ハ ス ム ハ パ ハ ケ 博 士 （ 医 学 ） 哈 斯 木 哈 怕 哈 克
学位論文題名
マウス癌細胞の悪性化進展の免疫賦活剤による抑制機序 と の Manganese Superoxide Dismutase cD$i
学位論文内容の要旨
緒 言
癌 細 胞 の悪 性 化 進展(tumor progression)は、 癌 化 した 細 胞 が その 増 殖 過程 に お いて 周 囲 の 微 小 環 境 の 影 響 に よ っ てさ ら な る遺 伝 子 の変 異 を 起こ し 、 強い 増 殖 能、 浸 潤 ・ 転移 能 な ど 悪 性 形 質 を 獲 得 す る こ とで あ る 。従 っ て 、癌 の 克 服の た め には 、 悪 性化 進 展 を 抑制 す る 手 段 を 開 発 す る こ と が 発 癌の 予 防 と共 に 重 要で あ る と考 え ら れる 。 し かし 、 癌 細 胞の 悪 性 化 進 展 の 要 因 あ る い は 抑 制の 研 究 は少 な い 。そ れ は 、癌 細 胞 の悪 性 化 進展 を 検 討 する 実 験 系 の 開 発 が 遅 れ て い る た め と 思 わ れ る 。 岡 田 ら の 樹 立 し たC5 7BL/6マ ウ ス の 退 縮 型(QR‑
32)癌 細 胞 は 同 系 マ ウ ス に 単 独 皮 下 移 植 す る と 自 然 退 縮 す るが 、 プ ラス テ イ ッ ク・ プ レ ー ト や ゼ ラ チ ン ス ポ ン ジ な どの 異 物 共存 下 で は同 系 マ ウス で 腫 瘍を 形 成 する 。 増 殖 して き た 腫 瘍 か ら 再 樹 立 し た 細 胞 株 は も と のQR‑32癌 細 胞 に は 見 られ な い 強い 皮 下 増 殖性 お よ ぴ肺 転 移 能 を 獲 得 し 、 悪 性 化 進 展 を 起 こ し た と 判 定 さ れ る 。 ま た 、QR‑32癌 細 胞 の悪 性 化 進展 に は 異 物 反 応 炎 症 細 胞 の 産生 す る 活性 酸 素 が関 与 す るこ と が 推察 さ れ てい る 。 本 研究 で は QR‑32癌 細 胞 の ゼ ラ チ ン ス ポ ン ジ 共 存 下 に 増 殖 し て き た 腫瘍 か ら 樹立 し た 癌 細胞 株 の 悪性 化 進展 お よ びこ れ に 付随 す るets familyに 属 す る転 写 因 子El AF発 現 お よび マ ト リッ ク スメ タ ロ プ ロ テ ア ー ゼ(MMP)産 生 を 検 索 し 、 ま た 腫 瘍 組 織 中 の抗 酸 化 酵素 産 生 量 の観 点 か ら、
悪 性化 進 展 の免 疫 賦 活剤PSKによ る 抑 制機 序 を 解析 し た 。 材料 と方法
1）QR‑32癌 細 胞(ixios個 ） を 同 系 マ ウ ス に ゼ ラ チ ン ス ポ ン ジ と 共 に 皮 下 移 植 し 、 そ の 増 殖 を 観 察 し た 。 腫 瘍 移 植5日 前 よ り 毎 日 、 腫 瘍 移 植 後 は 一 日 お ぎ に 腫 瘍 摘 出 ま でPSK 300 mg/kg/dayを 連 続 腹 腔 内 投 与 し た 。2） 移 植 後21日 目 に 増 殖 し て い る 腫 瘍 か ら そ れ ぞ れ 個 別 に 培 養 株 を 樹 立 し た 。3） 樹 立 培 養 癌 細 胞 の 悪 性 化 進 展は ， 新 たな 正 常 同系 マ ウ ス に単 独 皮 下（2X 10s個） あ る い は尾 静 脈 内移 植(lXl06個 ） し 、皮 下 増殖性 または肺 転移能 のどち ら か 一 方 で も 親 株QR‑ 32癌 細 胞 のそ れ ら に比 ベ 有 意に 増 強 して い る こと を 指 標 にし て 判 定 し た 。4）EIAFお よ び 膜 結 合 型MMP(MTl‑MMP)の 発 現 は ノ ー ザ ン ブ ロ ッ テ イ ン グ 法 に より 、Tissue inhibitors of metalloproteinase (TIMP)の 発現およ び炎症 性サイトカインの発 現 はRT‑PCR法 に よ っ て を 検 討 し た 。5）MMPの 活 性 お よ び 産 生 量 は 癌 細 胞 の 培 養 上 清 conditioned medium(CM)を サ ン プ ル と し て ザ イ モ グ ラ フ イ ー によ り 検 討し た 。6） 新 鮮 腫 瘍 組 織 あ る い は 癌 細 胞 のMn‑SOD蛋 白 産 生 量 は 細 胞 抽 出 液 を 蛋 白 サ ン プ ル と し て 、 ウ エ ス タン ブロッ テイング 法によっ てを測 定した。
