対 す 多 剤併 用 療 法 基礎 的研究 骨肉腫

金沢大 学十 全医 学 会 雑誌 第9 5巻 第1 号 5 3 ⁻73 く1 9 86フ

骨 肉 腫 ^に 対

す

剤併

療

基礎

− ヒト骨肉腫由来 培養細 胞 O S^T 株^についての flo w cy t^{o m e}try によ る検討 ^一

食沢 大 学 医 学 部整^形外 科学 講 座 く主任^二野村 進 数按ン

平 伸

く昭和^{6 1}年¹ 月^{2 7} 日受 付I

骨 肉 腫に対す る，抗癌 剤併 用 治 療法^の至適 投与 条 件^の確 立を目 的と し て， ヒト骨 肉腫 細 胞O S T 株^に 対し， 臨 床 上骨 肉腫の治療^に広く使用 さ れ て^いる M ethotr e x ateくM T Xl，V in c ristin eくV C Rl，A dria my^cin

くA D M 姥 複 数^に組^み合わ せ て作 用さ せ， 細胞回転^への影 響を flo w cy to m etryくF C叩， 生細 胞 数測 定， 細 胞形態変化 観察よ り検討し， 以下の結 果_を得た． M T X を先 行し て作用 さ せ た の ち V C R ま た は A D M を作 用 さ せ た場 合^に， M T X が O S T 細 胞を G l^．S 移 行 期^に同調 集横させる た め， 細 胞 増殖 抑 制 効 果が顕著であ^っ た． A D M は殆ん どの O S T 細 胞を G 2 期^に集 積さ^せる た め，A D M 作用後M T X や V C R を作用 さ せ て も，

A D M 単 独作 用^と同じ効 果^のみ しか得ら れ な かった． V C R を M T X，A D M に先が け て作 用さ せ た場 ％，著

明な ^m etapha s e a r r e stは認め ら れ な か^った． し か し， M T X を作用 さ せ た後V C R を作用 さ せ る順 序に お

いて は， m etapha s e a r r e st が効 果 的^に惹起さ れ た． これ らの結 果か ら， 3 剤交 替 併用投 与で は M T X， つ

づ^いて V C R，最 後^に A D M を投与す る順 序が有用 で あ り， 細 胞回転の立 場から み て も合理的である と考え ら れ た^．

Key ^{w o r}ds flo w cy t^{o m e}try，O Ste O S a r C O m a_，C O mb in atio n ch e m oth_{e r ap y}

骨 肉腰^の治 療は 1 96 0 年 以 前は患 肢切断 術が主で あ^った が， その結 果について は 必ずし も満 足す る も^の では な く， 当教 室^でも 5 年生 存 率は10％以下という成 績^であった^り．

生 存 率が低^い原 因と し^て， 腫瘍 原発巣^の切除 時す で に肺^に潜 在性 転 移が成立 し ていること が考え ら れて い る が， その対策と して抗 癌剤 投 与^の有 効 性が実 証さ れ てから， 骨 肉腫^に対す る化学 療 法が注目 さ れ る よ う^に な^っ て き た．

骨肉腫^に対す る化 学 療 法^の歴 史と し て は， ま ず抗 癌 剤^の単独 投 与と し て， CyClopho spha mi de²l

， phe nyl⁻

ala nine m u sta rd^3I， mito mycin C^4ン， Vin c ristin e

くV C R 1^{5 1}， adria my^cin くA D MI⁶¹な ど が試^みら れ た が，

A D M の み にわずか に好結 果が得ら れ た 以外， ほ と ん ど効 果は期 待でき な^{か っ}た． 1 9 7 0年 代^に入 り， J^affe

ら^{7 1}は Dj^{e r a s si81が}肺 癌 患 者^に対し て行なった high do s e m ethotr e x ate⁻Citr o v o r u m fa cto r r e s c u e 法を，

骨 肉腫肺 転移 患 者^の治療^に適用 し， 5 年 生存 率を 飛躍

A b b^re viatio n s こA D M ， ad^ria m y^ci_町 F C M ，

5 3

的に 向上 せ し め た． その後V C R を m ethotr e x ate

くM T Xl ^に先が け て投 与す る と，M T X の細 胞 内取り 込 み が増 加す る と の報 告^射があり， V C R が併用 さ れ る よ うになっ た． さ らに_， Ro s e n ら^{1 01}は， V C R⁻h igh do s e

