博士（医学）清水健一 学位論文題名
新規NF‑kappaB 抑制薬、
Dehydroxymethylepoxyquinomicin (DHrvIEQ) の マウス喘息モデルに対する効果に関する研究
学位論文内容の要旨
【 背 景 と 目 的 】
気 管 支 喘 息 は 、 気 道 に お け る 慢 性 の 好 酸 球 性 炎 症 と 気 道 構 造 の 変 化 （ リ モ デ リ ン グ ） 、 そ し て 非 特 異 的 な 物 質 に 対 す る 気 道 収 縮 反 応 、 と 定 義 さ れ る 気 道 過 敏 性 の 亢 進 を 招 く 疾 患 で あ る 。 気 管 支 喘 息 の 有 病 率 は 増 加 傾 向 に あ る こ と が 示 唆 さ れ て い る が 、 喘 息 患 者 の 多 く は 低 用 量 の 吸 入 ス テ ロ イ ド に よ っ て 安 定 し た 経 過 が 得 ら れ る 。 し か し な が ら 高 用 量 の 吸 入 ス テ ロ イ ド な ど の 投 与 下 で も 症 状 が コ ン ト ロ ー ル さ れ な い 重 症 喘 息 と 呼 ば れ る 患 者 が10％ 程 度 存 在 す る と さ れ て お り 、 気 管 支 喘 息 の 新 た な 治 療 薬 の 開 発 が 望 ま れ て い る 。 NF―kappaB (NF‑KB)は 種 々 の 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン や ケ モ カ イ ン の 産 生 に 関 与 し て い る 転 写 因 子 で あ る 。 気 管 支 喘 息 患 者 の 気 道 上 皮 で はNFーxBの 発 現 が 亢 進 し て い る こ と が 示 さ れ て い る 。 マ ウ ス 喘 息 モ デ ル に 対 し て ノ ッ ク ア ウ ト 等 の 手 法 でNF−KBを 抑 制 す る と 好 酸 永 陸 炎 症 が 減 弱 す る こ と が 報 告 さ れ て お り 、 気 管 支 喘 息 の 病 態 に はNF−KBの 亢 進 が 関 与 し て い る こ と が 考 え ら れ る が 、 こ れ ま で に 臨 床 応 用 さ れ たNF一KB抑 制 薬 は 存 在 し な ぃ 。 Dehydroxymethylepoxyquinomicin (DHMEQ)は 慶 応 大 学 梅 澤 ら に よ っ て 合 成 さ れ た 新 規 NF11くB抑 制 薬 で あ る 。DHMEQはNF‑KBに 特 異 的 に 結 合 し 、 核 内 へ の 移 行 やDNAへ の 結 合 を 阻 害 す る こ と に よ っ て そ の 働 き を 抑 制 す る と い っ た 機 序 が 報 告 さ れ て い る 。 薬 理 作 用 と し て 、 関 節 炎 モ デ ル 、 同 種 異 系 間 の 心 移 植 モ デ ル 、 ア ト ピ ー 性 皮 膚 炎 モ デ ル な ど に 対 し て の 抗 炎 症 効 果 が 既 に 報 告 さ れ て お り 、 こ れ ま で 一 切 の 副 作 用 発 現 が 認 め ら れ て い な い 。DHMEQを 呼 吸 器 疾 患 の 動 物 モ デ ル に 投 与 し た 報 告 は こ れ ま で に 存 在 し な い 。 本 研 究 で は 、 マ ウ ス を 用 い た 気 管 支 喘 息 モ デ ル に お け るDHMEQの 効 果 に つ い て 、 マ ウ ス ヘ のDHMEQの 投 与 、 ま た 気 道 上 皮 細 胞 や 炎 症 細 胞 を 用 い た む ガtroの 実 験 系 に よ っ て 明 ら か に す る こ と を 目 的 と し た 。
【 対 象 と 方 法 】
DHMEQが 喘 息 の 病 態 に 与 え る 効 果 を 評 価 す る た め 、 主 に 気 道 炎 症 に つ い て 評 価 を 行 う 「 急 性 期 喘 息 モ デ ル 」 と 、 気 道 リ モ デ リ ン グ に つ い て 評 価 を 行 う 「 慢 性 期 喘 息 モ デ ル 」 を そ れ ぞ れBALB/c（ メ ス 、6週 齢 ） を 用 い て 作 成 し た 。ovalbumin (OVA)を 用 い た 抗 原 感 作 後 、 急 性 期 モ デ ル で は 経 鼻 投 与 で3日 問 、 慢 性 期 モ デ ル で は 週 に3回 、 計6週 間OVAを 噴 霧 す る こ と に よ り 抗 原 曝 露 を 行 っ た 。DHMEQは 各 抗 原 曝 露 の20〜 30分 前 に 腹 腔 内 に 投 与 し た 。 気 管 支 肺 胞 洗 浄(BAL)や 気 道 過 敏 性 測 定 は 最 終 抗 原 曝 露 の24時 間 後 、 気 管 に カ ニ ュ ー レ を 挿 入 す る こ と で 行 っ た 。 気 道 過 敏 性 に つ い て は 塩 化 メ サ コ リ ン 吸 入 に 対 す る 肺 抵 抗 、 肺 コ ン プ ラ イ ア ン ス の 変 化 を 測 定 し 、 そ の 指 標 と し た 。
