博士（医学） 渡邊郁剛 学位論文題名
分子イメージングを用いた糖尿病治療薬の体内動態解析 及び薬効評価に関する研究、
学位 論文内容の要旨
糖尿病はインスリンの作用が不足することによって，血糖値が高い状態が持続する疾患 である，糖尿病の進行に伴い，重篤な合併症を引き起こすことから，個々の患者に合わせ た個別化治療が望まれる，個別化治療において有用な情報を得るためには，個々の患者に おける糖尿病治療薬の体内動態，病態及び治療効果を評価する必要がある．分子イメージ ングは，生体内における生命現象の分子及び細胞レベルのプロセスを生きた状態で可視化 する技術であり，近年，個別化治療の実現において高く期待されている．本研究では，分 子イメージングを用いた個別化治療を目指して，糖尿病治療薬の体内動態解析及び薬効評 価に関する研究を行った，
1 ．分子イメージングを用いた糖尿病治療薬の体内動態解析に関する研究：ガンマカメラを 用いた糖鎖修飾 GLP‑1 の組織分布解析
【背景及び目的】糖尿病治療薬として望まれているGlucagon −like peptidel(GLP −1 ）は，
糖鎖修飾により血糖降下作用が向上することが糖尿病モデル動物において報告されている，
本研究では， GLP ―1 の体内動態に及ばす糖鎖修飾の影響を精査することを目的に，ガンマ カメラを用いて糖鎖修飾GLP‑1 の組織分布解析を実施した，
【対象及 び方法】 GLP‑1 及 び糖鎖修 飾GLP − 1 の 放射性 ヨウ素標識は，クロラミンT 法によ り行った ．23I 標 識 GLP ― 1 及 び糖鎖修飾GLP 一 l をラットに尾静脈内投与し，ガンマカメラ
（E ―CAM ， Siemens 社製）を用いて非侵襲的に撮像した後，得られた画像に関心領域を設定 した．ま た， 1251 標 識GLP‑1 及 び糖鎖修飾GLP ―1 をラットに尾静脈内投与後，所定時間に 血液及び 組織を採 取し， 血漿中ト リク口 ロ酢酸(TCA) 不溶 画分（未 変化体 等の高分子成 分）及び組織中の放射能濃度を測定した．得られた測定値を用いて，投与後60 分間の血漿 中 TCA 不溶 画 分 及び 組 織 中放 射 能 濃度 の 時 間放 射 能 曲 線下 面 積 (AUC) 比 を 算 出した，
【結果及ぴ考察】1231 標識GLP − 1 は肝臓に高く集積したが，23I 標識糖鎖修飾GLP ― 1 は1231 標識GLP ー1 と 比べ， 肝臓のAUC 比が 89% まで 有意に低 下した．これらの結果は 1251 標識体 による組織摘出法の結果とよく合致した．また，糖鎖修飾していないものと比ベ，123I 標 識糖鎖修 飾GLP − 1 の 血漿中TCA 不溶 画分放射 能のAUC 比は1 ．7 倍有意に高く，肝臓への分 布の低下が起因していると考えられた．
【小括】GLP ―1 を糖鎖修飾することにより，代謝組織である肝臓への放射能の分布が有意 に低下し，血漿中TCA 不溶画分の放射能濃度が上昇した．
2 ．分子イメージングを用いた糖尿病治療薬の薬効評価に関する研究：99mTc 標識アネキシ ンA5 を用いた膵ロ細胞のアポ卜ーシスイメージング
【 背景及び 目的】1 型糖尿病では病態の進行に伴い，膵ロ細胞が消失すろ，この膵ロ細胞
の消失にはアポ卜ーシスが関与していることから，膵ロ細胞のアポ卜ーシスを非侵襲的に
検 出 で き れ ば ， 糖 尿 病 の 早 期 診 断 及 び 治 療 効 果 評 価 に 役 立 っ と 考 え ら れ る ， し か し な が ら ， 臨 床 応 用 に 適 し た 画 像 化 の 試 み は 未 だ な さ れ て い な い ， 本 研 究 で は ， 膵 ロ 細 胞 の ア ポ ト ー シ ス の 定 量 化 に お け る ， ア ポ ト ー シ ス の プ ロ ー ブ で あ る99nTc標 識 ア ネ キ シ ンA5の 有 用 性 を 検 証 す る た め に ，1型 糖 尿 病 モ デ ル で あ る ス 卜 レ プ ト ゾ ト シ ン(STZ)処 置 マ ウ ス 及 び NODマ ウ ス を 用 い て 検 討 し た ，
