研 究 療 法 開 発 関す 基礎的 新 腫 瘍 抗体 用 融合腫 瘍 特異的

金 沢 大学 十全 医 学 会 雑 誌 第1 0 4巻 第6 号 6 55 ^‑6 6 7 (^{1 9 9 5})

サイ トカイ ^ン 融 合腫瘍特 異 的^{モ ノ ク ロ ー ナ ル} 抗体^を用 ^{い た} 新 ^しい 腫瘍^{ク ー} ゲ テ ィ ン グ療法^の 開発^に関 す^る基 礎 的研究

金 沢 大 学 医 学 部 内科 学 第^三講 座 (主任^: 松田 保 教 授)

織 本 健 司

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腫 瘍 関連 抗 原と して の多剤 耐性 遺 伝子産物P 糖蛋 白^に対 する^マ ウスモノ クロ ^ー ナ ル抗 体M R K 1 6 は, マウスを 用^いた動 物 実験^で! 単 独 投 与^によ り P 糖 蛋 白 強 発現^{ヒ ト}卵 巣 癌細 胞 株^{278 0A D の}生 体 内^での腫 瘍 増殖^を抑 制すること が知られている.

本 研 究^{ではク ー ゲ テ}ィ ング に用^いた抗 腫 瘍^{モ ノ クロ ー ナ ル}抗 体が腫 瘍 局 所で^エフ ェク タ ^ー細 胞を効率よ く活 性 化^でき, 抗 腫 瘍 免 疫 効果を さ らに増 強させ ること を目的と し て, ヒト免 疫^{グロブ リンI}gClの可変 儲 域を M R K 1 6 ^の可変 領 域で置 換^{し たマ ウス}

ー ヒト キメ ラ抗 体^と, サイ トカイン分 子^{のイン タ ー ロ}イ キ^ンー^{2(inte rle uk in‑2,Ⅰし2}), イ ンタ ^{ー ロ}イ キン^ー4(inte rle ukin‑⁴), 顆 粒

球 ^{‑ マク ロフ} ァ ^ー ジ^ー コ ロ ニ ^ー刺 激 因 子 (gr a n ulo cy te‑^{m a C r OPhage c olo n}y^‑Stim ulatingfa cto r,G M‑^{C S F) を遺 伝 子工学 的 手 法で} 結 合さ せ, 3 種 類^の新しい サイ ト^カイン融 合抗 体^を作 成^{し た. こ}れ ら^の融 合蛋 白は^いず れ も抗 体^{と し ての}特 異 的抗 原 結 合 能を 維 持^し, かつ _, サイ トカイ ン分 子と し ての活 性 も 保 持^{し ていた.I L‑2},I L‑^{4 融 合抗 体ほ観 換え}体^{Ⅰし 2 と}比 較^{し て}比 活 性^が減 弱 し ていた が, G M‑^{C F} 融 合抗 体ほ敵 換え体 G M‑^{C S F と}同 等り比 活 性^を維 持^{して いた.} 比 活性^の減 弱は抗体 分子との結 合に伴 う, サイ ト^カイン分子^の高 次 構 造^の変 化^によ る 可能 性が 示唆さ れ た^. 試験 管 内^ので抗 腫瘍 活 性を調^べた結 乳 3種 類の サイ ト カイ^ン融 合キメ ラ抗体^はいずれも 抗 体 依 存性 細 胞 傷 害 性(a ntibod_y^‑dep^{e n}de nt c e11ula r cy toto xici_{t y}, A D C C) 活性を保 持し て お り, 作 動 細 胞/標 的 細 胞 比 (^{effe cto r}/^{ta r}getr atio,E/^T 比) 依 存 性^をこ細 胞 傷 害 活 性の増 強 効 果を 示 し た ^. I L^‑2 お よ び,

