移植前樹状突起細胞投与と

博 士 （ 医 学 ） 臼 木 智 哲

学 位 論 文 題 名

移植前樹状突起細胞投与と

CD407CD40L 経路阻害による移植片生着延長効果 学位論文内容の要旨

【 緒 言 】 移 植 医 療 に お い て 、 レ シ ピ ェ ン ト を ド ナ ー 特 異 的 な 寛 容 状 態 に 導 き 、 既 存 の免 疫 抑制 剤 を 使 用 せ ず 移 植 片 の 長 期 生 着 を 得 る こ と が 最 終 目 的 で あ る 。 ア ロ 抗 原 特 異 的T細 胞 が 、 抗 原 特 異 的 に 寛 容 状 態 に な る た め に は 、T細 胞 が そ の 抗 原 を 認 識 し 副 刺 激 が 効 果 的 に 阻 害 さ れ る こ と が 必 要 で あ る 。 最 近 、T細 胞 上 のCD40Lか ら 抗 原 提 示 細 胞(APC)上 のCD40に 伝 達 さ れ る 副 刺 激 経 路 が ，APC/T細 胞 相 互 作 用 の 初 期 段 階 で 重 要 で あ る こ と が 報 告 さ れ て い る ． そ こ で 、 移 植 前 に 強 カ な 抗 原 提 示 細 胞 で あ る ド ナ ー 由 来 の 樹 状 突 起 細 胞(DC)で レ シ ピ ェ ン ト を 感 作 す る と 同 時 に CD40/CD40L経 路 阻 害 に よ り 移 植 片 生 着 延 長 が 得 ら れ る か ラ ッ ト 同 種 腎 移 植 を 用 い て 検 討 し た 。

【 材 料 ・ 方 法 】 動 物 は ，ACIラ ッ ト 、LEWラ ッ ト を 用 い た ． ド ナ ー と し て 用 い るACIラ ッ ト の 脾 細 胞 か ら 分 離 し 得 ら れ たDCの 発 現 し て い る 表 面 分 子 を フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー で 確 認 し ， FITC‑Dextranを 用 い て そ の 貪 食 能 を 検 討 し た ． 組 換 え ア デ ノ ウ ィ ル ス ベ ク タ ー か ら 得ら れ た可 溶 性 蛋 白CTLA4−Ig，CD40−Igに よ り ， 副 刺 激 経 路 で あ るCD28/CD80． CD86，CD40/CD40L経 路 をそ れ ぞ れ 阻 害 し た ． 刺 激 細 胞 をACIラ ッ ト の 脾 細 胞 ま た はDC， 反 応 細 胞 をLEWラ ッ ト の 脾 細 胞 と し た り ン パ 球 混 合 反 応(MLR)に よ り ， 刺 激 細 胞 の 違 い で 使 用 さ れ る 副 刺 激 分 子 の 重 要 度 を 検 討 し た ． ラ ッ ト 同 種 腎 移 植 は ド ナ ー をACI， レ シ ピ ェ ン ト をLEWと し ， 、 移 植 後 直 ち に レ シ ピ ェン ト の自 己 腎 は 摘 出 し て い る の で レ シ ピ ェ ン ト の 死 を も っ て 移 植 片 喪 失 と し た ． ま た 、 ， 移 植 片生 着 期間 は median survival time (MST)で 表 し た ． ま ず ， 移 植 後 のCD40‑Igの 効 果 を 検 討 す る た め に ， コ シ 宀 ロー ル 群： ：無 治 療，CD40群 ：：CD40−Ig Img/body i.v. (day0，2，4），匸 ，7翻4＃：CTLA4−Ig 1mg／bodyi．v．（day0，2，4）， を 設定 した ． 次に 移植 前DCとCD40−Ig併用投与の効果を 検討した．

DCは す べ て 移 植9日 前 に2xl06個 の 細 胞 数 で レ シ ピ ェ ン ト に 静 注 投 与 し ，CD40―Igの 一 回 投 与 量はlmg／body（low一dose）と4mg／body（high→dose）のニっを設定した．1．匹：！Q塑幽≦！g旦塑二！＆