結 果
1）無処置 マウスに ゼラチン スポンジと 共に皮下 移植し増殖してきた腫瘍から樹立した細 胞株(QRsP)の6系 中6系が悪 性化進展 をおこして いたに対して、PSK投与マウスに増殖して きた腫瘍から樹立した細胞株(QRsP/PSK)では、6系中3系(50％）しか悪性化進展を起こしお らず、PSKに より悪性 化進展が 抑制された 。2）悪性 化進展に 伴い肺転 移能を獲 得した細 胞株でEIAF、MTl‑ MMPの発現と72kDaのタイプIVコラゲナー ゼ(NfMP‑2）活性 がまた増強 されてい た。ー方 、92kDaのタイ プIVコラゲナ ーゼ(MMP ‑9）活性は、QR‑32癌細胞でも高 くQRsPおよびQRsP/PSKネ田胞株｜珂に若干の高低はあるものの転移能亢進との棚関性は観察 され な か った 。 また 、TIMP‑1とTIMP‑2の発 現にも変 化が認めら れなかっ た‥3）ゼ ラチ ンスボン ジと共に 皮下移植 し増殖して きた腫瘍 組織中のMn‑SOD蛋白量は 、無処遣群に比 ベPSK投与群 で有意に 増加した 。4）移植後14日目の腫 瘍組織中 の炎症サ イトカインの発 現 は 、PSK投 与 群 でIFN‑yが 増 強さ れ 、逆 にTGF．ロ が 抑制 さ れ てい た 。TNF‑aおよ び ILl‑ は、PSK投 与により 変化しな かった。同 様の検urを 移植7日目 と21日目に も行った が、PSK投与によるサイト、カイン発現の変動は14日目の成績とほぼ一致していた．．，5）培 養QR‑32癌細胞 のMn‑ SOD産生量 はPSK(lOOmg/ml）直接処理によっては増強されず、PSK投 与により 腫瘍組織 中発現が増強されたIFN‑y（100 U/ml)で単独添加培養した場合には、未 処理QR‑ 32癌細 胞に比べ て50％しか増加されなかったが、IFN‑y (lOU/mlあるぃは50U/ml) とTNF‑a(50U/ml)を同時 添加培養 すると4〜5倍増加した 。一方、QR癌細胞のMn‑ SOD産生 量はPSK投与 群で発現 が抑制さ れたTGF‑ロの処 理(lng/mlあるい は10ng/ml)により、それ ぞれ未処理QR‑32癌細胞に比べて50%あるいは20％に抑制された。
考 察
本 研究の成 績は、ゼ ラチンスポンジなど異物共存下に増殖することによる癌細胞の悪性 化 進展が、 免疫賦活 剤PSK投与により抑制されることを示している。しかも、ets癌遺伝子 フ ん ミ リー に 属す る 転 写因 子EIAFの活性 化もPSK投与 によって 抑制され た。この 悪性化 進 展 にと も な って 活 性 化さ れ るEIAFは 、MMP．1、MMP‑3、MMP．9な どマ ト リッ ク ス メ タ ロプロテ アーゼ遺 伝子の発現 を増強することが知られている。本研究においては肺転移 能 亢 進が 見 ら れた 株 で 、EIAF発 現 とMMP‑2活性 が 平行 し て 増強 さ れて い る が、EIAFが MMP ‑2遺 伝 子 発 現 に 対 す る 直 接 作 用は ま だ 観察 さ れて い な い。 し かし 、MTl‑ MMPが MMP‑2を活 性 化す る こ とが 既 に知 ら れ てお り 、 今回 観 察さ れ たMTl‑ MMPとMMP‑2の平 行 し て 増強 さ れ る実 験 結 果か ら 、EIAFがMTl‑ MMPを 介し てMMP‑2を 活 性化 し 、癌 細 胞 の 転移能を促進するものと考えられる。