【 対 象 及 び 方 法 】Balb/cマ ウ ス （ 雄 性 ，10週 齢 ） にSTZ（120あ る い は200 mg/kg，n=5)を 単 回 腹 腔 内 投 与 す る こ と に よ り1型 糖 尿 病 モ デ ル を 作 製 し た ． ま た ， 自 然 発 症 型 の1型 糖 尿 病 モ デ ル と し て ，5，9，16及 び20週 齢 の 雌 性NODマ ウ ス （ 各 週 齢n二 ニ5−8） を 用 い た ． マ ウ ス に99mTc標 識 ア ネ キ シ ンA5（18.5MBq/マ ウ ス ） を 静 脈 内 投 与 し ， 投 与 し た6時 間 後 に 膵 臓 を 摘 出 し ， 膵 臓 の 凍 結 切 片 を 作 製 し た 後 ， オ ー 卜 ラ ジ オ グ ラ フ イ ， イ ン ス リ ン 免 疫 染 色 及 びTUNEL染 色 を 実 施 し た ． 得 ら れ た デ ー タ を ， 膵 ラ 氏 島 の 面 積 で 補 正 し た 放 射 能 量 (%ID*lOE6/mm2/kg)あ る い は TUNEL陽 性 細 胞 数 (cells/mm2)で 表 示 し た ，
【 結 果 及 び 考 察 】STZ (200 mg/kg)処 置 マ ウ ス の 膵 ラ 氏 島 に 対 す る99mTc標 識 ア ネ キ シ ン A5の 集 積 量 は 対 照 マ ウ ス に 比 べ ， 有 意 に 高 か っ た (2.5土 0． 7vsO． 7土 0．1 yoID*lOE6/mm2/kg p<0. 01） ．NODマ ウ ス を 用い た 検 討 に おい て ，99 Tc標 識 ア ネキ シ ン A5の 膵 ラ 氏 島 へ の 集 積 は ，16週 齢 のNODマ ウ ス に お い て 最 も 高 く ，16週 齢 のNODマ ウ ス の 膵 ラ 氏 島 に 対 す る99mTc標 識 ア ネ キ シ ンA5の 集 積 量 は5週 齢 のNODマ ウ ス に 比 べ ， 有 意 に 高 か っ た （1．1土0．4 vsO．5土O．1％ID*lOE6/mm2/kg，p<0. 01） ．TUNEL陽 性 細 胞 はSTZ (200 mg/kg)処 置 マ ウ ス の 膵 ラ 氏 島 に お い て 多 く 観 察 さ れ ，STZ (200 mg/kg)処 置7ウ ス の 膵 ラ 氏 島 に お け るTUNEL陽 性 細 胞 数 は 対 照 マ ウ ス に 比 べ ， 有 意 に 多 か っ た （1170土535 vs5土6cells/mm2，p<0. 01） ，NODマ ウ ス を 用 い た 検 討 に お い て ，TUNEL陽 性 細 胞 は ，16 週 齢 のNODマ ウ ス の 膵 ラ 氏 島 に 多 く 観 察 さ れ ，5週 齢 のNODマ ウ ス に 比 べ 有 意 に 多 か っ た
（152土82 vs.4土9cells/mm2，p〈0．05） ， さ ら に ，STZ処 置 マ ウ ス 及 びNODマ ウ ス に お い て ， 膵 ラ 氏 島 に お け る99mTc標 識 ア ネ キ シ ンA5の 集 積 量 は ，TUNEL陽 性 細 胞 数 と 正 の 相 関 を 示 し た(STZ処 置 マ ウ ス ：=:0．821，p<0. 001，NODマ ウ ス ：F0．721，p<0. 001） ．
【 小 括 】99mTc標 識 ア ネ キ シ ンA5は ， ア ポ 卜 ー シ ス を 惹 起 し た1型 糖 尿 病 モ デ ル マ ウ ス の 膵 ラ 氏 島 に 高 く 集 積 し ， そ の 集 積 量 は TUNEL陽 性 細 胞 数 と 正 の 相 関 を 示 し た ．
【 結 論 】 第1の 研 究 で は ，GLP−1を 糖 鎖 修 飾 す る こ と に よ り ， 代 謝 組 織 で あ る 肝 臓 へ の 放 射 能 の 分 布 が 有 意 に 低 下 し ， 血 漿 中TCA不 溶 画 分 の 放 射 能 濃 度 が 上 昇 す る こ と を 示 し た ． こ れ ら の 結 果 か ら ， 糖 尿 病 モ デ ル 動 物 に お け る 糖 鎖 修 飾GLP―1の 血 糖 降 下 作 用 の 機 序 を 部 分 的 に 説 明 で き る と と も に ， 糖 鎖 修 飾 は ペ プ チ ド の 肝 移 行 を 回 避 す る た め に 有 用 な 手 段 で あ る と 考 え ら れ る ． 