世 旦 ； カ 伽 ＃ ：DC投 与 の み ， 仞 朋 奪 芦 ：DC投 与 とCD40―Igi．v． （day―7） ， 閲 艚 奪芦 ：DC投 与 とCD40―Igiル （day2） ， 別 朋 群 ：DC投 与 とcD40−Igiル （day−7，2），  2： 堕：h！血 ニ 堂≦ ！ gQ生生 ！g鎚 用 ：ロ 御弸 ザ ：Dc投与とCD40―Igi．v．（day−7），脚￠＃ ：DC投与とCD40−Ig（day2），

ロ 錦 ぞ ＃ ：DC投 与 とCD40−Ig（dar7，2） ， 以 上 の 群 で 検 討 し た ． 移 植 モ デ ル の 解 析 と し てD4R4 群 に つ い て 、 移 植 後7日 目 、30日 目 の レ シ ピ ェ ン ト か ら 脾 細 胞 を 回 収 し 、 コ ン ト ロ ー ル 群 か ら 得 ら れ た 牌 細 胞 の と ア ロ 抗 原 に 対 す る 反 応 をMLRで 比 較 し た 。 ま た ，DCとCD40―Ig投 与 に よ ル レ シ ピ ェ ン ト 脾 細 胞 に お け る 調 節 性 細 胞 と さ れ るCD4℃D25゛T細 胞 及 びNKT細 胞 の 比 率 をDc投 与 後5 日 目 ・9日 目 で 無 処 置 群 ，DC単 独 投 与 群 と フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー を 用 い て 比 較 し た ．

【 結 果 】 本 研 究 で 用 い た ， 脾 細 胞 か ら 得 ら れ るDCはICAい1，CD80，CD86，MHCclassuを 強 く 発 現 し て い た が ， 貪 食 能 は 保 持 さ れ 完 全 に 成 熟 型 のDCで は な い と 考 え ら れ た ． こ のDCま た は 脾 細 胞 を 刺 激 細 胞 と し たMLRに お い てCD40―Igま た はCTLA4―Igの 抑 制 効 果 を 検 討 し た ，す な わち ，

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刺激細胞の種類により 移植抗原認識に係わる副刺激 分子の重要性が異なるかを検討した．刺激細 胞が脾細胞のとき，高 濃度を添加するとCTLA4一Ig，CD40ーIg両者ともに増殖反応を抑制すること がで きたが，低濃度ではCTLA4ーIgがより抑制効果は強かっ た．しかし，刺激細胞をDCとしたと き，CD40−Igは50pcg/mlの濃度で完全に抑制するこ とができたが，CTLA4ーIgは同濃度でも約50％ の 抑 制 効 果 に 留 ま っ た ． 以 上 よ り ，DC/T細 胞 相 互 作 用 に お いてCD28/CD80，CD86経路 よ り CD40/CD40L経路による 副刺激が重要な役割を担って いることが示された．よって，レシピェント が移 植抗原を認識するとき，APCがドナー由来のDCに限定さ れると，CD40−Igの投与で 効果的に 移植片生着延長が得ら れる可能性があると考えられ た．まず，DCとCD40−Igの移植前投与の効果 を検 討する前にCD40−Igの単独 投与の効果をCTLA4‑Igと比 較した．CTLA4群は容易に移 植片長期 生着 が得 ら れた が(MST>100日 ） 、CD40群(MST=8日 ） は同 量投 与し て もコ ントロール 群(MST=8 日）と差はなかった． これは投与量を合計18mgまで 増加しても同様であった．従って，CD40ーIg を可溶性蛋白として移 植後レシピエントに投与して も効果は示さなぃと考えられた．次に、移植 前の ドナ ー 由来DCとCD40―Ig併用投与で移植片生着延長が 得られるかを試みた．投与 されたDC が二 次リ ン パ飾 組織 に移 動しT細 胞と 相 互作 用す るのは24時間以降と考えCD40−Igの 投与はDC 投与 後2日目 にし た． 移 植前DCの み投 与 したDORO群は，移 植抗原に感作されるため超 急性拒絶 反応 により，コントロール群と 比べ2日早く移植片喪失とな った(MST=6日）．DC投与後CD40−Ig

