博 士 論 文 概 要
論 文 題 目
Simple and accurate methodology for quantification of genetic markers in acute leukemias and myeloproliferative neoplasms
急性白血病と骨髄増殖性腫瘍における遺伝子マーカーの 簡便・正確な定量手法
申 請 者
Soji Morishita
森下 総司
生命医科学専攻 環境生命科学研究
2010 年 12 月
Ｎｏ.1 バ イ オ マ ー カ ー は ， 生 体 の 特 定 の 疾 病 の 存 在 や 状 態 の 指 標 と な る 物 質 を 指 し ， 核 酸 ， ペ プ チ ド ， タ ン パ ク 質 ， 脂 質 代 謝 物 等 ， 対 象 は 多 岐 に わ た る 。 な か で も 核 酸 由 来 バ イ オ マ ー カ ー （ マ ー カ ー 遺 伝 子 ） は 遺 伝 子 定 量 手 法 の 発 展 ・ 普 及 に よ り 比 較 的 簡 便 に 検 出 あ る い は 定 量 で き る た め ， 病 態 の 診 断 ， 治 療 の 予 後 予 測 ， 病 態 の モ ニ タ リ ン グ に 利 用 さ れ る な ど ， 臨 床 の 現 場 へ 着 実 に 応 用 さ れ つ つ あ る 。 こ の よ う な 試 み は ， が ん 分 野 に お い て 積 極 的 に 行 わ れ て い る が ， 特 に 血 液 疾 患 に お け る 進 歩 は め ざ ま し く ， 他 の が ん 分 野 を 常 に 牽 引 し て き た 。 例 え ば ， 慢 性 骨 髄 性 白 血 病 （c h r o n i c m y e l o i d l e u k e m i a：C M L） 患 者 の 9 0 %以 上 に ，C M L の マ ー カ ー 遺 伝 子 で あ る B C R / A B L キ メ ラ 遺 伝 子 が 存 在 す る こ と が 知 ら れ て い る 。B C R / A B L キ メ ラ 遺 伝 子 は C M L 診 断 の 極 め て 有 効 な 指 標 で あ る ば か り か ，B C R / A B L キ メ ラ 遺 伝 子 の A B L キ ナ ー ゼ ド メ イ ン に お け る 点 突 然 変 異 の 有 無 や 種 類 が 薬 剤 選 択 の 指 標 と な る た め ， 治 療 の 予 後 予 測 が 立 て や す い 。 さ ら に は ，B C R / A B L キ メ ラ 遺 伝 子 量 を 定 量 す る こ と で ， 治 療 の 経 過 を 容 易 に モ ニ タ リ ン グ で き る 。
こ れ ま で 述 べ て き た よ う に ， マ ー カ ー 遺 伝 子 は 病 態 の 診 断 ・ 判 定 の 指 標 と し て の 利 用 に 留 ま ら ず ， 治 療 の 予 後 予 測 ， 病 態 の モ ニ タ リ ン グ な ど に も 利 用 さ れ て お り ， 今 後 ， 新 た な マ ー カ ー 遺 伝 子 の 探 索 ・ 同 定 ， お よ び 同 定 さ れ た マ ー カ ー 遺 伝 子 の 検 出 ・ 定 量 技 術 は 重 要 な 位 置 を 占 め る と 考 え ら れ る 。 事 実 ， 近 年 ， 網 羅 的 な 遺 伝 子 解 析 ， ゲ ノ ム 解 析 を 可 能 と す る 様 々 な 手 法 が 確 立 さ れ ， そ れ ら を 用 い た 解 析 に よ り ， 新 た な マ ー カ ー 遺 伝 子 が 次 々 と 発 見 ・ 報 告 さ れ て い る 。 そ れ に 伴 い ， 病 態 診 断 の 拠 り 所 と し て ， ま た ， 治 療 の 予 後 予 測 や 病 態 モ ニ タ リ ン グ の 手 段 と し て ， マ ー カ ー 遺 伝 子 の 定 量 の 必 要 性 が 高 ま っ て い る 。 そ こ で ， 本 研 究 で は 造 血 器 腫 瘍 関 連 ， 特 に 白 血 病 と 骨 髄 増 殖 性 腫 瘍 の マ ー カ ー 遺 伝 子 を 定 量 す る た め の 新 規 な 遺 伝 子 定 量 技 術 の 確 立 を 目 的 と し た 。
本 論 文 は ５ 章 か ら 構 成 さ れ て い る 。 以 下 に 各 章 の 概 要 に つ い て 述 べ る 。
第 １ 章 で は ， 造 血 器 腫 瘍 の マ ー カ ー 遺 伝 子 と ， そ の 検 出 ・ 定 量 技 術 に 関 す る 既 往 の 知 見 お よ び 問 題 点 を ， 最 近 の 研 究 動 向 を 踏 ま え つ つ 概 説 し ， 本 研 究 の 研 究 背 景 を ま と め る と と も に ， 本 研 究 の 意 義 お よ び 目 的 を 明 ら か に し た 。