第2の 研 究 で は ，99 Tc標 識 ア ネ キ シ ンA5は ， ア ポ ト ー シ ス を 惹 起 し た 糖 尿 病 モ デ ル マ ウ ス の 膵 ラ 氏 島 に 高 く 集 積 す る こ と を 示 し た ． こ の 結 果 か ら ，99mTc標 識 ア ネ キ シ ンA5は1型 糖 尿 病 に 起 因 す る 膵 ロ 細 胞 の ア ポ ト ー シ ス を 検 出 で き る プ ロ ー ブ と し て 有 用 で あ る 可 能 性 が 示 さ れ た ． 以 上 の 研 究 結 果 か ら ， 分 子 イ メ ー ジ ン グ を 用 い て ， 糖 尿 病 治 療 薬 の 体 内 動 態 解 析 及 び 薬 効 評 価 を 行 い ， 生 き た 状 態 で 医 薬 品 の 薬 効 機 序 の 解 明 及 び 糖 尿 病 の 病 態 を 評 価 で き る 可 能 性 を 示 し た ． 今 後 ， 分 子 イ メ ー ジ ン グ を 用 い て ， 糖 尿 病 治 療 薬 の 体 内 動 態 ， 病 態 及 び 治 療 効 果 を 評 価 す る こ と に よ り ， 糖 尿 病 の 個 別 化 治 療 に お い て 有 用 な 情 報 を 提 供 で き る と 考 え ら れ る ．
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学位 論文審査の要旨 主査 副査
副査 副査
教授 教授 教授 教授
三輪 久下 趙 石川
学 位 論 文 題 名
聡一 裕司 松吉 正純
分子イメージングを用いた糖尿病治療薬の体内動態解析 及び薬効評価に関する研究
申請 者は，論文の前半では，分子イメージングを用いた糖尿病治療薬の体内動態解析に関する 研究を 行い， GLP ―1 を糖鎖修飾することにより，代謝組織である肝臓への放射能集積が有意に低 下し， 血漿中 TCA 不溶画分の放射能 濃度が上昇することを示した．この結果から，糖尿病モデル 動物に おける糖鎖修飾 GLP ー1 の血糖降下作用の機序を部分的に説明するとともに，糖鎖修飾はべ プチド の肝移行を回避するために有用な手段であると述べた．論文の後半では，分子イメージン グを用いた糖尿病治療薬の薬効評価に関する研究を行い，99mTc 標識アネキシンA5 がアポトーシス を惹起した1 型糖尿病モデルマウスの膵ラ氏島に高く集積することを示した．この結果から， 99mTc 標識ア ネキシンA5 は1 型糖尿病に起 因する膵p 細胞のアポトーシ スを検出できるプローブとして 有用で あると述べた．上記の研究成果より，分子イメージングを用いて，糖尿病治療薬の体内動 態，診 断及び薬効評価を実施することにより，糖尿病における創薬研究及び個別化治療に有用な 情報を提供できると報告した，
石川教授から，ベプチドの放射標識に1231 及び 1251 を用いた理由を問われ，1231 及び1251 の半減 期 はそ れぞれ約 13 時間及 び約60 日であり，実験時間の制限があることから，in vivo イメージ ングに は 1231 を用い，組織摘出法には125l を代用したと回答した．また，小動物PET/SPECT/CT 装 置（Inveon (SIEMENS 社））を用いた膵ロ細胞のアポ卜ーシスのin vivo イメージングの実現可能 性について問われ，マウス膵臓の画像化における感度不足の懸念があること，99mTc 標識アネキシ ン A5 は 膵臓の周辺組織（肝臓，腎臓及び脾臓）に高く集積することから，99mTc 標識アネキシン A5 を用 いたマウスの検討は困難であり，他のアポトーシスプ口ープによる実現可能性を検討する 必要があると回答した．
趙教 授から，GLP ― 1 の糖鎖修飾による肝臓集積の低下率及び薬効向上の関係について質問があ り，体 内動態解析及び薬効評価に用いたぺプチドの投与量を同じに設定したことから，本研究で 得られ た肝臓集積の低下率が薬効向上の程度を反映していると 推察されるが，実験動物の種差
（体内動態解析：ラット，薬効評価：マウス）があることから，今後の検討課題として確認する必 要があると回答した．また，糖鎖修飾GLP ―1 の選択について問われ，本研究に用いた糖鎖修飾GLP ー1
