博 士 （ 歯 学 ） 本 郷 哲 也
学 位 論 文 題 名
B:N/IP 一 2 処理し た象牙質表面における
セ メ ン ト 質 様 硬 組 織 形 成 の ビ スフ オス フ ォネ ート に よる 抑制
学 位 論 文 内 容 の 要 旨
緒言
近 年 ， 様 々な 成 長 因 子を 歯 周 組 織再 生 療 法 に応 用 す る 研究 が 行 われ ている 。特にBone morphogenetic protein−2(BMPー2）は骨芽細胞に対する強カな分化誘導作用や骨誘導能を有することが明らかになっており，
歯槽 骨の再生 への有 効性が 報告されている。Miyajiら，天雲らはBMP―2で処理した象牙質片をラット結合組織 に移 植し，象 牙質上 にセメ ント質様硬組織が形成され，この硬組織の形成には象牙質面の吸収を伴わずにセメ ント質様硬組織が形成される場合と，象牙質の吸収窩にセメント質様硬組織が形成される場合があることを報告 している。
一般に，骨組織では破骨細胞と骨芽細胞のカップリング現象によってりモデリングが行われていることが知られ てい る。BMPー2は骨芽 細胞の 分化誘 導だけで なく， 破骨細 胞の発 現を活 性化し，破骨細胞前駆細胞に直接作 用し て破骨細 胞の吸 収能を 活性化させることが報告されている。また，BMP−2による破骨細胞の発現と吸収能 は， 濃度依存 的，経 時的に 活性化することも報告されている。したがってBMPー2による硬組織形成は，骨芽細 胞の分化誘導を直接的に引き起こすだけでなく，破骨細胞と骨芽細胞が関与したカップリングによるりモデリン グも 重要な因 子とな ってい る可能性が考えられ，これを解明することはBMP一2を用いた再生療法を発展させる ために重要と考えられる。
ビスフオスフォネートは，一般に分化した破骨細胞に取り込まれて不活性化することで破骨細胞の機能を抑制 し，骨吸収抑制作用を発揮することが明らかになっている。したがって，ビスフオスフォネートで破骨細胞を抑制 す る こ と に よ り ，BMP−2に よ る 硬 組 織 形 成 に お け る 破 骨 細 胞 の 関 与を 明 ら か にで き る と 思わ れ る 。 本研究の目的は，ラットにビスフオスフォネートを投与して破骨細胞の機能を抑制し，BMP−2処理した象牙質 表面 における セメン ト質様 硬組織形成や象牙質吸収がどのような影響を受けるかを組織学的に評価することで ある。
材料と方法
1）試験片の作製
Wistar系雄性ラットより採取した切歯を，エナメル質，セメント質を除去し，歯根中央部付近の象牙質から砥石 を 用い てlXlX 0.3mmの 大き さ で180個 を作 製 し た 。作 製 し た 象牙 質 片 は24％EDTA(pH7.0)で3分 間脱灰 処理した後，数回洗浄した。その後，象牙質片を洗浄し，0，100および400 Ug/mlの濃度に調製したりコンビ ナ ン ト ヒ トBMP―2（ ア ス テ ラ ス 製 薬 株 式 会 社 ， 東 京 ） 溶 液 に10分 間 浸 漬 処 理 し た 。 2）ビスフオスフォネートの調整と投与方法
ー681―
10週 齢 のWistar系 雄 性 ラ ッ ト を 実 験 群90匹 と 対 照 群90匹 に 分 け ， 実 験 群 に は 手 術2週 間 前 よ ル ビ ス フ オ ス フ ォ ネ ート （ イ ン カ ド ロネ ー ト ，1皿g/kg/day， アス テ ラ ス 製 薬株 式 会 社 ， 東 京） を1週間 に3回の頻 度で 観察期 間終 了 ま で 腹 腔 内 投 与 を 継 続 し て 行 い ， 対 照 群 は 生 理 食 塩 水 を 同 様 に 腹 腔 内 投 与 し た 。 3） 象 牙 質 片 の埋 植 手 術 方 法