（Img/body)を追 加し たDIRO群は 、超 急 性拒 絶反 応を回避 でき軽度の移植片生着延長 を認めた (MST=9日 ） ．更 に、 移植 後CD40−Igを追 加し たDIR1群は40%に90日以上の長期生着延 長が得ら れた(MST=13日）．low‑dose CD40−IgではCD40/CD40L経路を阻害するには不十分と考え、一回投 与量 を4mg/bodyにし 生着 期間 を 観察 した ．D4RO群 は40%に10日以上の生着が認められ るのみで あり(MST=S日） 、ま たDOR4群 はコントロール群と明らかな 差はなかった(MST=7日）イ しかしな がら、day−9、day2にCD40−Igを投与したD4R4群は全ての移植片に長期生着延長を認めた(MST>100 日）．よって、移植後のCD40‑Ig単独投与は効果が認められなかったことから、移植前DCとCD40―Ig 投与 により移植後のCD40‑Igの 効果を著明に増幅させること ができたと考えられた．D4R4群がド ナー 抗原 に 対し 寛容 状態 にな っているか、MLRにて検討し た．移植後7日目ではD4R4群 の脾細胞 はドナー脾細胞に対し て増殖反応は抑制されていた が、30日目では増殖反応は回復していた．よ って 、胸腺から新たにドナー抗 原反応性T細胞が産出され、 末梢で抑制されていないこ とが示唆 され た，また、DCとCD40‑Ig投 与による処置でレシピェント の二次リンパ節組織で調節 性細胞で あるCD4℃D25゛T細胞 とNKT細 胞 の変 化を 解析 した ．CD4℃D25゛T細胞はDC投与後5日目 、9日目 で無 処置群、DC単独投与群、DC・ CD40‑Ig併用群で差は認 められなかった．しかし、NKT細胞は DC単独投与で軽度増加 を認めたが、DC・ CD40―Ig併用群では更に増加していた．よってNKT細胞 が、移植前DC・ CD40−Ig投与による移植後CD40‑Ig効果増幅に関与していることが示唆された，

【考 察】 移 植抗 原反 応性T細胞 が抗原を認識するとき、APCが様々な細胞集団で構成さ れている と、 各々のAPC/T細胞相互作用 において使用される副刺激分 子も異なってくる可能性が 考えられ る． 事実 、 脾細 胞を 刺激 細胞 と したMLRではCD40/CD40L経 路を阻害するよりCD28/CD80． CD86 経路 を阻害したほうが効果的に 増殖反応を抑制できた，こ れに対して、APCをDCに均一 化したと き、CD40/CD40L経路の 阻害により抗原提示能カが高 いにもかかわらず完全に抑制することができ た， よっ て 、DC/T細 胞相 互作 用においてCD40/CD40L経路が 非常に重要であることが示 された．

一般的にドナ一由来のAPCによルレシピェントを寛 容状態/丶丶誘導するには、B細胞、未熟型DCな どの 抗原提示能の低いAPCを用 いた方が有利と考えられてい る．しかし我々は、副刺激 分子を効 果的 に阻 害 でき るの であ れば 、MHC分子を強く発現してい るDCの方が、容易に数多くのT細胞を 低反 応状 態 に誘 導で きる と考 え、DCとCD40−Ig併用による 移植片生着延長を試みた． 移植前DC とCD40−Igの投与のみ では生着延長に効果は認めら れなかったが、移植後CD40ーIgを追加するこ とで 全てのレシピェントに長期 生着延長を得ることができ た，合計3回の処置だけで長 期生着を

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誘導することができ、この処置は有効な方法と考えられた．長期生着が得られた群に対し移植後 のドナー抗原に対する反応性を検討したところ、胸腺から新たに産出したドナー抗原反応性のT 細胞は消失せず末梢に存在していることが示された．これはレシピェント内では何らかの抑制機 序が働きT細胞が活性化せずに存在しているが、in vitroで培養するとその抑制機序が働かない ためT細胞は増殖反応を示すと考えられた．また、DCとCD40−Igの投与でレシピェントの脾細胞 にNKT細胞の増加を認め関与が示唆されたが、この細胞群の消失または移入により移植片生着に 影響を与えるか検討する必要がある．