M T X⁻Citr o v o r u m fa cto r r e s c u e 法^に従^って投 与し た 後， 2 週 目^にA D M を追加 投 与す ることによって単剤 投 与で誘 導さ れ る腫 瘍^の耐 性 化や副作^用の防止 と と も に_， 薬 剤 効 果^の増 強が得ら れ た と報 告し た^． その後 J^affe ら^川多く^の施 設で V C R， M T X 及 び A D M ^の3

剤 併^用投 与が行な わ れ る よ うにな り， 当教 室^において も¹9 77 年以来， Ro s w ell Pa rk M e m o rial In stitute の プ^ロ トコ ル に準じて， 前 記3 剤^によ る併用投 与を施行 し， 生存 率^の向上 を み るに至 って いる^{1I1 21}

と^ころ^で，

一 般に悪性腫瘍^に対す る抗癌 剤の多 剤併

用療 法は，当初 陳 床上有 効 性を認め た薬 剤を無 作 為^に，

あ るいは， 経 験 的^に組み合わ せ たにす ぎ なか った． し かし，Br u c e ら^{1 3i}，S in clair川及び W he ele rら^{1 51}によっ て抗 癌 剤^の細 胞回転^に及 ぼ す 影響が検 討さ れ る よ う^に

flo w cy t^{o m e}try ニH E stain，he m ato xylin e o sin Staini M I， mitoticindex 三M T X， m ethotr ex atei V C R， Vin c ristin e．

5⁴

な り， 昨 今で は細 胞回転を考 慮し た う え^{で の}併用投 与 法が大き な位 置を占め る よ うになった^{工引−2 2 I}

し^かし， 従 来細 胞回転の研 究は 主 と して， オ ^ー ト^ラ ジ オ グ ラフ イ^一 法^によ^っ て行な わ れ てお り， 手 技的^に 煩 経で， し か も長 時 間を要す る欠 点が あ^った^{2 3 1}．

近年， 細 胞 周 期^{に お}け る各期のD N A 宣の差 異を指 標と し， Fe ulge n 染 色し た細 胞 核^の螢光 量を測 定す る ことによっ て， 各 期に お け る細 胞 数を測 定す る顕微 分 光 測 定 法が考 案さ れ， さ ら^に D illa ら^{2 41に}よ り^{コ ン} ピ^{ュ ー} タ ^ー解 析が可能と な^っ た^． こ のflo w cy to metry

くF C Ml が開発さ れ て 以来， 細胞周期の把 捉が短 時 間で 正確^に行な わ れ る よ う^にな り， 抗 癌 剤の細 胞 周 期^に及 ぼ す影 響が詳 細 ^に分 析さ れ る よ う に なって き た^{25 卜 32 ン}

当教 室で は， 林ら^{3 3I}が Sr8 9 誘 発骨 肉腫を対象と す る in viv o実験で， ま た平井ら^細はヒト骨 肉腫 培 養 細 胞 O S T 株を対 象と す る in vitr o 実 験で， そ れ ぞ れ M T X， V C R 及び A D M の3 剤が細 胞周期^に及 ぼ す影 響を F C M によっ て解 析し報 告し て^いる^．

今回著 者は O S T 株を対 象と し， M T X ，V C R ，A D M の 3剤の投与慣 序， 組み合わ せに関し て抗 癌 剤^の細 胞 周 期^に及ぼ す影 響と増 殖 抑 制 効 果を， F C M によ^っ て検 討し， 多剤 交 替 併用に おけ る 至適 投 与 法の確立 を目 的

と して研 究を行な^った．

材料^およ び方法 工． 実験 材 料

1 ． 骨 肉腫 細 胞

当教 室の高 瀬ら^矧 によ り樹 立さ れ， 以来 継 代 保 持さ れ て^いるヒト骨 肉 腫 由 来 培 養 細 胞O S T 株を使用 し た． この O S T 株は紡錘 形 細 胞像を 示 し，単層に増 殖す る培 養株^であ り． その g^{e n e r a}tio n tim e は 4 0 時 間^であ る^{8 6I}．