全 身 麻 酔 下 で 口 蓋 粘 膜 を 部 分 層 弁 で 剥 離 し ， 口 蓋 部 結 合 組 織 内 にBMP−2処 理 し た 各 象 牙 質 片 を 移 植 し て 縫 合 した 。
4） 病 理 組 織 学的 観 察 と 組 織学 的 計 測
2，4，8週の 観 察 期 間 終 了後 に ， 移 植 象牙 質 片 と 周 辺組 織 を1塊 とし て 摘 出 し ，通 法 に 従 い パ ラフ イ ン 包 埋を行 っ た 。 そ の 後 ， 前 頭面 断 で 厚 さ5umの 連 続切 片 を 作 製 し ，ヘ マ ト キ シ リン ・ エ オ ジ ン重 染 色 と 酒 石酸 耐 性 フ オ ス フ ァ タ ー ゼ(TRAP)染 色 お よ び ， オ ス テ オ カ ル シ ン免 疫 染 色 を 行い ， 光 学 顕 微鏡 下 に て 組 織学 的 観 察 を 行 った 。 オ ス テ オ カ ル シ ン 免 疫 染 色 は ， ヒ ス ト フ ァ イ ンSAB−PO(M)キ ッ ト （ ニ チ レ イ ， 東 京 ） を 用 い て 行 っ た 。 組 織 学 的 計 測 に は 連 続 切 片 中 央 部 の 標 本 と そ の 前 後200pm離 れ た 標 本 の3枚 を 選 択 し ， 象 牙 質 吸 収 率 ， 総 硬 組 織 形 成 率 ， 吸 収 形 成 率 ， 非 吸 収 形 成 率 ， 吸 収 面 に 対 す る 吸 収 形 成 率 ， 非 吸 収 面 に 対 す る 非 吸 収 形 成 率 ，TRAP陽 性 細胞 数 を 計 測 した 。
各 測 定値 の 統 計 学 的 分析 に は ，Mann―Whitneyの び 検 定 を 用い た 。
結 果
1）組 織学的 観察 結果
BMP‑2濃 度Oロg/mlでは す べ て の 観察 期 間 で 実 験群 、 対 照 群 と も象 牙 質 ヒ ヘ の硬 組 織 黼 まな く、象 牙質 表面の 吸 収 はき わめて 表在 性でそ の量も わずか であ った。 一方、BMP・2濃 度100，400〃〆尚 では 、対照 群にお いて象 牙質表 面 の 吸収 は経時 的に進 行し、4，8週 では一 部の吸 収面に 有細 胞陸の セメン ト質様飃鬮簡の形成が見られ、周囲には骨芽細 胞 様細 胞、破 骨細胞 様細胞 が観察 され た。実 験群で は吸収 面へ のセメ ント質様硬組織の形成は少なく、骨芽細胞様細胞 も わ翻 ゝであ っt彩頂非 吸収面 へ伽離 脚滅は 両群 とも同 様に観 察され た。
2）組 織学的 計測 結果
象 牙 質 吸 収率 はBMP・2濃 度O肛g/mlで は4、8週 後 の実 験 群 で4〜5％ で あ り 、対 照 群 が7〜8％ で 実 験 群が 有 意 に 低 く（P＜O．01） 、BMP‑2濃度100p g/mlでは2、4、8週後 に対照 群が15〜 20％なのに対し、実験群は5^‑10％で，400皿 g／Hdで は4，8週後に 対照群 が33〜45％程 度で， 実験群 は15％程度で対照群に比較して有意に低カめたくP〈0．01冫。硬 組 織 形 成 率 はBMP12濃 度100ロg/Hdの 対 照 群 で は4週後 で15％、8週 後 で35％ で あ っ たの に 対 し 、 実験 群 で は4及 び8週 後 で10％ 程 度 で あり 、400弘g/Inlで は8週 後で 対 照 群 が12％ で あり ，実験 群が5％で 対照群 に比 較して 有意に 低 うゝ った（P〈0．01）。吸 収面の硬組織形成率は実験群が有意に低うめたが非吸収面では有意差がなかった。TRAP陽陸 綱 包率 はBMP・2濃 度0、100皿飢mの全 実験 期間で 両群問 に有意 差はな かっ た。
考 察