【結語】本研究において、DC/T細胞相互作用においてCD40/CD40L経路が重要な役割を持ち、DC とCD40―Ig併用により移植片生着延長が得られることを示した．

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学位論文審査の要旨

学 位 論 文 題 名

移植前樹状突起細胞投与と

CD40/CD40L 経 路阻害に よる移植 片生着延長効果

  T細胞 が抗原認識するとき，副刺 激経路を阻害するとT細胞は 寛容状態ヘ誘導することが可 能であ る．また，免疫応答において 樹状細胞(DC)は中心的な役 割をもち，DCの機能を修復す ることで宿主 の免疫応答を調整し，疾患を 治療する試みがなされている，よって，DCと副刺激 阻 害 を 用 い るこ とが 移 植片 生着 誘導 に有 効 な手 段と 考え ら れる ，当 教で ドナ ー 由来DCと CTLA4ーIgの移 植前投与により，移植片生 着延長を試みたが不十分な結果であった．今回，DC とT細胞との相 互作用においCD28/CD80． 86経路よりもCD40/CD40L経路が重要と考え，ドナー 由来DCでレシピエントを感作する際 ，CD40ーIgによるCD40/CD40L経路阻害で移植片生着延長 が誘導できる かを検討した．今回の実験で 用いたドナー脾細胞から分 離したDCは，T細胞を活 性化するため の表面分子はすでに発現し， 未熟型のDCではないが，dextranを取り込む能カは 保持されてい た．次にCD40ーIgの効果をMLRで確認する際，刺激細胞の違いで重要となる副刺 激分子 も異なるかをCTLA4―Igと比 較した検討した．刺激細胞をACIの脾細胞，DCとし，反応 細胞をLEWの脾 細胞としMI.Rを行った．刺 激細胞を脾細胞としたときCD40―Ig．CTLA4―Igが高 濃度であると き両者は増殖反応を抑制するが，低濃度ではCTLA4ーIgのほうが抑制効果は強かっ た ．そ れに 対し ， 刺激 細胞をDCと したときCTLA4―Igは高濃度 添加しても約50％程度の抑制 であったが，CD40−Igは10F1g /mlの濃度 でも完全に抑制できた．よって，DC．T細胞相互作用 においCD28/CD80． 86経路よりCD40/CD40L経路が重要と考えられた．次にドナーーをACI，レシ ピェントをLEWとしたラット同種腎移植を 行った．CTLA4・，IgはImg/body3回投与で容易に長 期生着延長が 得られるのに対して，CD40―Igは同投与量でもコン卜口ール群と比べ差はなかっ た．よって移 植後CD40ーIg単独投与では生 着延長効果を得るのは困難と考えた．続いて，DC・ CD40ーIg併用による生着延長効果を 検討した．DCは全ての群で 移植9日前に2xl06個の細胞数 で静脈投与し た．CD40Igのー回投与量がImgであるlow−doseと4mgであるhigh−．doseを設定 し，移 植7日前，2日後，または両日 投与した．DCのみ投与され たDORO群はコントロール郡と 比 べて2日 早い 移植 片喪 失を認めた ． DC投与後2日日にCD40ーIgを追加したDIRO群に早期移

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査 査

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植 片 喪 失 は 認 め ら れ ず ，5匹 中2匹 に10日 以 上 の 生 着 を 認め た ． 更 に 移 植後CD40ーIgを 投 与し たDIR1群 は40％ の 移 植 片 に 長期 生 着 を 認 めた ． さ ら にCD40‑・Igの 投 与 量を 増 加 し 移 植実 験 を 行 っ た ． D4RO群 ，DOR4群に 早 期 の移植 片喪 失を認 めない が軽度 の生 着延長 を示す だけで あった ． し か し ，day―7とday2にCD40ーIgを 投 与 し たD4R4群 は100％ 長期 生 着 延 長 を 得るこ とがで きた．