G M‑^{C S F 融 合 抗 体は対 照と し たサイ ト カインを}結 合して いな^いキメ ラ抗 体と比較し て傷 害 活性^の増 強 効 果^を認^{め た が}, I L 4 融 合 抗 体^の細 胞傷 害 活 性は対 照キ^{メ ラ}抗 体^と比 較^して有 意^な差^を認め な かった^. 生 体 内で の腫 瘍移 植 実 験^で, 三種 煩^{の サ}イ ト カイ ン融 合^{キメ ラ}抗 体^はいずれも 対 照 群と比 較して腫 瘍増 殖 抑 制 効 果^{を 示 し た が}, そ^の増 殖 抑 制効 果は^サイ ト^カイ ンを結 合^し

て いな^いキメ ラ抗 体 投 与 群と比較し て有 意な差は認め られ な かった. こ の試 験 管 内^と生体 内^での抗 腫 瘍 活 性^の差 異は全 身 投与

にともなう 末梢 鮭 織^{での サイト カイン}受 容 体^への吸着, 分 子 量増 加に ともなう 阻 織 移行 性^の低 下な ど^の影 響が 示唆された. 投 与 経 路な ど を 工夫 する^こと^によ り, サイ ト カイ^ン融 合^一抗 腫 瘍^{モ ノ ク}･^{ロ ー} ナ ル抗 体^は腫 瘍 免 疫 療 法^{におい て}抗 腫 瘍^{エ フ ェ ク}

タ ^ー 細胞^の有 力な^{ク ー} ゲテ _ィ ソグの手段 と な ること が期 待さ れ る^.

K ey ^{w o}rds cy t^okin e, m On O Clo n alantibod_y･fu sio n p^rotein, m ultidr ug ^re sistanc e_,im m u nothe r ap y

近 年 分 子生 物 学 的 手 法や免 疫学 的手 法によ り多く^の腫 瘍 特 異 的 抗 原が同定さ れ て お り^{l ト 7 )},

エ フ ェ ク タ ^ー 細 胞^の標 的と な り うる^こと が わ かっ てき^た. 腫 瘍 抗 原 特 異 的^{モ ノ クロ ー ナル}抗 体 が得ら れ れば, そ れ を 用い て抗体 依 存 性 細 胞 傷習 性(a ntibod_y‑

depe nde ntc ellula r cy toto xici_{t y}, A D C C ) 作^{用 を}介^{し た}抗 腫 瘍^エ

フ ェ ク タ ^ー細 胸^{の ター ゲテ} ィ ング が 可能^である^{8 ト 1 2 )}

最 近, 腫 瘍 免 疫^の誘導お よ び活 性 化に重 要^{なサイト カイン}分 子^の機 能^が解明 さ れ^{て い}る. イ ンタ ^{ー ロ}イ^キンー^{2 (int e rle uk in‑}

2,I L‑²), イ ^ンタ ^{ー ロ}イ キ^ンー⁴(inte rle ukin^‑4_,II,^{;4), 顆 粒 球 ‑ マ}

ク^ロ フ ァ ^ー ジ ^ー コ ロ ニ ^ー 刺 激 因 子(gr a n ulo cy te‑^{m a C r Opha}g^e C Olo nystim ulatingfa ct_{o r},G M^‑C S F) な どの サイト カイン分 子ほ

ナ チ ュ ラ ル キ ラ ^ー 細 胞,

マ ク ^ロ フ ァ ^ー ジ, 好 酸 球な ど^の A D C C 活 性^を有す^{るエ フ ェ ク タ ー} 細 胞を活 性 化^し抗 腫 瘍 効 果

を増 強 す^{ること が}報告さ れ^{て い}る1 3 卜 2 1 )

. さ ら^に, 特 異 的 抗 腫 瘍 抗 体と G M‑^{C S F,I L}‑2 な どの サイト カインを同時 投 与 する^こと によ り抗 体 単 独 投与^の場 合よ り抗 腫瘍 効 果が増 強さ れ る^こと な