BMP―2濃 度0ug/mlの ビ ス フ オ ス フ ォ ネ ート を 投 与 す ると ， 投 与 し な かっ た 場 合 に 比較 し て 象 牙 質吸 収 は 有 意 に 少 なか っ た 。 し た がっ て ビ ス フ オス フ ォ ネ ー トは 破 骨 細 胞 様細 胞 の 機 能 を 十分 に 抑 制 し てい た と 考えら れた。
本 研 究 の 結 果 ，BMP―2を 塗 布 し た 象 牙 質 表 面 に お け る セ メ ン ト 質 様 硬 組 織 形 成 は 象 牙 質 が一 層 吸 収 さ れ た 後 に 硬組 織 が 形 成 さ れて い る も の と， 吸 収 さ れ てい な い 象 牙 質表 面 に 硬 組 織 が形 成 さ れ て いる も の が観察 され，
Miyajiら 天 雲 ら の 報 告 に 一 致 し て い た 。 総 硬 組 織 形 成 の う ちBMP−2濃 度100 Ug/mlの 対 照 群 で は 非 吸 収 面 の 硬 組 織 形 成 は20％ 程 度 ， 吸 収 面 の 硬 組 織 形 成 は80％ 程 度 で あ り ，BMP―2濃 度400 Ug/mlの 対 照 群 で は 非 吸 収 面 の 硬 組 織 形 成 は30％ 程 度 ， 吸 収 面 の 硬 組 織 形 成 は70％ 程 度 で あ っ た こ と か ら ，BMP―2処 理 し た 象 牙 質 ―682―
表 面 の 硬組 織 形 成 には 破 骨 細 胞様 細 胞 に よる 象 牙 質 面の 吸収 が大き く関与 してい ることが 示唆さ れた。
BMP―2による 象牙質 表面の セメン ト質様 硬組織 形成は ，吸収面 に形成される硬組織が大部分を占めている ことが明らかになり，さらにビスフオスフォネート投与によって破骨細胞様細胞の機能を抑制することで象牙質吸 収 面の硬 組織形成 が抑制されたことから，BMP―2によるセメント質様硬組織形成は破骨細胞様細胞が重要な役 割を有することが示唆された。
―683―
学位 論文審査の要旨
学 位 論 文 題 名
BMP ― 2 処理した象牙質表面における
セメント質様硬組織形成のビスフオスフオ不ートによる抑制
審 査 は 主 査 、 副査 全員 が 一同 に会 して 口 頭で 行っ た。 はじ め に申 請者 に対 し、 本 論文 の要 旨の 説明を求めたところ、以下の内容について論述した。
これまで我々は、BMP一2を塗市した象牙質片をラット結合細織内に移植すると、吸収されていない象牙質 表面に硬組織が 形成されているものと、象牙質が一層吸収された後に硬組織が形成されるものが観察され たことを報告した。また骨形成は吸収と形成のカップリングが重要であり、bisphosphonateは吸収を担う破骨 細胞の細胞骨格 の破壊やアポトーシスを誘 導することが明らかになっている。したがって、破骨細胞も bisphosph（ma也によって抑制され、BMP‐2による象牙質吸収のみならず硬糸□織形成にも影響を及ぼす可能 性がある。本研 究では、bi軸osphon眦をラットに投与することで、BMP一2で処理した象牙質を移植した場 合の硬組織形成と象牙質吸収に与える影響を組織学的に評価した。
ラット象牙質 から試験片（1X1XO．3mm） を180個作製、24％E［）1A（pH7）で3分間脱灰処理し3群に分 け、60個は100弘g/m1に調整したrhBMP‐2溶 液（アステラス製薬）、60個は400ロg／mlの雨BMP‐2溶液，
