博 士 （ 水 産 科 学 ） 清 水 裕
学 位 論 文 題 名
魚 卵 ア レ ル ゲ ン タ ン ノ ヾ ク 質 の 構 造 解 析 お よ び 検 知 法 の 開 発 学 位 論 文 内 容 の 要 旨
い く ら， た ら こ ， かず の こ 等 さ まざ ま な 魚 卵 の喫 食 習 慣 が あ る日本 では，1980年代 初頭よ り魚卵 アレ ル ギ ー の 症例 が 報 告 さ れて い る 。 ま た ，食 物 ア レ ル ゲン 表 示 制 度にお いて 「いく ら」が 表示推 奨品 目に 指 定 さ れ てい る よ う に ，魚 卵 ア レ ル ギ ーは 留 意 す べ き症 例 の ひ とっと して 認識さ れてい る。し かし なが ら ， 魚 卵 のア レ ル ゲ ン タン パ ク 質 や そ の構 造 に 関 す る報 告 は ほ とんど 存在 しない 。また ，アレ ルギ ー物 質 の 検 知 法に 関 し て は ，食 品 へ の 表 示 が義 務 化 さ れ てい る7品 目 （鶏 卵 ， 牛 乳 ，小 麦 ， エビ， カニ ，そ ば ， 落 花 生） を 対 象 と した 検 知 法 が す でに 開 発 さ れ てお り ， 製 品チェ ック 等に用 いられ ，混入 事故 の防 止 に 役 立 てら れ て い る 。し か し ， い く らに 関 し て は 食品 中 の 微 量検出 法が 確立さ れてい ないた め， アレ ル ギ ー 物 質制 度 の 実 効 的運 用 が 困 難 で あり ， 食 の 安 全を 確 保 す る上で の不 安要因 となっ ている 。一 方，
諸 外 国 で は， 魚 卵 ア レ ルギ ー に 関 す る 症例 報 告 は 少 ない も の の ，ロシ アや 欧米で 広く喫 食され るキ ャビ ア を 始 め とし て イ タ リ アの ボ ッ タ ル ガ ，台 湾 の 烏 魚 子な ど ， 多 くの国 に魚 卵を食 する文 化が存 在す るた め ， 潜 在 的な 魚 卵 ア レ ルギ ー 患 者 が 存 在す る と 推 測 され る 。 以 上の状 況を 踏まえ ると， 魚卵ア レル ギー の 速やか な実態 解明を 行う 必要が あるこ とは疑 いが ない。
食 物 アレ ル ギ ー の 全貌 を 理 解 す るた め に は ， まず ， ア レ ル ゲ ンタン パク質 の確定 と食物 交差 抗原と な る 可 能 性 を明 ら か に す る必 要 が あ る 。 また ， ア レ ル ゲン の 諸 性 質（ア レル ゲンの 安定性 や抗原 交差 性の 成 立 範 囲 など ） を 理 解 する た め に は ，IgE結 合 領域 （ エ ピ ト ープ ） の 確 定 が 必要 で あ る。 そこ で本研 究 で は ， 魚 卵， 特 に い く らの 原 材 料 で あ るシ ロ ザ ケ 卵 に注 目 し ， そのア レル ゲンタ ンパク 質に関 する 包括 的 な検討 と，シ ロザケ 卵を 対象と した高 感度微 量検 知法の 開発を 行った 。
ま ず 第一 章 で は ， シロ ザ ケ 卵 に 含ま れ る ア レ ルゲ ン タ ン パ ク 質を同 定し， これを 介した 魚種 間交差 性 に つ い て 検 討 し た 。 そ の 結 果 ， シ ロ ザ ケ 卵 の 主 要 ア レ ル ゲ ン タ ン パ ク 質 が 卵 黄 タ ン パ ク 質 の 一 種 p ‑component（p ‑c)で ある こ と を 確 認し た 。 ま た ， いく ら ア レルギ ー患者 血清 を用い た阻害ELISAに よ り ， シ ロザ ケ 卵 と 他のサ ケ科魚 卵間に ，p ＿cを介 した強 い魚 種問交 差性が 存在す ること を明 らかに し た 。 さ ら に， 種 々 の 魚 種卵 のp ‑cに 対 し てIgE反 応 性 を 持つ い くら アレル ギー 患者血 清が相 当数見 いだ さ れた事 実から ，p −cを介 した抗 原交差 性が 広範囲 の魚種 間に成 立す ること が示された。以上の結果は，