2 ^． 細 胞 培 養 い 培 地

非 働化 く5 6⁰C， 30 分ンウシ胎 児血清を 20％濃 度に添 加し た市 販 合 成培 地R P M I 16 4 0くp壬i r O−^7．41 を 用^い

た．

2ユ 培 養 瓶

75 c m ²組 織 培 養^フラ^スコくCo r ning 社l 及 び 8^{c m2ス} ラ イ ド ガ ラ^ス付き組 織 培 養用^フラスコ くFalc o n 社I を 使 用し た．

3ン 培 養方 法

培 養 液2 0 ml中^に5 Xl O⁵個^の O S T 株 細 胞を移植，

3 7⁰C， 4 8時 間 閉鎖 的^に静 置 培 養^し， 単 層に増 殖し た細 胞を C8

廿 及び M g

什 を含ま な^いリ^ン酸 緩 衝 塩 類 溶 液 くP B Sう^{に て}2 回洗 浄し た後， 0^．2 5％ト リ プシ ン溶 液

平

にて処理 し，剥 離さ れ た細胞^の浮 遊 液を，1 0 00 rpm ，5 分間 遠心^一後た だ ちに細 胞 数1^．5−^{2．OX lO5ノml にな る}

よ う^に前 記培 養 液 中^に再 浮遊し た^． 3 ^． 抗 癌 剤

代 謝指 抗 割と して， m ethotr e x ateくM T X ，日本^レダ リ^ーl を， アルカ^ロイ ド剤はvin c ristin eくpn c o vin，塩 野義 製 薬1 を， ま た抗 癌 性 抗 生 物 質は， adria mycin

くad^ria ciⁿ，協和醗酵1 ^を使用 し た．

4 ． 抗 癌 剤^の作用濃度 及び時 間

各 抗癌 剤は 生 理食 塩 水に溶 解せし^め， そ れ ぞ れ100 J^Jgl ^ml^．10 _{p g}ノ^ml^．1J^Lgl ^ml^．0．1F^Lglml^．0^．01 i^Lgノml 濃 度 液を調製し た． こ の溶 液1 ml を前 記培 養 液¹9 ml 中に加え， 5FLgJ^lml， 0^．5F^Lglml， 0^．05F^Lglml 及 び 0^．0 0 5_{月 g}ノ^ml の薬 剤 含有 培 養 液を調 製し た．

単 剤作用^の場 合， 細胞 増 殖 抑 制が認め ら れ た各 薬剤 の最 少 有 効 濃度を低 濃度と し，そ の 1 0 倍量 を高 波度と し たく表¹J． ま た， 2 剤 及び 3 剤 交替 併用の場 合， 低 濃 度^の薬 剤の組み合わ せ を低 濃度作用群，高 波 度^の組み 合わ せ を高 濃度 作用群と し た^． す な わ ち低 濃 度 群は，

A D M O^．0 5_JJgノ^ml，V C R O．0 0 5JJgl

J

ml，M T X O．5j^Lglml を含 有し， 高濃 度 群は そ れ ぞ れ 0．5_声gノml，0．0 5_ノノgノml，

5．恥gノml で あ^った^．

O S T 株 細 胞^に対す る薬 剤^の作用時 間は，

一 律^に細 胞

の ge n e r atio n tim e の約 半分に相 当す る 24 時 間と し た^．

5 ^． 増 殖 抑 制 試 験 1う 単 剤作用群

O S T 株 細 胞を⁴8 時間 静 置 培 養後， 各 抗癌 剤を そ れ ぞ れ単独^で24 時 間 作用 さ^せた後， 薬剤を除 去し， 以後 9 6時 間まで逐次D N A ^{ヒ ス}ト グ ラム の検 討， 生 細胞 数 測 定な ら び^に細 胞 像 観 察を行な^った^．

2I 2剤及 び 3 剤 交替 作用群

O S T 株 細 胞を 4 8 時間 静 置 培 養後^， 第1 の抗 癌 剤^を 2 4時 間作用 さ^せた後 除 去し， 次^{い で}第2 の抗 癌 剤を同 様に 24 時 間作用 さ せて から薬 剤を除去し，さ らに新鮮 培 地 中^で 96 時 間培 養し た． その間，