第 ２ 章 で は ， 白 血 病 （ 特 に 急 性 白 血 病 ） の 汎 用 マ ー カ ー 遺 伝 子 と し て 臨 床 検 査 へ 実 用 化 さ れ た W i l m s Tu m o r 1 m R N A（W T 1 m R N A） の 発 現 量 を ， 既 存 手 法 と 比 較 し ，よ り 迅 速 ，簡 便 に 定 量 す る た め の 新 た な 定 量 系 を 確 立 し た 。ま ず ，r e v e r s e t r a n s c r i p t i o n l o o p - m e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n（R T- L A M P） 法 を 用 い ， W T 1 m R N A の 迅 速 ・ 簡 便 な 定 量 系 を 構 築 し た 。 R T- L A M P 法 は r e v e r s e t r a n s c r i p t i o n p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n（R T- P C R）法 の よ う に 温 度 変 化 を 必 要 と せ ず ，等 温 条 件 下 で 対 象 遺 伝 子 を 増 幅 可 能 な 新 規 遺 伝 子 増 幅 手 法 で あ る 。ま た ，
R T- P C R 法 で は R N A の 逆 転 写 反 応 と そ の 後 の 増 幅 反 応 を 別 々 に 実 施 す る 必 要 が
あ る の に 対 し ，R T- L A M P 法 は 等 温 反 応 で あ る た め ， 逆 転 写 反 応 と 増 幅 反 応 が 同 時 に 起 こ り ， 比 較 的 短 時 間 で 反 応 が 終 了 す る と い う 利 点 を 有 す る 。 さ ら に ， 遺 伝
子 増 幅 反 応 の 副 産 物 で あ る ピ ロ リ ン 酸 マ グ ネ シ ウ ム の 生 成 量 を 濁 度 と し て リ ア ル タ イ ム に 測 定 す る こ と で ， 対 象 の 遺 伝 子 量 を 定 量 す る こ と も 可 能 で あ る 。 こ の よ う な 利 点 に よ り ，R T- L A M P 法 を W T 1 m R N A 定 量 へ 応 用 で き れ ば ， 迅 速 ・ 簡 便 な 白 血 病 の 病 態 モ ニ タ リ ン グ が 可 能 に な る と 期 待 さ れ る 。W T 1 m R N A を 特 異 的 に 増 幅 さ せ る よ う な 短 鎖 D N A オ リ ゴ （ プ ラ イ マ ー ） の セ ッ ト を 設 計 し ， そ れ ら を 用 い て R T- L A M P 法 に よ る W T 1 m R N A の 増 幅 を 試 み た と こ ろ ，1 0 コ ピ ー の W T 1 m R N A を 3 0 分 程 度 で 検 出 で き た 。さ ら に ，H e L a 株 抽 出 R N A に W T 1 m R N A を 既 知 量 混 入 さ せ た も の を 測 定 用 サ ン プ ル と し て 調 整 し ， こ れ ら サ ン プ ル 中 の W T 1 m R N A 量 を R T- L A M P 法 お よ び リ ア ル タ イ ム R T- P C R 法 で そ れ ぞ れ 定 量 し た 。 そ の 結 果 ， 両 手 法 と も 真 値 に 近 い 値 を 示 す こ と が 明 ら か と な っ た 。 こ れ ら の 結 果 に よ り ，R T- L A M P 法 は リ ア ル タ イ ム R T- P C R 法 と 同 等 の 定 量 精 度 を 持 ち な が ら も よ り 迅 速 ・ 簡 便 に 白 血 病 の 病 態 を モ ニ タ リ ン グ で き る 手 法 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た 。 つ づ い て ， よ り 正 確 な 病 態 モ ニ タ リ ン グ 実 現 の た め ， 遺 伝 子 の 増 幅 阻 害 物 質 混 入 下 で も 正 確 な 遺 伝 子 定 量 が 可 能 な 手 法 で あ る A l t e r n a t e l y B i n d i n g q u e n c h i n g p r o b e C o m p e t i t i v e（A B C）法 を R T- P C R法 と 組 み 合 わ せ（A B C R T- P C R 法 ），W T 1 m R N A の 簡 便・正 確 な 定 量 手 法 の 確 立 を 試 み た 。