肺 組 織 は 最 終 抗 原 曝 露 の24時 間 後 に 採 取 し 、periodic acid一Schiff (PAS)染 色 、Masson trichrome染 色 、a−smooth muscle actin (a‑SMA)の 免 疫 染 色 を 行 っ た 。 ま た 肺 組 織 の 一 部 か ら RNAを 抽 出 し 、 RT― PCRに て eotaxin、 MUC5ACの 測 定 を 行 っ た 。 細 胞 実 験 と し て 、OVAに 感 作 さ れ た マ ウ ス の 脾 細 胞 、 あ る い は 抗 ダ ニIgE抗 体 陽 性 の 健 常
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人 の血 液よ り分 離 した 末梢 血単 核球 か ら産 生さ れるIL−5、IL−13の測定を行った。 また気 道 上皮 細胞 とし てBEAS−2Bを用 い、IL−4も し くはTNF‑ocの 刺激 で 産生 され るeotaxinの測 定 を行 った 。
【 結果 】
気 管 支 肺 胞 洗 浄 液 中(BALF)で 増 加 し て い る 総 細 胞 数 、 好 酸 球 数 がDHMEQの 投 与に より 抑 制 さ れ た 。 ま たBALF中 のIL―5やIL―13と い っ たTh2サ イト カ イン も抑 制さ れ た。 肺組 織 中 のRNAを 測 定 し た と こ ろeotaxinの 発 現 が 低 下 し てお り、BALF中 の好 酸球 数 が抑 制さ れ た 結 果 と 合 致 し て い た 。 血 清 中 のOVA特 異 的IgE抗 体も 同様 に 低下 が認 めら れ た。 また PAS染 色 に よ る 肺 組 織 切 片 の 評価 を行 い、 気 道粘 液産 生が 低下 し てい るこ とが 示 され た。
肺 組 織RNAに お け るMUC5ACの 発 現 量 も 低 下 し て お り 、PAS染色 で 認め られ た結 果 と一 致し た 。気 道 リモ デリ ング の 評価 とし て気 道周 囲 の線 維化 、q―SMA発 現の 評価 を行 い 、ど ちら も 有意 な 抑制 が認 めら れ た。 加え てメ サコ リ ン吸 入に 対す る気 道 過敏 性も 抑制 さ れる こと が 示 さ れ た 。 な お 慢 性 期 モデ ルで は マウ スの 体重 変 化を 測定 した が、 対 照群 とDHMEQ投与 群 の間 に 明ら かな 差は 認 めら れな かっ た。
OVA感作 マウ ス から 採取 した 脾細 胞 をOVAで 刺激 し産 生さ れるIL―5、IL―13はDHMEQの投 与 によ り 有意 に抑 制さ れ た。 同様 にヒ ト末 梢 血単 核球 から 産生 さ れるILー5、IL一13も同様 に 抑 制 さ れ た 。 ま た 気 道 上 皮 細 胞 をIL―4やTNFーaで 刺 激 す る こ と に よ り 産 生 さ れ る eotaxinもDHMEQの 投与 に より 有意 な低 下が 認 めら れた 。
【 考察 】
喘 息 の病 態に はNF一KBを 含む 様々 な分 子 メカ ニズ ムや 多く の 細胞 が関 与し て いる こと が 推 測 さ れ て い る 。 過 去 にDHMEQはT細 胞 の 増 殖 能 や 活 性 化を 抑 制す るこ と、 樹 状細 胞の 活 性 化 や 末梢 血単 核球 か らの 炎症 性サ イト カ イン 産生 を抑 制す る こと が示 され て いる 。今 回 我 々 は 、 気 道 上 皮 細 胞 か ら のeotaxin産 生 、あ るい はマ ウス 脾 細胞 やヒ ト末 梢 血単 核球 か ら のTh2サ イ ト カ イ ン 産 生 がDHMEQに よ っ て 抑 制 さ れ る こと を 示し た。 マウ ス を用 いた 気 管 支 喘 息 モ デ ル に お い て 認 め ら れ たDHMEQの効 果は 、こ れら 様 々な 細胞 の機 能 を抑 制し た 結 果で ある 可能 性が 考 えら れる 。