こ の 群 にお い て 寛 容 状 態が 誘 導 さ れ てい る か ， ま ず移 植 片 の 病 理組 織 像 を 確 認 した と こ ろ ， 移 植 後130日 目 で 組 織 は 強 く 荒 廃 し寛 容 は 誘 導 さ れて い な か っ た． 移 植 後D4R4群 レ シピ ェ ン ト の ド ナ ー 抗原 に 対 す る 反 応を コ ン ト ロ ー一 ル 群 とMLRで 比 較 検 討し た ， 移 植 後7日 目 で は レシ ピ ェ ン ト の ド ナ ー 抗 原 に 対 す る 反 応 は 抑 制さ れ て い た が30日 目 ま でに 回 復 し て いた ，CD4℃D25゛T     ：

細 胞 とNKT細 胞 のtegulatory cellにつ い て ，DC． CD40―Ig投 与後 脾 細 胞 中 での 比 率 の 変 化を 7ロサ イIメ19イー で解 析した ．CD4+CD25+T細胞はDC． CD40−Igを投与でも変化は認められなかった．

NKT細 胞 はDC投 与 後5日 目 にDC投 与 だ け で もNKT細 胞 は 増 加 し た がCD40ーIgを 追 加 す る と 更 に 増 加 し て い た ． 更 に ， そ の 増 加 は9日 後 ま で 持 続し て い た ， 以上 か ら ，DC/T細 胞 相 互作 用 に お い て ，CD40/CD40L経 路 は 重 要 な 副刺 激 経 路 と 考え ら ，DCとCD40ーIgの 投 与 で移 植 片 に 長 期生 着 延 長 が 得 ら れ た ． ま たDC．CD40−Ig処 置 に よ りNKT細 胞 の 増加 を 認 め ， 移植 片 生 着 延 長 への 関 与 が 示 唆 さ れ た ． 質 疑 応 答 で は ， ま ず 小 野 江 教 授 か ら 移 植 後 ラ ッ ト のMLRが 抑 制 さ れ て い る の は 投 与 し たCD40‑Igが 関 与 し て い る の で は と の 質 問 が あ っ た ． そ の 質 問 に 対 し ， 培 養 す る ま で 洗 浄 し て い る た め ， 投 与 し たCD40‑Igの 関 与 は 否 定 的 で あ る と 解 答 し た ． 上 出 教 授 か ら 移 植 前 にDCを 投 与 す る 意 義 に つ い て 質 問 が あ っ た ． そ の 質 問 に 対 し ， 移 植 前 に DCに よ り 感 作 す る こ と で レ シ ピ ェ ン 卜 に 移 植 抗 原 に 対 し 低 反 応 状 態 を 誘 導 す る こ と が で き 移 植 片 へ の 傷 害 が 回 避 で き る と 答 え た ． 小 柳 教 授 か ら ，CD40‑Igを ア デ ノ ウ ィ ル ス ベ ク タ ー に よ り 投 与 し た と き の ， 血 中 濃 度 の 違 い に つ い て の 質 問 が あ っ た ． 可 溶 性 蛋 白 の と き は ウ ィ ル ス ベ ク タ ー と 比 ベ 約5分 の1程 度 の 血 中 濃 度 ま で し か 上 昇 し な い が ．DCと 併 用 す る こ と で ウ ィ ル ス ベ ク タ ー を 用 い た と き と 同 等 の 効 果 を 示 し ， か つ 安 全 性 が 高 い と 解 答 した．

  こ の論 文 は ， ア デノ ウ ィ ル ス ベク タ ー を 用 い ず可 溶 性 蛋 白 とし てCD40―Igを 用い て 生 着 延 長 を 誘 導 し た 点 で 高 く 評 価 さ れ ， 今 後DCとCD40−Ig併 用 の 臨 床 応 用 が 期 待 さ れ る ，   審 査員 一 同 は ， これ ら の 成 果 を高 く 評 価 し ， 大学 院 課 程 に おけ ろ 研 鑚 や 取得 単 位 な ど も併 せ 申 請 者 が 博 士 （ 医 学 ） の 学 位 を 受 け る の に 十 分 な 資 格 を 有 す る も の と 判 定 し た ．

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