A B C R T- P C R 法 で は ， 対 象 と な る 遺 伝 子 と 等 し い 増 幅 効 率 で 競 合 的 に 増 幅 さ れ る 内 部 標 準 遺 伝 子 を 既 知 量 ， 反 応 系 に 添 加 し ， 反 応 を 行 う 。 反 応 系 に は グ ア ニ ン 塩 基 と の 電 子 移 動 に よ り 蛍 光 強 度 が 著 し く 消 光 す る 性 質 を 持 っ た 蛍 光 色 素 が ラ ベ ル さ れ た プ ロ ー ブ が 添 加 さ れ て お り ， 増 幅 反 応 後 の 蛍 光 強 度 が 対 象 遺 伝 子 と 内 部 標 準 遺 伝 子 の 割 合 を 反 映 す る た め ， 対 象 遺 伝 子 量 を 算 出 で き る 。 本 手 法 最 大 の 特 長 は 内 部 標 準 法 で あ る た め に 遺 伝 子 の 増 幅 阻 害 物 質 の 影 響 を 数 学 的 に 打 ち 消 す こ と の で き る 点 で あ り ， 既 存 手 法 と 比 較 し て ， よ り 正 確 な 定 量 が 可 能 と な る 。 急 性 白 血 病 患 者 ２ 名 よ り 経 時 的 に 採 取 し た 骨 髄 サ ン プ ル よ り ト ー タ ル R N A を 抽 出 し ， こ れ ら の サ ン プ ル 中 の W T 1 m R N A 発 現 量 を A B C R T- P C R 法 に て 定 量 し た と こ ろ ， 各 々 の 患 者 の 病 態 に 従 っ て W T 1 m R N A 発 現 量 が 増 減 す る 様 子 が 確 認 さ れ ，A B C R T- P C R 法 に よ り 白 血 病 の 病 態 モ ニ タ リ ン グ が 可 能 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た 。
第 ３ 章 で は ， 骨 髄 増 殖 性 腫 瘍 （m y e l o p r o l i f e r a t i v e n e o p l a s m：M P N） に お い て 2 0 0 5 年 に 報 告 さ れ た マ ー カ ー 遺 伝 子 で あ る J a n u s K i n a s e 2（J A K 2）遺 伝 子 の 点 突 然 変 異 （J A K 2 V 6 1 7 F） の ア レ ル バ ー デ ン （（ 変 異 J A K 2 遺 伝 子 量 ／J A K 2 全 遺 伝 子 量 ） 1 0 0 %） に つ い て ， 簡 便 ・ 低 コ ス ト ・ 正 確 な 定 量 手 法 の 構 築 を 行 っ た 。 第 ２ 章 に て 触 れ た A B C 法 を P C R 法 と 組 み 合 わ せ （A B C - P C R 法 ），J A K 2 ア レ ル バ ー デ ン 定 量 へ 応 用 す る こ と に よ り ， 既 存 の 手 法 と 比 較 し て ， よ り 簡 便 に 低 コ ス ト で ， か つ ， 正 確 に 対 象 の J A K 2 ア レ ル バ ー デ ン を 定 量 す る こ と が 可 能 で あ る 。 A B C - P C R 法 で は ， 増 幅 反 応 後 の 蛍 光 値 が 対 象 の ア レ ル バ ー デ ン に 依 っ て 変 化 す る た め ，P C R 法 に よ り 対 象 の D N A を 増 幅 し ， そ の 後 に 蛍 光 強 度 を 測 定 す る の み で 対 象 の J A K 2 ア レ ル バ ー デ ン を 定 量 す る こ と が 可 能 で あ る 。 ま た ， ス ル ー プ ッ
Ｎｏ.3 ト が 既 存 手 法 で あ る リ ア ル タ イ ム ア リ ル 特 異 的 P C R（ リ ア ル タ イ ム A l l e l e S p e c i f i c P C R： リ ア ル タ イ ム A S - P C R） 法 の 約 ２ 倍 で あ る た め ， ラ ン ニ ン グ コ ス ト を お よ そ 半 分 に 抑 え る こ と が で き る 。A B C - P C R 法 の 定 量 精 度 確 認 の た め ，U T- 7 株 （J A K 2 野 生 型 株 ） 抽 出 D N A と H E L 株 （J A K 2 変 異 型 株 ） 抽 出 D N A を 任 意 の ア レ ル バ ー デ ン と な る よ う に 混 合 し ， 模 擬 定 量 サ ン プ ル を 調 整 し た 。 こ れ ら の J A K 2 ア レ ル バ ー デ ン を A B C - P C R 法 と リ ア ル タ イ ム A S - P C R で 定 量 し ， そ の 値 を 真 値 と 比 較 し た 。 