癌 細胞の悪 性化進展 を抑制する 機構に関 連して、PSK投与により腫瘍組織で増強される 抗 酸化酵素Mn‑SOD産生が注 目される。 岡田らは 、invivo、in vitroの実験においてQR‑32 癌 細胞の異 物と同時 皮下移植す ることによる悪性化進展には異物反応細胞が放出する活性 酸 素が関与 すること を報告して いる。ま た、QR‑ 32癌細 胞にMn‑ SODを遺伝子導入し過剰 発 現させる と、ある いは腫瘍組 織中に抗酸化酵素を誘導すると、異物による悪性化進展が 抑 制され ることも 報告してい る。本研 究で明か になったPSK投与が腫 瘍組織で のMn‑ SOD 産 生量を増 加させ、 活性酸素が 要因となる悪性化進展を抑制していることは既報の実験成 績 と一致す る。一方 、PSKは免疫賦 活剤とし て種々の サイトカイン産生を促進することが 報 告され ている。 今回の実験 成績もPSK投 与マウス に増殖し てきた腫 瘍組織で はIFN‑yの 増 強 とTGF‑ロ の 減 弱が 観 察 され た。また 、培養QR‑32癌 細胞のMn‑ SOD産 生量はIFN‑yと TNF‑ と の共 同 作 用で 増 加 し、TGF‑口により 減弱した が、PSKによ る直接処 理では変 化 し なかっ た。これ らの成績は 、PSKが本来 の免疫賦 活作用を 介して、 癌細胞のMn‑ SOD産 生量を増強させ活性酸素が関与する悪性化進展を抑制していることを示唆している。以上、
本 研究はす でに免疫 賦活剤とし て臨床的 にも癌治 療に広く 用いられているPSKの臨床効果
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学位論文審査の要旨
学位論文題名
マウス癌細胞の悪性化進展の免疫賦活剤による抑制機序 としての l¥/Ianganese Superoxide Dismutase の誘導
癌細胞が強い増殖能や浸潤・転移能を獲得する悪性化進展を抑制する手段を開発するこ とは発癌の予防と共に重要である。本研究は癌細胞の悪性化進展の免疫賦活剤PSKによる 抑制機序を、C57BL／6マウスの退縮型（QR‑ 32）癌細胞を実験モデルとして解析したも のである。実験計画はQR‑32癌細胞の悪性化進展が異物反応細胞から産生される活性酸 素により促進されるという既報の成績に基づぃて組み立てられた。異物ゼラチンスポンジ 共存下で同系マウスに増殖する癌細胞の悪性化進展とそれに付随する転写因子EIAF発現 お よぴmatrix metalloproteinase（MMP）産生を検索することにより確認し、悪性化 進展過程にある腫瘍組織中の抗酸化酵素産生量の観点から、悪性化進展の免疫賦活剤PSK による抑制機序を解析した。
実験の結果、1）QR‑32癌細胞を無処置マウスにゼラチンスポンジと共に皮下移植し 増殖してきた腫瘍から樹立した細胞株（QRsP）の6系中6系（100％）が悪性化進展をおこし て いたのに対 して、PSK投与マウスに増殖してきた腫瘍から樹立した細胞株（QRsP／ PSK）では、6系中3系（50％）しか悪性化進展を起こしておらず、PSKにより悪性化進展 の抑制が確認された。2）悪性化進展に伴い肺転移能を獲得した細胞株、5株のQRsPお よ ぴ2株 のQRsP／PSKで はEIAF、MTl‑ MMPの 発現 の 増強 がNorthern blottingに よ り、また、72kDaのtype IV collagenase（MMP‑2）活性の増強がザイモグラムによ り 確 認さ れ た 。一 方 、92kDaのtype IV collagenase（MMP‑9）活性は 、QR‑32癌細 胞 でも高くQRsPおよぴQRsP／PSK細胞株間に若干の高低はあるものの転移能亢進との 相関性は観察されなかった。また、Tis suein hibitorofmat rixmet allop rot ein ‑ ase（TIMP）の発 現をRT‑ PCR法 により検索 したが、TIMP‑1およぴTIMP‑2とも変化が 認められなかった。3）ゼラチンスポンジと共に皮下移植し増殖してきた腫瘍組織中の Mn‑SOD蛋 白 量を 抗Mn‑SOD抗 体 用い たWestern blotting法 によ り 検索 し た が、 無 処 置群に比ベPSK投与群で有意に増加した。4）PSK投与により腫瘍組織中に発現・産
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