どか ら, 抗 腫瘍 抗 体と^サイ トカインほ腫 瘍局 所^で協 調 的^に働き 抗 腫 瘍 効 果を増 強し ている^こと が 示唆さ れ ている^{2 2 ト 2 4),} 以 上^の 知 見よ り, 腫瘍 特 異 的モノ ク^{ロ ー} ナ ル抗 休^{とサイ トカイン}分子 を結 合^{させることに}よ り, 腰 瘍 局 所^で抗 腫 瘍^{エ フ} ェク タ ^ー 細胞 を効 果 的に活性 化し ∴陸瘍 免 疫 効 果を増 強^できる 可能 性^が考^え ら れ た.

そ^{こ で} 仁腫瘍 特 異 的 抗原^{をタ ー ゲッ トと し た}免疫 療 法^の治療 実 験^モデルの作 成が 必要である と考^{え た.} 現 在, 数 多 く^の腫 瘍 特 異 的^{お よ び}腫 瘍 関 連抗 原^が同定さ れて いる が. その機 能お よ び性 状^{につい て}解 明さ れ て^いるも^のは 以外に少なくt 特 異 的腫 瘍 免 疫療 法^{の モデル}と な り う る適 切な^{タ ー} ゲッ トほ極めて少な い.

多 剤 耐性 遺 伝 子 産物^P 糖 蛋 白^ほ分 子 量^{1 7 0 ‑1 8 0 k Da の}膜 蛋 白^で, 種^{々 の}細 胞 傷害 性 物 質^を細 胸 外^へ能 動 的に排 泄する トラ ン スポ ^ー タ ^ー と し て機 能し て^いる^{2 5 ) 2 6)}. 種^{々 の}多 剤 耐 性 腫 瘍^ほ か, 化学療法 後^に新^たに多剤 耐性を獲 得し た腫 瘍^でも P^一糖 蛋 平 成⁷ 年⁸ 月25 日受 付, 平 成7 年^{1 0月1 7 日}受 理

A b br e viatio n s ‥ A D C C ･ antibod_y^‑dep^{e n}de nt c ellular cy t^oto xici_{t y ;} B S A , bo vin e s e ru m albu mip ^; D M E M ,

Dulbe cco m odified E agle

,

s m ediu m ; F B S , fetal bo vin e s er u m ; F I T C, flu o fescein is othiocy^nate; G M ^‑C S F,

g^{ra n u}lo cy t^{e‑m aCrO}phag^{e c o}lo ny^‑Sti_{m u}l^ating facto r_, H R P, ho r s e r adish _peroxida s e ;Ⅰし 2, inte rle uk in ^‑2 _;Ⅰし 4,

白^の発 現が増 強して いること が知ら れ^{て い}る^{2 丁卜 2 g ).} ま た, 多 剤 耐 性 遺 伝子^の発 現^{が c‑Ha}‑^{Ra s や}変 異型 p5 3 遺 伝 子産 物^によ り 増 強 する^ことも 報告さ れてお り^{3 0}＼P 糖 蛋白は腫 瘍^の悪 性 化^に も 関 与 する腫 瘍 関連 抗 原と考え られる. 多 剤 耐 性 遺 伝 子 産 物 P 糖 蛋 白^に対する^マウス モ ノ ク^{ロ ー} ナル抗 体がいく^つ か作 製さ れて いる^. そ^のう ち^{の 一} つである M R K 1 6 は P 糖 茸 白^の細 胞 表 面^{のエ ピト ー プ を}認 識 す^{るモ ノ クロ ー ナ ル}抗 体^で, 生 体 内でも P 糖 蛋 白 発 現細 胞を認 識できる唯 ^{一 の}抗 体^である^{2 5).} すで^に M R K 1 6 ほ単独 投 与^によ り P 糖 蛋 白 強 発 現^{ヒ ト}卵 巣 癌 細 胞 株 2 7 8 0^{A D}の ヌ ^ー ド^マ ウスでの腫 瘍 増 殖を抑 制 す^{ること が}報 告さ れ ている^{31 ).} ま た, ヒト^への臨 床 応 用を目 的と し て^マ ウス ^ー ヒ ト キメ ラ抗 体^が作 製^され^ている. 以上 よ り, 多 剤 耐性 遺 伝 子 産 物 P 糖 蛋白^は腫瘍 関連 抗 原^を標 的と し た特 異 的 腫 瘍 免 疫 療 法の