そ の 結 果 ，A B C - P C R 法 は ア レ ル バ ー デ ン 1 0 % ~ 9 0 %の 範 囲 に お い て リ ア ル タ イ ム A S - P C R よ り も 真 値 を よ く 反 映 し た 値 を 示 し ， リ ア ル タ イ ム A S - P C R は あ る 程 度 の 真 値 か ら の ず れ を 許 容 す れ ば ア レ ル バ ー デ ン 下 限 値 1 %ま で 定 量 可 能 で あ る と い う 結 果 を 得 た 。 こ れ に よ り ，A B C - P C R 法 は 定 量 下 限 に お い て は 既 存 手 法 に 劣 る が ， ア レ ル バ ー デ ン 1 0 % ~ 9 0 %ま で の 範 囲 で は ， 既 存 手 法 よ り も 正 確 に 対 象 の ア レ ル バ ー デ ン を 定 量 可 能 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た 。最 後 に ，
M P N 患 者 と 健 常 者 よ り 採 取 し た 血 液 サ ン プ ル よ り D N A を 抽 出 し ， そ れ ら の サ ン
プ ル 中 の J A K 2 ア レ ル バ ー デ ン を A B C 法 ， リ ア ル タ イ ム A S - P C R 法 で そ れ ぞ れ 定 量 し ， そ の 値 を 比 較 し た 。 そ の 結 果 ， ア レ ル バ ー デ ン 下 限 値 1 0 %ま で に お い て 両 者 の 定 量 結 果 に は 相 関 性 が あ っ た 。 こ れ に よ り ，A B C - P C R 法 は 既 存 手 法 と 比 較 し ，ア レ ル バ ー デ ン 1 0 % ~ 9 0 %の 範 囲 で は ，簡 便・低 コ ス ト・正 確 に 対 象 の J A K 2 ア レ ル バ ー デ ン を 定 量 で き る 手 法 で あ る こ と が 示 さ れ た 。
第 ４ 章 で は ， 第 ３ 章 に て 確 立 し た A B C - P C R 法 に よ る J A K 2 ア レ ル バ ー デ ン 定 量 の た め の 標 準 サ ン プ ル の 作 製 ・ 評 価 手 法 を 提 案 し た 。 近 年 ， 標 準 曲 線 を 用 い た 相 対 的 な 定 量 （ 相 対 定 量 ） で は な く ， 直 接 的 な 定 量 （ 絶 対 定 量 ） に よ っ て 対 象 の 遺 伝 子 数 を 測 定 す る 新 た な 手 法（ デ ジ タ ル P C R 法 ）が 確 立 さ れ た 。本 手 法 に よ り ， 対 象 の 遺 伝 子 数 や ア レ ル バ ー デ ン を 直 接 定 量 す る こ と が 可 能 で あ る が ， ラ ン ニ ン グ コ ス ト の 高 さ と ス ル ー プ ッ ト 性 の 低 さ か ら ， 定 量 系 と し て の 実 用 化 は 難 し い 。 そ こ で ，デ ジ タ ル P C R 法 を ア レ ル バ ー デ ン の 値 を 保 証 さ れ た 標 準 サ ン プ ル 作 製 の た め に 運 用 す る こ と を 考 え た 。 こ れ に よ っ て ， コ ス ト を 最 小 限 に 抑 え つ つ ， 定 量 の 正 確 性 を 担 保 で き る と 期 待 さ れ る 。 ま ず ，A S - P C R を 基 盤 と し て デ ジ タ ル P C R 法 に よ り J A K 2 ア レ ル バ ー デ ン を 定 量 で き る よ う な 反 応 条 件 を 検 討 し た 。 つ づ い て ，こ れ を 用 い て 野 生 型 J A K 2 遺 伝 子 量 と 変 異 型 J A K 2 遺 伝 子 量 を デ ジ タ ル P C R 法 で 定 量 し ， そ の 定 量 値 を も と に A B C - P C R の た め の 標 準 サ ン プ ル を 作 製 し た 。 最 後 に ， 作 製 し た 標 準 サ ン プ ル を 用 い て A B C - P C R 法 を 実 施 し ， ア レ ル バ ー デ ン の 真 値 を 忠 実 に 反 映 し た 定 量 結 果 を 得 ら れ る こ と を 確 認 し た 。
第 ５ 章 で は 本 論 文 を 総 括 し た 。