各 種魚卵 の主要 アレル ゲン タンパ ク質がD ―cである ことを 示唆し てい る。
次 に 第 二 章で は ，p ．cの 前 駆 タ ンパ ク 質 で あ る ビテ ロ ジ ェ ニ ン(Vg)の遺 伝 子 を 用 いたcDNAクロ ー ニ ン グ に よ っ て シロ ザ ケp −cの 一 次 構 造を 調 べ た 。 シロ ザ ケVgの構 造 は 不 明 であ る た め ，Vgの 一 次 構 造 が 報 告さ れ て い る 魚種 の 中 か ら ， シロ ザ ケ の 近 縁種 で あ る ニジマ スの 遺伝子 を参考 にして プラ イマ を 作 製 し ，こ れ を 用 い た。 ま た ， 限 定 消化 したp ーcの消化 ペプチ ドをN末端 アミノ 酸配列 分析 に供し ， そ の 結 果 をcDNAクロ ー ニ ン グ に よる 演 繹 ア ミ ノ酸 配 列 と 比 較し た 。 そ の 結果 ，B ‐cを コー ドする3種 類 の 塩 基 配列 と そ こ か ら演 繹 し た 各170残 基 の アミ ノ 酸 配 列 を決 定 し た 。 こ れら は ア イソ フオ ームの 関 係 に あ り ， わ ず かに1〜5ア ミノ 酸 残 基 の みが 異 な っ て いた 。 そ し て ，消 化 ペ プ チ ド を用 い た 検 討 によ り ， シ ロ ザ ケp ‐cを 構 成 する2種 類 の サブ ユ ニ ッ ト （分 子 量18kお よ び16k)の 内 部 アミ ノ 酸 配 列 がほ ぼ 等 し い こと が 確 認 さ れた 。 ま た ， 両 サブ ユ ニ ッ ト のア ミ ノ 酸 配 列は ， 先 に 述 べた3種 類の演 繹ア ミノ 酸 配列に 極めて 良く一 致し ていた 。さら に，決定した演繹アミノ酸配歹I亅のーっを基に作製した組換えp ‑c のIgE結 合能は ，Native9 −cの それと 大きな 差が 見られ なかっ た。以 上の結 果よ り，シ ロザケB −cは同
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等 のIgE結 合 能 を 持 っ た ア イ ソ フ オ ー ム に よ っ て 構成 さ れ て い ると 推 測 し た 。加 え て ，cDNAク ロ ー ニ ン グ に よ り3種 類 の 演 繹 アミ ノ 酸 配 列 が見 い だ さ れ た こと か ら ， 同 定さ れた2種 類のサ ブュニ ット 毎に，
よ り 多 く の アイ ソ フ オ ー ムが 存 在 す る と 思わ れ た 。
続 いて 第三章 では， 消化ペ プチ ドと合 成ペプ チドを 用いて ，シ ロザケD ‐cのIgEエピト ープ解 析を行 っ た 。 ま ず ， 消 化 ペ プ チ ド を用 い た 検 討 によ っ て ，IgE反 応 性 を 持つ4種 の ペ プチ ド を 見 い だし た 。 そ こ で ， こ れ ら の ア ミ ノ 酸 配 列を 基 に オ ー バー ラ ッ プ ペ プチ ド を 合 成 してIgE反 応性 を 調 べ た とこ ろ ，5種 類 のIgEエ ピ ト ー プ 配 列を 見 いだす ことが できた 。こ れらのIgEエ ピトー プのア ミノ 酸配列 を他魚 種p ‐c の ア ミ ノ 酸 配 列 と 比 較 し たと こ ろ ，2種類 のIgEエ ピ 卜 ー プ はサ ケ 科 魚 種 間 の抗 原 交 差 性 に関 与 し て い る と 推 測 さ れ ， 残 り3種 類 は 広 範 囲 の 魚 種 間 交 差 性 に 関 与 す る こ と が 示 唆 さ れ た 。 そ し て 第四 章 で は ， 第一 章 か ら 第 三章 で 明 ら か にし た ア レ ル ゲ ンタ ン パク質 に関す る知見 を活 用しつ つ ， 加 工 食 品 中 に 微 量 に 混入 し た シ ロ ザケ 卵 タ ン パ ク質 の み を 検 出可 能 な ア ッ セ イ系 の 構 築 を 目指 し た 。 そ の 際 ，抗B ￣c抗体 の抗 原に対 する 特性が ，抗体 の由来 動物種 によ って異 なるこ とを見 いだ した。