適 切な実^{験モデル にな り う る と}考^{え ら}れ^た.

本 研 究で はl ヒト免 疫グ ^ロ ブ リ ^ン IgCl の可変 領 域を M R K 1 6 の可変 領 域で置 換^{し た マ ウス ー ヒ ト キメ ラ}抗 体と I L‑^{2,I し4, G M‑C S F な どの サイ トカイ ン}分 子^を遺 伝 子工学 的手 法を用^いて結 合さ せ, 三種 類^{の サ}イ ト^カイン融合 抗 体^を作 成^し た. さ らに, これ ら^の作成し た 三種^{の サ}イ ト^カイ^ン融 合 抗 体^を

タ ^ー ゲ ティ ソ グ に用^い 仁腫瘍 局 所^{でエ フェ ク タ ー} 細 胞を効 率よ く 活 性 化^できる か どうか, 抗 腫 瘍 免 疫 効 果を増強さ せうる か ど うか を試 験 管 内お よ び生 体 内^で検 討したので報告 する^.

材 料 お よび 方 法

Ⅰ^. 使 用 細 胞

1 . マウ^ス形 質 細胞 由 来^{S P 2}/^0‑Ag1 4(A T C C C R L 8 2 8 7) 細 胞は融 合 抗 体 産 生^{のた めに}用^い, 1 0% 牛 胎 児血清(fetal bo vin e S e r u m ,F B S) (^{I C N . F L O W} , 大^日本 製 薬, 東 京) 添 加 ^{R P M I} 1 6 4 0 培 地 (日水, 東 京) で 5 % C O2_, 3 7 ℃ に て培 養し た^.

2 ^. ヒ ト卵 巣 癌 細胞 株2 7 8 0^{A D}細 胞^は多剤 耐 性 痛 細 胞^{で P} 糖 蛋白を強 発 現^{し ている. F A C S} 解 析^{のコ ン トロ ー ル}細 胞お よ び ヌ ^ー ド^マ ウス ^へ の移 植 実 験^に使用 し た . 1 0 % F B S 添 加 R P M I^‑1 6 4 0 培 地^で5 % ^{C O}2, 3 7 ℃ に て培 養し た^. ( 財) 癌 研 究 会癌化 学療 法^{セ ン タ ー} 分 子生 物 治 療 研 究 部 濱田洋 文 博士 よ り供 与さ れ た.

3 ^. ヒ ト多剤 耐 性 遺 伝 子 (^{hu m a n m ultidr u}g^‑r e Sista nt ge n e,

mdr^‑1) 導入^マウス B 1 6 F l O メ ラ ノ ^{ー マ} 細 胞 株 B 1 6 F l Omdr ほ A D C C ア ッセイの標 的 細 胞^に使 用し た^, 1 0% F B S 添 加ダル

ベ ッ コ変 法イ ^ー グル培 地 (Dulbe c c o m odified Eagle

'

s m ed iu m ,

D M E M) (^日水) ^{にて 5} % ^{C O}2,3 7 ℃ で培 養し た^. ( 財) 癌 研 究 会 癌^{化 学 療 法センタ ー}基 礎 研 究 部 杉 本 芳 ^一博士 か ら供 与された.

4 .