一 定 時 間ご とに単 剤 作用群^の場 合^のご と く諸項 目^につい て検 討し た^． ま た， 3剤 交 替 併用の場 合^には第2 の抗癌 剤を除去後さ ら

Table l． D o s ele v els of a ntic a n c e r age nts

Antic a n c e r age nt

Fin alc o n c e ntr atio nくp gl^mり Lo w do s e H igh do s e

M ethotr e x ateくM T Xl 0^．5 5^．0

V in c ristin e くV C RJ 0．0 05 0．0 5

A d^ria m y^cin くA D MJ 0．0 5 0．5

多剤併用療 法^によ る細 胞 動 態の F C M か ら の解 析

に第3 の抗 癌 剤を 2 4時 間作用 さ せ た後，同 様^に処理 し 検討し た． なお_，単 剤及 び多剤 併用作用群と併 行し^て，

そ れ ぞ れ抗 癌 剤非 含 有 培 地での細 胞^について， 同様^の 処 理操 作を行な^い， これ を対照群と し た．

6 ． F C M 測定

抗 癌 剤 添 加培 地^の培 養細 胞^{に つ い}て検 討し た． 培 衰 細 胞を遠^JL⁻後細 胞 沈 漆^{に5 0}％^メタノ ^ー ル1．O ml を加

え 固定し， 次いで K risha n ら^{3 7 1}の方 法に従^い， 5 倍蓋

の p^{r o}pid iu m iod ide 溶液 く0^．0 5 m gノ^ml_，0．1％^{クエ ン} 酸^{ソ ー} ダ溶 液1 で O S T 細 胞核を染 色後， F lo w cy to^q m ete r くIn str um e nts C_{y t}og^{r a}f Syste m 5 0印 ^に投入 し， 1^．5^XlO⁵偶の細 胞を計 測して D N A ヒ スト グ ラ^ム を得た． D N A ヒ スト グ ラムと細 胞回転^にお け る各周 期の関 係は図1 に示 し た^．

7 ． 生 細 胞 数の測 定

自動 血 球ア ナ ラ イ ザ ^ー くCo ulte rE le ctr o nic sl によっ

て全 細 胞 数を測 定し， ま た ト リバ ンプル ^ー排 除 試験^に よ^って生 細 胞 数を計 測し て， 生 細胞 率を算 定し た．

8 ^． 細 胞 像 観察

抗 癌 剤 添 加培 地を 入 れ た 8 c m ²スラ イ ド ガ ラ^ス付き 組 織 培 養用^フラスコ中で培 養し た O S T 株 細 胞を， 倒 立位 相 差 顕 微 鏡下で細 胞^の形 態 学 的変 化^を継 時 的^に観

55

察し， さ ら^に培 養液を除 去後， 95％エタノ^ー ルで固定 し， H E 染 色を施し た標 本^{につ い}て， mitotic inde x

くM 工1 ^の算 定， 細 胞^の形態 変化な ど を検 討し た^．

S

t

芯 U

−

0

し

む q

E

コ N

し −

r ⁻J ^し

．．．−．．．．一一1戸 −．^J

ト^bn⁻Divi ding D ivid ing Co mp^{a r}tr n e nt Co mp^{a rtm e n}t

Fig^．1． D N A h istogr a m byflo w cy to metryくF C Mン．

4 8 hr

くT im e afte r r e m o v al of M T Xン

F ig^．2^． D N A h istogr a m s of O S T c ell lin e tr e ated with M T X in vitY O． A，n O ad d itio nこB，

lo w do s e of M T XニC，h igh do s e of M T X^．

5 6

成 績

工． 対照群

1 ^． D N A ^{ヒ ス}ト グ ラ^ム

継 代 培 養 直 後で は， 2 C くG O 期 及び G l 期 細 胞 集 団1

に ピ^ー ク を もつ単 峰性^に近^{い パ}タ^{ー ン}が出 現し た が，

2 4時 間後には定型的な 2 C と 4 CくG 2 斯及 び M 期細 胞 集団1の 2 峰性^パタ^{ー ン}を 呈 し， 4 8時 間， 9 6時 間後^に も ほ ぼ同 様^{の ヒ ス}ト グ ラムが み ら れ たく図21． し か し 培 養¹3 2時 間 後か ら徐^{々 に}4 C の減 少が認め ら れ， 1 68