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は 糖 鎖1つ の 修 飾 体 の 中 で 薬 効 が 最 も 向 上 し た 修 飾 体 で あ り ， 糖 鎖2つ の 修 飾 体 と 比 ベ 薬 効 が 劣 る と 既 報 に 報 告 さ れ て い る が ， 実 験 必 要 量 の 確 保 も 考 慮 し ， 総 合 的 に 本 修 飾 体 を 選 択 し た と 回 答 し た ．
三 輪 教 授 か ら ， 肝 臓 に お け るGLP−1の 結 合 様 式 に つ い て 質 問 が あ り ，GLP―Lの 結 合 様 式 に は ， GLP―1受 容 体 へ の 特 異 的 結 合 及 び 脂 溶 性 な ど の 非 特 異 的 結 合 が あ り ， さ ら に 糖 鎖 修 飾 は 特 異 的 結 合 に は 影 響 を 与 え る こ と な く ， 非 特 異 的 結 合 を 低 下 さ せ る と 考 え ら れ る こ と か ら ，GLPー1の 糖 鎖 修 飾 に よ る 肝 臓 集 積 の 低 下 は 非 特 異 的 結 合 の 低 下 が 要 因 で あ る と 回 答 し た ． ま た ，GLP―1の 排 泄 機 序 に つ い て 問 わ れ ，GLP−1は 分 子 量 が 約3300 Daで あ る こ と か ら ， 腎 排 泄 （ 糸 球 体 ろ 過 ） を 介 し た 尿 排 泄 が 主 で あ り ， 本 実 験 に お い て 腎 臓 に お け る 残 留 は 観 察 さ れ な か っ た と 回 答 し た ． ま た ， マ ウ ス に99mTc標 識 ア ネ キ シ ンA5を 投 与 し た 後 の 膵 臓 摘 出 の 時 点 設 定 に つ い て の 指 摘 が あ り ， 本 研 究 で は 既 報 を 基 に1時 点 （6時 間 ） を 設 定 し た が ， ア ポ ト ー シ ス の 頻 度 及 び プ 口 ー ブ の 集 積 の バ ラ ン ス を 考 慮 し ， 評 価 に 適 し た 時 間 を 設 定 す る た め に は ， 他 の 時 点 も 検 討 す る 必 要 が あ り ， 今 後 の 検 討 課 題 と す る と 回 答 し た ，
久 下 教 授 か ら ，1型 糖 尿 病 患 者 に お け る 膵B細 胞 の ア ポ ト ー シ ス の 評 価 時 期 に つ い て 問 わ れ ，1 型 糖 尿 病 患 者 に お け る 膵p細 胞 の ア ポ ト ー シ ス の 頻 度 は 疾 患 モ デ ル マ ウ ス と 比 ベ ， 少 な い 可 能 性 が あ り ，1型 糖 尿 病 患 者 のin vivoイ メ ー ジ ン グ に お け る 重 要 な 課 題 で あ る と 回 答 し た ， ま た ， 三 輪 教 授 と 同 じ く ， マ ウ ス に99mTc標 識 ア ネ キ シ ンA5を 投 与 し た 後 の 膵 臓 摘 出 の 時 点 設 定 に つ い て の 指 摘 が あ り ， 今 後 ， 膵 ロ 細 胞 の ア ポ ト ー シ ス を 評 価 す る た め の 最 適 な 時 点 を 検 討 す る 必 要 が あ る と 回 答 し た ．
本 論 文 の 前 半 はAnnals of Nuclear Medicine誌 に て 高 く 評 価 さ れ ， 後 半 はJournal of Nuclear medicine誌 に て 査 読 中 で あ る が ，1型 糖 尿 病 の 診 断 及 び 治 療 に 寄 与 す る こ と が 期 待 さ れ る ． 審 査 員 一 同 は ， こ れ ら の 成 果 を 高 く 評 価 し ， 大 学 院 課 程 に お け る 研 鑽 や 取 得 単 位 な ど も 併 せ 申 請 者 が 博 士 （ 医 学 ） の 学 位 を 受 け る の に 充 分 な 資 格 を 有 す る も の と 判 定 し た ．
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