マ ウ^ス T 細 胞 秩 ^{C T L L‑2} (^{A T C C TI B 21 4}) 細 胞^は

Ⅰし2 お よ び I L‑^{4 の}生 物 学 的 活 性 測 定 用^に使 用し た ^. 1 0% F B S 添 加 R P M ト1 6 4 0 培 地に組 換^え体^{イ ン タ ー ロ イ キ ンー2} (^{r e c o mb in a}占t‑^{inte rle ukin}‑^{2, rI L‑2}) ( 塩 野 義 製 乳 東 京) を 5 0 U/

血 の濃 度に な る よう^に加え, 5 % C O2, 3 7 ℃ で培 養^{し た.} 5 . マウ^ス血管 内皮 細 胞 株^Endo‑1 は G M ^‑C S F の生 物 学 的 活 性 測 定 用^に使 用し た^. 1 0% F B S 添 加D M E M (^日水) ^{に て}5 % C O2_, 3 7 ℃で培 養^{し た.} ( 財) 痛 研 究会 癌 化 学 療 法^{セン タ ー} 分 子 生物治療 研 究 部溝^田洋 文 博士 よ り供 与さ れ た^.

inte rle ukin^‑4 ; L A K , 1_ym ph okin e a ctiv ated kill_{e r ;}

Ⅲ. プラ^スミド^の構 築

1 ^･ サイト カイン融 合 重鎖 発現プラス ミドの構 築

G M^‑C S F 融 合 重 鎖 発 現^{プラス ミ}ド^の構 築 手順を( 図1) ^に示 す^･ な お, 制 限 酵 素^ほ全て Ne w Engla nd B iolabs 社 (^{Be v e rl}y^, M A ,U^.S^.A)^{. の}ものを使 用^{し た.}

1) ^{ベク タ ー プ}ラス ミド pU C 1 3[( 財) 癌 研 究 会 癌 化 学療 法^セ

ンタ ^ー 分 子 生物 治療 研 究 部濱田洋 文博^{士 よ り}供 与さ れ た] は制 限 酵 素 ^{Ec oR I お よ び SaII で}切 断 後,

ベク タ ^ー相互^の再結 合を

防 ぐた めにウ^シ小腸^{ア ル カ}リフ_{ォ ス} フ ァ タ ^ー ゼ(^{c alf inte stin e}

alkalin e pho sphata s e,C I A P) (^{ベ ー リンガ ー ･ マ ン ハ}イ ^ム, 東 京) を 剛^､て緩 衝 液 中^にて 3 7 ℃ 3 0分 処理 し断 端を脱リン酸 化 後, 0^.8% ^アガロ ^ー ス ゲル にて泳 動^し, 約³,2 0 0塩 基 対 (ba s e pair, bp) 相 当^{の D N A} 断片を グラス ビ^ー ズ法^{に て}抽 出し た.

2) ^ヒト免疫グ^ロブ リンIgGl定 常 領 域^{ゲノ ム D N A} 挿入 プラ ス ミドpS V 2^‑H Glg p t[(財) 癌 研 究 会 癌 化 学 療 法^{セ ン ター} 分子生 物 治 療 研 究部 溝田洋 文博士 よ り供 与さ れ た】^を制 限 酵 素 ^{Ec oRI} お よ び NsiI で切 断^し, 0.8% ^{アガロ ー ス ゲル}に て泳 動 後, 約 1 7 7 0 b_p 相 当^のD N A 断 片を グラス ビ^ー ズ法にて抽 出し, 免 疫グ

ロブ リン定常 領 域 D N A 断片 (^{C H}‑^{. C H, 5'fr a}gm e nt) を得^た. 3) ^上述^の pS V 2‑^{H G‑}g P t を鋳 型と し て 2 組^{の オ}リ^ゴヌ ク レ チオ ド プライ ^{マ ー}対 (oligo♯6 21, 5‑^{'A C G} C C T C C C G T G C T G G A C T^‑3^'; Oligo# 6 2 2, 5^'‑^{C G C C T A G G T G G C G G T G G A}

A A T G G G C C T C T G T C C C T C T C^‑3^') を用^いて P C R で D N A 断 片を増 幅し, 制 限 酵 素 ^{NsiI お よ び B a m H I に}て切 断 し, 4% ^{アガロ ー ス} ゲ^ルにて泳 動 後, 77 bp相 当^の D N A 断 片を グラス ビ^ー ズ法にて抽 出し, C H｡3¹D N A 断片 (^{C H}33^'fr agm e n‑

t) ^を得^た.