気 道 リ モ デ リ ン グ とNF‑KBと の関 連に つ いて 、線 維芽 細胞 か ら筋 線維 芽細 胞 への 分化 、 線 維 芽 細胞 から のTGF‑pの産 生、 気 道平 滑筋 細胞 の 増殖 など の機 能がNF‑KBの 制 御下 にあ る こ とが 報告 され てい る 。さ らにNF‑1くBの活 性化 に 必要 なIKB kinaseを抑制 することによっ て マ ウ ス喘 息モ デル に おけ る気 道リ モデ リ ング が抑 制さ れる こ とも 過去 に示 さ れて 韜り 、 今 回 の 我々 が示 した 結 果と 合致 する もの で ある 。ス テロ イド を 含め 、気 管支 喘 息の 治療 に 現 在 用 いら れて いる 薬 は気 道リ モデ リン グ の進 展に 対し あま り 効果 がな いこ と が知 られ て お り 、NF‑KB抑 制 に よ っ て 得 ら れる 気道 リ モデ リン グに 対す る 効果 は重 要で あ ると 考え ら れ る。
DHMEQに 明 ら か な 副 作 用 が な いこ とは 、 これ まで 複数 の報 告 にお いて 示さ れ てお り、 今 回 我 々 も慢 性期 モデ ル にお いて マウ スの 体 重変 化に 有意 な差 を 認め なぃ こと を 確認 した 。 DHMEQは 特異 的 にNF一kBの核 内 移行 を阻 害す るこ と が示 され てい る。 この特 異性こそが他の NF―1出 抑制 薬 に認 めら れな ぃDHMEQの特 徴 であり 、これまで明らかな副作用 発現を認めない 理 由 で あ る と 考 え ら れ て い る 。 し かし なが ら長 期 間DHMEQを 投 与す るこ とに よ る易 感染 性 の 有 無 や 他 の 生 理 機 能 に 与 え る 影 響 を 調 べ る こ と は 今 後 必 要 で あ る と 考 え ら れ る 。
【結 論】
マ ウス 喘 息モ デル にお いて 認 めら れる 好酸 球性 気 道炎 症や 気道 リ モデ リン グ、 気道 過敏 性 の 亢 進 がDHMEQの 投 与に よ って 抑制 され た。 喘 息の 病態 に関 与す る 気道 上皮 細胞 や 炎症 細胞 から の ケモ カイ ン、 サイ ト カイ ンの 産生 もDHMEQによ り 抑制 され た。DHMEQは 気管 支喘 息の 治療 に おい て有 効で ある 可 能性 が示 され た。
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学位論文審査の要旨
学 位 論 文 題 名
新規NF‑kappaB 抑制薬、
Dehydroxymethylepoxyquinomicin (DHrvIEQ) c]) マウス喘息モデルに対する効果に関する研究
Dehydroxymethylepoxyquinomicin (DHMEQ) は慶応大学梅澤らによって合成された新規 NF −kappaB 抑制薬であり、NF ―kappaB に特異的に結合し、核内への移行やDNA への結合を阻 害することによってその働きを抑制するといった機序が報告されている。本研究では、マ ウス気 管支喘息モデルにおけるDHMEQ の効果について、急性及び慢性モデルでのin vivo 投与実験と、気道上皮細胞や炎症細胞を用いたin vitro 実験によって明らかにすることを 目的とした。
マウ ス喘息モデルを用いた検討では、気管支肺胞洗浄液中(BALF) の総細胞数、好酸球 数、Th2 サイトカイン（IL ―5 、IL 一13) の増加がDHMEQ の投与により抑制された。肺組織で は eot axin mRNA の発現が低下しており、BALF 中好酸球数が抑制された結果と合致した。ま た肺組 織における PAS 染色、及びMUC5ACmRNA 発現の検討から、気道粘液産生が DHMEQ 投 与により低下していた。慢性モデルによる気道リモデリングの評価は気道周囲の線維化、
a − SMA の発現を指標とし、どちらもDHMEQ により有意な抑制が認められた。加えてメサコ リン吸入に対する気道過敏性も抑制された。
Invitro 実験でマウス脾細胞、あるいはヒト末梢血単核球から産生されるIL −5 、IL ―13 は D 刪EQ により有意に抑制された。 また、気道上皮細胞から産生されるeotaxin もDHMEQ の投与により有意に低下した。
