における GOT-1 遺伝子の単離とその遺伝子領域の解析 Isolation and localization of GOT-1 gene in the frog Rana rugosa 日本動物学会第 81 回大会 (東京) 2010.9 須田 茉莉、大島 裕希、宇野 好宣、松田 洋一、中村 正久. 5.
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