4) プラス ミドpG E Mn e o[( 財) 癌 研 究 会 癌 化学 療 法^セ ンタ ^ー

分 子 生物 治療 研 究 部 演田洋 文 博士 よ り供 与さ れ た】を制 限 酵 素 Ba m H I と SaII で切 断^し, 3% ^アガ^{ロ ー} ス ゲル で泳 動 後,

D N A 断 片を グラス ビ^ー ズ法で抽 出^し, 4 8 0 bp 相 当^の長さ^のポ リアデ ^ニ ル化^シグナ ル (polyade nylatio n sign al) D N A 断 片 (poly A fr agm e nt) を得た.

5) ^{マ ウス G M}‑^{C S F cD N A 挿入 プラス ミ ド}pU 8^‑m G M‑^{C S F} [( 財) 癌研 究 会 癌 化 学 療 法^セン タ ^ー 分 子 生 物 治 療 研 究 部 溝^田洋

文 博士 よ り供 与さ れ た] ^を鋳 型^{と してオ リゴヌ クレチオ ド プラ} イ^{マ ー}対 (⁰Iigo‡6 2 3. 5^'‑G C G G A T C C G G C G G T G G T G G A A G T G G T G G A G G A G G T T C G G T A C C C A C C C G C T C A C C C A T C A CT^{3'; 01i}g^o‡4 7 8, 5‑^{'C C G G A T C C T C A}

T T T T T G G C T T G G T T T T T T G C A T T C A A A G G G G^‑3^') ^{に てP C R} 法^{で D N A} 断 片を増 幅し, 制 限 酵 素Ba mH I で 切 断 後, 3% ⁷ ガ^{ロ ー ス} ゲ^ル で泳 動し, 4 1 7 bp 相 当^の D N A 断 片を グラス ビ ^ーズ法で抽 出^し, リンカ ^ー ー^{m G M}‑^{C S F D N A 断} 片 (^{1inke r‑m} G M‑^{C S F fr a}gm e nt) を得た^. 前 述^{のベ ク タ ー} D N A (pU C 1 3) 断 片^に , これ ら 4 種 類の D N A 断 片 (^{C H}一,^{C H35'fr a}‑

gm e nt, C H33^'fr agm e nt, 1inke r^‑m G M^‑C S F fr agm e nt_, POly A fr agm e nt) をライ グ ^ー ショ ンキッ ト( 宝 酒 造, 東 京) ^を使 用^{し て}

2段 階^で挿入 し た(^{プラ ス ミド} pU H G.‑^{m G M}‑^{C S F).}

6) ^ヒト P 糖 蛋 白^に対 するヒト ^{ー マ} ウスキメ ラ抗 体 M H 1 6 の重 鎖挿^{入 プラス ミド} pB S V｡ 1 6r( 財) 癌 研 究 会癌 化学療法^{セ ン} M O P S , 3^‑【^{N‑m Ol}ph ^olin o m] p^{r o}p^{a n e s u}lfo nic a cid ; P B S ,

pho sphate^‑buffe r ed salin e; P G K , pho sphogl_yc erate k in a s e; P ol_y A , P ol_yadenylation si_gnal; R T^‑P C R,

r e v e r s etr a n s c ri_{p t}io n^‑p^Ol_y m e r a s e chain reactio n; T E, T ris E D T A