そ こ で ， 異 種動 物 由 来 の 抗B ‐c抗体 を併 用する ことで ，高い 魚種特 異性 と十分 な検出 感度を 持っ たシロ ザ ケ 卵 検 知 法を 開 発 し た 。本 研 究 で 開 発 した 検 知 法 は ，シ ロ ザ ケ 卵 と他 の魚 卵を区 別可能 であり ，その 検 出 限 界 は0.78 yg/gで あっ た 。 ま た ， 添加 回 収 試 験 でも 良 好 な 結 果を 得 て お り ，実 用 的 な 性能 を持 つ て い る こ と が確 認 さ れ た 。
最 後 に 第五 章 で は ， 異種 動物 に由来 した 抗スケ トウダ ラB ―c抗体 の併用 による ，食品 含有 スケト ウダ ラ 卵 検 知 法 の 開 発 を 試 み た 。 そ の 結 果 ， 抗 原 の 抽 出 に 用 い たsodium dodecylsulfate（SDS） と 2ーmercaptoethanol (2Me)が 検 知法 の 魚 種 特 異性 に 大 き な 影響 を 及 ば し， さらに スケト ウダラ 卵検知 法 の 検 出 感 度 を 大 き く 低 下 さ せ る こ と を 見 い だ し た 。 そ こ で 本 章 では ，SDSおよ び2Meを 含 ま な い 抗 原 抽 出 試 薬 を 新た に 採 用 す るこ と に よ っ て ，シ ロ ザ ケ 卵 検知 法 と 同 等 の検 出感 度を持 つスケ トウダ ラ卵検 知 法 の 開 発 を可 能 と し た 。以 上 の 結 果 よ り， 異 種 動 物 由来 抗 体 の 併 用が ，シ ロザケ 以外の 魚種卵 検知法 に お い て も 有効 で あ る と 判断 し た 。
本 研究 で得ら れた知 見を列 挙す る。（1） 各種魚 卵の主 要アレ ルゲン タン パク質 が8 ‐cであ ること を示 し た 。(2)シロ ザケp −cの アミノ 酸配 列を決 定し， 複数の アイ ソフオ ームが 存在す ること を見 いだし た。
（3） シ ロ ザ ケB ‐cの ア ミ ノ 酸 配列 中 に 存 在 する5種 類 のIgEエ ピ ト ープ を 決 定 し た。(4)広 範囲 の 魚 類 の 間にp −cを介し た抗原 交差 性が存 在する ことを 明らか とし た。(5)異な る動物 種に由 来す る抗6 ‐c 抗 体 の 併 用 が ， 高 い 抗 原 特 異 性 を も つ 魚 卵 検 知 法 の 開 発 に 有 効 で あ る こ と を 示 し た 。
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学位論文審査の要旨 主 査 教 授 川 合 祐 史 副 査 教 授 佐 伯 宏 樹 副 査 教 授 一 色 賢 司 副 査 准 教 授 岸 村 栄 毅 副 査 博 士 穐 山 浩
（ 国 立 医 薬 品 食 品 衛 生 研 究 所 ）
学 位 論 文 題 名
魚卵アレルゲンタンパク質の構造解析および検知法の開発
魚 卵 の 喫 食 習 慣 を も つ 日 本 社 会 で は ，1980年 代 よ り 魚 卵 ア レ ル ギ ー の 存 在 が 報 告 さ れ て き た 。 ま た ， 食 物 ア レ ル ゲ ン 表 示 制 度 に お い て 「 い く ら 」 が 表 示 推 奨 品 目 に 指 定 さ れ て お り ， 魚 卵 ア レ ル ギ ー は 留 意 す べ き 症 例 の ひ と っ と し て 認 識 さ れ て い る 。 し か し ， 他 の 食 物 ア レ ル ギ ー と 比 較 す る と ， 魚 卵 ア レ ル ギ ー に 関 す る 学 術 的 情 報 の 蓄 積 は 充 分 と は い え な い 。 本 論 文 は こ れ ら の 背 景 を 踏 ま え た も の で ， 魚 卵 ア レ ル ギ ー に 対 す る 科 学 的 探 究 を 目 的 と し て い る 。