時間 後で は 4 C の ピ^ー ク は消 失し， 2 C 単峰 性^に近^{い パ} タ ^{ー ン}が 示 さ れ た^．

2 ^． 生細 胞 数

培 養24 時 間後か ら生細 胞 数^は指 数 函 数 的^に増 大し た が，1 20 時間 後^に増 殖 速 度が や や低 下し，1 8 2 時 間後

には プ ラ ト^{ー に}なった く図3う．

3 ， 細 胞 像 く検 鏡 観 察う

円形ま た は楕 円形の核を有す る紡 錘 形 細 胞が大 部 分 を占め， と き^に多 核 巨細 胞も散 見さ れ た． M I は， 培 養 直 後で は，1．0％^であっ た が，細 胞 数^の増加と と も^に高 く な り，最 大値1^．6％に達し た^． そ^の後 増 殖 度の低 下と と もに減 少し， プ ラ ト^{ー に}な^った時 点で は 1 ^．0％に復 し た く写 真11．

平

H ． 単 剤 作用 群 1 ． M T X

い D N A ヒ スト グ ラム

高濃 度 及び低 濃度と も^に薬 剤^の除 去 直後^には，4C が 減少し た 2 C 単 峰 性^に近いパタ^ー ンが出 現し， わずか に3 C くS 期細 胞 集 団を 3 C と表 現ぅの増加が認め ら れ た が薬 剤 除 去⁴⁸ 時 間後^には 4 C が増 加し， 対照群の^ヒ スト グ ラ^{ム に}近いパタ^{ー ン}を 呈 し たく図2う．

21 生細 胞 数

M T X の高 濃 度及び低 濃 度作用 下 で は， わずか に増 殖が抑 制さ れ た が， 薬 剤の除 去と と も^に急速^に増 殖が 認め ら れ た く図31．

3 ト細 胞 像

M I は 0^．3％と対照群^に比 し や や減 少し て^いる が，細 胞 形 態^には著明 な変化は認め ら れ な か^った く写真1う．

2 ． V C R

い D N A ^{ヒ ス} ト グ ラム

高 濃 度 及び低 濃 度 作用下で， 薬 剤 除 去 直 後に は 3 C 及び 4 C ^の増加 傾 向が認め ら れ た が， 除 去4 8 時 間後に は 2 C と4C の2 峰 性^に近い パタ ^ー ンを 示 し，対照群 同 様^{の ヒ ス}ト グ ラム にほ ぼ復元 し た く図41．

2う 生細 胞 数

薬 剤 共存 下で は， 増殖 抑 制 効 果は著 明^であ^った が，

0 2 4 J 8 7 2 1 2 0 0 ヱ 4 4 8 7 2 1 2 0 0 2 4 4 8 7 2 1 2 0 0 皇1 4 白 7 2 1 2 0くぉつ

1n池 上1 ぴI t ま正8

F ig^．3^． Gr o wth in c ultu r e of O S T c ell lin e tr e ated with M T X，V C R o r A D M −

Oste o s a r c o ma c ells l^．5−^{2．O Xl O5w e r e in o c ulated into c ultu r e m ed iu m a nd in c ubated at}

3 7⁰C fo r48 ho u r s． A ntic a n c e r ag^{e n}t w a s ad dedto the c ell c ultu r e at the stated do s e sa nd the nin c ubated^． A fte r 2 4⁻ho u r s^，in c ubatio n the age nt w a s w a shed o ut a ndthetr e ated

s a r c o m a c ells w e r e in c ubated at3 7⁰C afte r ad dingfr e sh c ult_{u r e} m ed i^{u m ．} く ^M ，n O n eニ ^{．−．−．．}，h igh do s e r−−，lo w do s eン．

多剤 併用療 法^{によ る}細 胞動態^の F C M から^の解 析

No n e

く^{C O ntr O}l

5 7

H ^，E stain く^X4 0 01 P ha s e obs e r v atio nく^X15 01 P hoto l． M ic r o s c opic al findings of O S T c ell lin etr e ated in vitr o with M T X，V C R a nd A D M

i n e a ch^ホ．

ホP hotog^{r a}phed im m ed iately afte r r e m o v al of a ntic a n c e r ag^{e n}t−