結論として、マウス喘息モデルにおいて認められる好酸球性気道炎症、気道ルモデリン グ、気 道過敏性の亢進がDm 凹の投与によって抑制された。喘息病態に関与する気道上皮 細胞や炎症細胞からのケモカイン、サイトカインの産生もDm 凪 Q により抑制された。以上 よ り D 刪 EQ は 気 管 支 喘 息 の 新 た な 治 療 薬 に な る 可 能 性 が 示 さ れ た 。
質疑応答では、上出教授より、＠気管支喘息における他の免疫抑制薬投与の報告、◎マ ウスに用いたDHMEQ の投与量設定、◎TGF‑p の受容体発現程度の変化、の3 点について質問 があった。申請者は、＠現在、免疫抑制薬の投与は症例報告レベルであルエピデンスのあ る投与方法ではないこと、◎DHMEQ の投与量は過去の報告を参考に、これまでの最大投与 量である40mg/kg としたこと、◎TGF‑p 受容体の発現レベルについては、今後の検討課題で
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あ る 、 と 回 答 し た 。
西 村 孝 司 教 授 か ら は ＠ 重 症 喘 息 モ デ ル と し て は マ ウ ス 好 中 球 喘 息 モ デ ル を 用 い た ほ う が よ い の で は な い か 、 ◎ 免 疫 抑 制 に 関 わ る 副 作 用 の 検 討 と し て 、Thlサ イ ト カ イ ン の 分 泌 抑 制 に つ い て 検 討 す べ き で は な い か 、 の2点 に つ い て 質 問 が あ っ た 。 申 請 者 は 、 ＠ 最 初 に 行 う 実 験 と し て 、 今 回 は 典 型 的 なTh2気 道 炎 症 モ デ ル を 用 い た が 、 今 後 は 好 中 球 性 炎 症 を タ ー ゲ ッ ト と し た 系 に つ い て も 検 討 を 行 い た い こ と 、 ◎ 副 作 用 の 観 点 か ら 易 感 染 性 の 問 題 は 重 要 で あ り 、 今 後 検 討 し て い き た い 、 と 答 え た 。
有 賀 教 授 か ら は 、 人 へ の 将 来 的 応 用 を 考 え る と 、 完 成 し た 気 道 リ モ デ リ ン グ に 対 す る 効 果 を マ ウ ス に お い て も 検 討 し た ほ う が よ い の で は 、 の 質 問 が あ っ た 。 申 請 者 は 他 の NF―kappaB抑 制 薬 を 用 い た 過 去 の 報 告 で も 気 道 リ モ デ リ ン グ を 一 旦 完 成 さ せ た 後 よ り 投 薬 を 開 始 し 、 リ モ デ リ ン グ 消 退 に 対 す る 効 果 を 検 討 し た も の が あ る こ と 、 本 研 究 で も 同 様 の 検 討 が 望 ま し い と 考 え て い る 旨 を 説 明 し た 。
西 村 正 治 教 授 か ら は 、 実 際 に 患 者 に 用 い る 際 に は 吸 入 ス テ ロ イ ド に 加 え る 形 に な る こ と が 予 想 さ れ る が 、 本 研 究 で は ス テ ロ イ ド ヘ のadd―on効 果 は み て い る の か ど う か 、 に つ い て 質 問 が な さ れ 、 申 請 者 は 急 性 期 モ デ ル に お け る 好 酸 球 性 気 道 炎 症 に お い て は 、 ス テ ロ イ ド にDHMEQを 併 用 す る こ と に よ り 更 な る 抗 炎 症 効 果 が 認 め ら れ る こ と を 確 認 し て い る 旨 の 説 明 を し た 。
こ の 論 文 は 、 新 規NF―kappaB抑 制 薬 で あ るDHMEQの 効 果 に つ い て 、 気 道 炎 症 、 気 道 リ モ デ ル ン グ 、 気 道 過 敏 性 と い っ た 気 管 支 喘 息 の 病 態 に 対 しin viVo、in vitroの 系 を 用 い て 検 討 さ れ て い る こ と に っ き 高 く 評 価 さ れ 、 今 後 は ヒ ト ヘ の 将 来 的 応 用 を 視 野 に 、 局 所 （ 気 道 ） 投 与 を 目 的 と し た 製 剤 の 開 発 、 効 果 の 検 討 が 進 む こ と が 期 待 さ れ る 。 審 査 員 一 同 は 、 こ れ ら の 成 果 を 高 く 評 価 し 、 大 学 院 課 程 に お け る 研 鑽 や 取 得 単 位 な ど も 併 せ 申 請 者 が 博 士
（ 医 学 ） の 学 位 を 受 け る の に 十 分 な 資 格 を 有 す る も の と 判 定 し た 。
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