食 物 ア レ ル ギ ー の 全 貌 を 理 解 す る に は ， ま ず ア レ ル ゲ ン を 確 定 し て 構 造 解 析 を お こ な う と と も に ， 食 物 問 に お け る ア レ ル ゲ ン 交 差 性 の 範 囲 を 明 ら か に す る 必 要 が あ る 。 そ こ で 本 論 文 で は ， 魚 卵 ， 特 に い く ら の 原 材 料 で あ る シ ロ ザ ケ 卵 に 注 目 し ， そ の ア レ ル ゲ ン に 関 す る 包 括 的 な 調 査 と ， シ ロ ザ ケ 卵 を 対 象 と し た 高 感 度 微 量 検 知 法 の 開 発 が 行 わ れ た 。 本 論 文 は5章 よ り 構 成 さ れ て い る 。 ま ず 第 一 章 で は ， シ ロ ザ ケ 卵 に 含 ま れ る ア レ ル ゲ ン タ ン パ ク 質 を 同 定 し ， こ れ を 介 し た 魚 種 間 交 差 性 に つ い て 検 討 し た 。 そ の 結 果 ， シ ロ ザ ケ 卵 の 主 要 ア レ ル ゲ ン タ ン パ ク 質 が 卵 黄 タ ン パ ク 質 の 一 種p ‑component（p ‑c)で あ る こ と を ， 複 数 の 免 疫 化 学 的 手 法 を 用 い て 確 認 し た 。 ま た ， い く ら ア レ ル ギ ー 患 者 血 清 を 用 い た 阻 害 ELISAに よ り ， シ ロ ザ ケ 卵 と 他 の サ ケ 科 魚 卵 間 に ，p ‐cを 介 し た 強 い 魚 種 間 交 差 性 が 存 在 す る こ と を 明 ら か に し た 。
第 二 章 で は ，p 。cの 前 駆 タ ン パ ク 質 で あ る ビ テ ロ ジ ェ ニ ン(Vg)の 遺 伝 子 を 用 い たcDNA ク ロ ー ニ ン グ に よ っ て ， シ ロ ザ ケp −cの 一 次 構 造 を 調 べ た 。 ま た ， 精 製B ‐cの ペ プ チ ド マ ツ ピ ン グ に よ る ア ミ ノ 酸 配 列 調 査 も 同 時 に お こ な っ た 。 そ の 結 果 ，p ‑cを コ ー ド す る3種 類 の 塩 基 配 列 と そ こ か ら 演 繹 し た 各170残 基 の ア ミ ノ 酸 配 列 を 決 定 し た 。 こ れ ら は ア イ ソ フ オ ー ム の 関 係 に あ り ， わ ず か に1〜5ア ミ ノ 酸 残 基 の み が 異 な っ て い た 。 そ し て ， 消 化 ベ プ チ ド を 用 い た 検 討 に よ り ， シ ロ ザ ケp ‐cを 構 成 す る2種 類 の サ ブ ュ ニ ッ ト （ 分 子 量18k お よ ぴ16k)の 内 部 ア ミ ノ 酸 配 列 が ほ ば 等 し い こ と を 確 認 し た 。 ま た ， 決 定 し た 演 繹 ア ミ
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/酸 配 列 の ー っ を 基 に 作 製 し た 組 換 えp ‑cのIgE結 合 能 が ，Nativep ‐cの そ れ と 大 き な 差 異 が な い こ と も 示 し た 。 以 上 の 結 果 よ り ， シ ロ ザ ケp 一cは 同 等 のIgE結 合 能 を 持 っ た ア イ ソ フ オ ー ム に よ っ て 構 成 さ れ て い る と 推 測 し た 。
第 三 章 で は ， 消 化 ペ プ チ ド と 合 成 ペ プ チ ド を 用 い て ， シ ロ ザ ケp゜ ‐cのIgEエ ピ ト ー プ 解 析 を 行 っ た 。 ま ず ， 消 化 ペ プ チ ド を 用 い た 検 討 に よ っ て ，IgE反 応 性 を 持 つ4種 の ペ プ チ ド を 見 い だ し た 。 そ こ で ， こ れ ら の ア ミ ノ 酸 配 列 を 基 に オ ー バ ー ラ ッ プ ペ プ チ ド を 合 成 し てIgE反 応 性 を 調 べ た と こ ろ ，5種 類 のIgEエ ピ ト ー プ 配 列 を 見 い だ す こ と が で き た 。 こ れ ら のIgEエ ピ ト ー プ の ア ミ ノ 酸 配 列 を 他 魚 種p ‐cの ア ミ ノ 酸 配 列 と 比 較 し た と こ ろ ，2 種 類 のIgEエ ピ ト ー プ が サ ケ 科 魚 類 間 の 抗 原 交 差 性 に ， ま た 残 り3種 類 は 広 範 囲 の 魚 種 問 交 差 性 に そ れ ぞ れ 関 与 し て い る と 推 測 し た 。