以 上 ， 本 論 文 で は 造 血 器 腫 瘍 ， 特 に 白 血 病 と 骨 髄 増 殖 性 腫 瘍 の マ ー カ ー 遺 伝 子 を 簡 便 ・ 低 コ ス ト ・ 正 確 に 検 出 ・ 定 量 で き る 手 法 の 確 立 を 行 っ た 。 本 成 果 は 今 後 さ ら に 発 見 が な さ れ て ゆ く も の と 予 想 さ れ る 種 々 の マ ー カ ー 遺 伝 子 の 検 出 ・ 定 量 へ も 応 用 可 能 で あ り ，臨 床 検 査 医 学 の 分 野 に 大 き く 寄 与 で き る も の と 期 待 さ れ る 。
早稲田大学 博士（工学） 学位申請 研究業績書
氏 名 森下 総司 印
（２０１０年１１月 現在）
種 類 別 題名、 発表・発行掲載誌名、 発表・発行年月、 連名者（申請者含む）
論文 ○
○
講演
（国際）
講演
（国内）
(1)（報文）Soji Morishita, Aya H. Koda, Keita Kirito, Norio Komatsu, Yuji Sekiguchi, Satoshi Tsuneda, and Naohiro Noda, A simple, cost-effective, and accurate quantification method for JAK2V617F allele burden in myeloproliferative neoplasms by fluorescence quenching probe, Haematologica (submitted).
(2)（報文）Hidenori Tani, Ryo Miyata, Kouhei Ichikawa, Soji Morishita, Shinya Kurata, Kazunori Nakamura, Satoshi Tsuneda, Yuji Sekiguchi, and Naohiro Noda, Universal quenching probe system: flexible, specific, and cost-effective real-time PCR method, Analytical Chemistry 2009;
81: 5678-5685.
(3)（報文）Soji Morishita, Hidenori Tani, Shinya Kurata, Kazunori Nakamura, Yuji Sekiguchi, Satoshi Tsuneda, and Naohiro Noda, Real-time reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for rapid and simple quantification of WT1 mRNA, Clinical Biochemistry 2009; 42:
515-520.
(1) Soji Morishita, Naohiro Noda, Yuji Sekiguchi, Aya H. Koda, Yuriko Yahata, Keita Kirito, Satoshi Tsuneda, and Norio Komatsu, Alternately Binding Quenching Probe Competitive PCR:
Simple, Sensitive, and Cost-Effective JAK2 Allele Burden Quantification Method, The 52nd ASH annual meeting, Orlando, FL, USA, December 2010 (accepted).
(1) 森下 総司，谷 英典，蔵田 信也，中村 和憲，常田 聡，関口 勇地，野田 尚宏，
RT-LAMP 法を用いた白血病マーカーWT1 mRNA の迅速・簡便定量技術の開発，化学工学
会第74年会，横浜，2009年3月
(2) 森下 総司，谷 英典，蔵田 信也，中村 和憲，常田 聡，関口 勇地，野田 尚宏，
Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP)法を用いた白血病マ ーカーWT1 mRNAの迅速・簡便定量技術の開発，第60 回生物工学会大会，仙台，2008 年8月
(3) 森下 総司，谷 英典，寺村 達也，足立 賢，常田 聡，蔵田 信也，中村 和憲，金川 貴 博，関口 勇地，野田 尚宏，新規遺伝子定量手法 ABC-LAMP 法の開発，化学工学会関東・
東北・北海道合同支部大会，東京，2007年11月
Ｎｏ.2
早稲田大学 博士（工学） 学位申請 研究業績書
種 類 別 題名、 発表・発行掲載誌名、 発表・発行年月、 連名者（申請者含む）
その他 (1)（特許）野田 尚宏，関口 勇地，森下 総司，常田 聡，小松 則夫，蓮沼 彩，桐戸 敬
太，JAK2遺伝子の変異解析方法，特願2010-174571
(2)（新聞掲載）白血病，30分で症状把握，日経産業新聞，2008年8月 (3)（受賞）平成19年度化学工学会学生賞，2007年11月