最 後の60個 は0Hg/m1のlhBMP‐2溶液に10分間浸漬処理した。ウィス ター系ラット（10週齢）180匹を2 群にわけ、実験群はインカドロネート（アステラス製薬）を1Hg/kg/日、3回/週、腹腔より投与し、観察期間 終了まで継続し た。対照群は生理食塩水を 同様に投与した。投与開始2週間後にラットの口蓋部結合細織 内 に各 試験 片を 埋随 し た。2、4、8週後 に通法に従い組織標本を作 製してHE重染色およびTRAP染 色を 行い、組織学的 観察を行うとともに、象牙質上に形成された硬組織形成率、象牙質表面の吸収率、TRAP陽 性細胞率の計測 を行うとともに、硬組織形成率は象牙質吸収面に形成された硬組織と非吸収面に形成され た 硬 組 織 に 分 け て 計 測 し た 。 各 測 定 値 の 統 計 学 的 分 析 に は 、Mann‐Whimeyリ 検 定 を 用 い た 。 象牙 質吸 収率 は実 験 群が 対照 群に 比 較し て有 意に 低か っ た（ 灰0．01）。 硬組 織形 成率も同 様に 実 験群 が対 照群 に比 較 して 有意 に低 か った （灰O．01） 。硬 組織 形 成の うち80％ 程度 が吸収面 に形 成 され 、20％程 度が非吸収面に形成され ていた。また、TRAP陽出織 包率は恥佃．−2濃度0、100、400 pg/m1の全実験期間で両群問に有意差はなかった。
以上の結果か ら、ビスフオスフォネート を投与すると、BMP‐2処理した象牙質片において破骨細胞様 細 胞の 機能 を抑 制し、象牙質の吸収が減 少するとともに、硬組織形 成も抑制することが明らかに なり −684−
光
人
明
雅
正
邦
浪
村
木
川
田
鈴
授
授
授
教
教
教
査
査
査
主
副
副
BMP‑2に よる象牙質表面への礒孫B緒囲勠戎に｜ま破骨瞭田包様細胞が重要な役害IJを有することが示唆された。
引 き 続 き 審 査 担 当 者 と 申 請 者 の 間 で 、 論 文 内 容 及 び 関 連 事 項 につ い て 質 疑 応答 が な さ れ た。 主 な 質 問 事 項と し て 、
＠24％ED′rA溶 液 を 使 用し た 根 拠
◎ 形 成さ れ た 硬 組 織を セ メ ン ト 質様 と 判 断 し た根 拠
◎ ラ ット 口 蓋 結 合 組織 の よ う に 硬組 織 形 成 能 がな い 細 胞 し か 存在 し な い と ころ に，硬 組織が 形成さ れるこ と に 対す る 考 察
＠ BMP． 2100皿 g/m1の 方 が ， 400Hg/mlよ り 硬 組 織 形 成 が 多 か っ た こ と に 対 す る 考 察
◎ ビ スフ オ ス フ ォ ネー ト の の 投 与方 法 と し て 局所 投 与 は 考 え られ る か な ど であ っ た 。
こ れ ら の 質 問 に 対 し 、申 請 者 は 適 切ぬ 説 明 に よ っ て回 答 し 、 本 研究 の 内 容 を 中心 と し た 専 門分 野 は も と よ り、 関 連 分 野 にっ い て も 十 分な 理 解 と 学 識を 有 し て い る こと が 確 認 さ れた 。本研 究はビ スフオ スフオ ネ ー ト を 投 与 す る と 、 恥 佃 ―2処 理 し た 象 牙 質 片 に お いて 、 破 骨 細 胞様 細 胞 の 機 能 を抑 制 し 、 象 牙質 の 吸 収 が減 少 す る と とも に 、 硬 組 織形 成 も 抑 制 する こ と が 明 ら かに な り 、B＾佃 ・2による 象牙質 表面 への硬 組 織 形成 に は 駿 骨 瞭田 丹 謎 赫 聞 包が 重 要 な 役 割を 有 す る こ と が示 唆 さ れ ， 歯周 組織再 生療法 への応 用に対 し て 重 要 な 指 針 を 与 え た こ と が 高 く 評 価 さ れ た 。 本 研 究 の 内 容 は 、歯 科 医 学 の 発 展に 貢 献 す る もの で あ り 、 審 査 担 当 者 全 員 は 、 学 位 申 請 者 が 博 士 （ 歯 学 ） の 学 位 を 授 与 す る の に 値 す る も の と 認 め た 。
―685 ‑