第 四 章 で は ， 第 一 章 か ら 第 三 章 で 明 ら か に し た ア レ ル ゲ ン タ ン パ ク 質 に 関 す る 知 見 を 活 用 し っ つ ， 加 工 食 品 中 に 微 量 に 混 入 し た シ ロ ザ ケ 卵 タ ン パ ク 質 の み を 検 出 可 能 な ア ッ セ イ 系 の 構 築 を 試 み た 。 そ の 際 ， 抗p ‐c抗 体 の 抗 原 に 対 す る 特 性 が ， 抗 体 の 由 来 動 物 種 に よ っ て 異 な る こ と を 見 い だ し た 。 そ こ で こ の 知 見 を 活 用 し ， ウ サ ギ と ラ ッ ト 由 来 の 抗D ．c抗 体 を 併 用 す る こ と で ， 高 い 魚 種 特 異 性 と 十 分 な 検 出 感 度 を 持 っ た シ ロ ザ ケ 卵 検 知 法 を 開 発 し た 。 本 研 究 で 開 発 し た 検 知 法 は ， シ ロ ザ ケ 卵 と 他 の 魚 卵 を 判 別 可 能 で あ り ， そ の 検 出 限 界 は0.78 pg/gで あ っ た 。 ま た ， 添 加 回 収 試 験 で も 良 好 ぬ 結 果 が 得 ら れ ， 実 用 的 な 性 能 を 持 っ て い る こ と が 確 認 さ れ た 。
第 五 章 で は ， 異 種 動 物 に 由 来 し た 抗 ス ケ ト ウ ダ ラB −c抗 体 を 併 用 し て ， 食 品 含 有 ス ケ ト ウ ダ ラ 卵 検 知 法 の 開 発 を 試 み た 。 そ の 結 果 ， 抗 原 の 抽 出 に 用 い たsodiumdodeりlsmfate（SDS） と2‐mercaptoemanol（2Me） が 検 知 法 の 魚 種 特 異 性 に 大 き な 影 響 を お よ ぼ し ， さ ら に ス ケ ト ウ ダ ラ 卵 検 知 法 の 検 出 感 度 を 大 き く 低 下 さ せ る こ と を 見 い だ し た 。 そ こ で 本 章 で は ，SDS お よ び2Meを 含 ま な い 抗 原 抽 出 試 薬 を 新 た に 採 用 す る こ と に よ っ て ， シ ロ ザ ケ 卵 検 知 法 と 同 等 の 検 出 感 度 を 持 つ ス ケ ト ウ ダ ラ 卵 検 知 法 の 開 発 を 可 能 と し た 。 以 上 の 結 果 よ り ， 異 種 動 物 由 来 抗 体 の 併 用 が ， シ ロ ザ ケ 以 外 の 魚 種 卵 検 知 法 に お い て も 有 効 で あ る と 判 断 し た 。 こ れ ら 一 連 の 成 果 は 、 い く ら ア レ ル ギ ー に 関 す る 基 本 的 な 情 報 を 網 羅 的 に 解 明 し た も の で ， 学 術 的 に 極 め て 高 く 評 価 す る こ と が で き る 。 さ ら に ， 魚 卵 ア レ ル ギ ー に お け る 発 症 機 構 の 解 明 ， 食 品 衛 生 学 的 安 全 性 の 向 上 ， ア レ ル ギ ー 患 者 に 対 す る 食 事 指 導 な ど 多 方 面 に 貢 献 で き る 内 容 で あ る 。 よ っ て 審 査 員 一 同 は ， 申 請 者 が 博 士 （ 水 産 科 学 ） の 学 位 を 授 与 さ れ る 資 格 の あ る も の と 判 定 し た 。
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