粘膜癌 臨 床 応用 腔 併 用 療 法 関す 基礎的検討

金 沢大 学 十 全 医学 会 雑誌 第1 0 2巻 第1号 1 7 ^‑2 7 (1 9 9 3)

O K ‑4 3 2 ^･ ブ ^レ オ ^マ イ ^{シ ン}併用療法^に関 す^る基礎 的検 討 な ら びに 口腔粘膜癌^{へ の}臨床応 用

金沢 大 学 医 学 部 歯科^口腔 外 科学 講座 ( 主 任^: 山本 悦 秀 教授)

能 崎 晋

( 平成⁵年¹ 月6 日受 付)

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ブ^{レ オ マ}イ^シン (b le o my^cin, B L M) と O K^‑4 3 2 を併^{用 し た}免疫 化 学 療 法は ∴組織 学 的^に低 悪 性 度^{の 口}腔 扁 平^上皮癌^に対

し^て効 果 的な療 法である^こと を経 験し てき^た. し か し, そ^の抗 腫 瘍 効果 発 現に関与 す^る宿主介 在 性^{につい ては}, いま だ 不明な 点が多^い. そ^{こ で}, 本 研 究^では 両薬 剤^の併用効 果を基礎 的^に明 ら か^にする 目的で, こ のような併 用 実 験に頻 用さ れて いる^マウ

スの実 験 系^であ^{るメ チ ル コ ラン トレ ン}誘 発 線 維 肉 腫^{M eth‑A} 細 胞/^{B A L A}/^{c マウスの}系を用^{い て} ▲ 抗 腫 瘍 効果お よ び免疫 学 的

パ ラ メ ^ー タ ^ー を検討し た^. 実 験^には 6週 齢 雌 性^の B A L B/^{c マ ウス}を 用^い, そ^の右 鼠径 部 皮 下^に同 系 腫 瘍である Meth^‑A 細 胞 1 0⁶ 個 移 植^{した. B L M と O K‑4 3 2 の}投与 量, 投 与^{ル ー ト お よ び その}投 与時 期^を変 化^{さ せ}, 担 痛^{マ ウス に}投 与し た ところ,

O K‑^{4 3 2 を腫 瘍移 植6 日}後^{に5 0 K E}/^kg の投 与 量^で腫 瘍 内^に投 与^{し た}後^に.B L M を踵 瘍移 植8 日後^に1 0 0m g/^kg で静 脈 内投 与 した とき^に最も優れ た併用効 果が認め られ た(O B 療 法). こ の O B 療 法^の効 果ほ T 細 胞^の欠 如^{し たヌ ー ドマウスや マ ク ロ}

フ ァ

ー ジの活性を消 滅^{さ せ たマ ウス では}減 弱な^いし は消失^{した が}, ナ チ ュ ラ ルキ^{ラ ー}細 胞^の活 性を消 滅さ せ た^マ ウスに おいて は変 化を認め な か^った^. O B 療 法を施 行し た非 担 癌^マウ^ス の脾 臓^では溶血斑 形 成 細 胞数が増加して い る^こと か ら, 本 療 法が抗 体 産 生 能^を増 加^{さ せ る と}考^{え ら れ た. ま た}, フ ロ ^ー サイトメ ト リ ^ーで, 脾 細 胞^のT細 胞^{の サブセ} ット を検 討した ところ, ヘル パ ^ー/^{インジ ュ ー サ ー T}細 胞^に特 異 的^である L 3 T 4 陽 性 細 胞が増 加して いた^. し た がっ て, O K‑4 3 2 と B L M の併 用 療 法^の効 果 発 現には^{マ クロ} フ ァ

ー ジ と^{ヘル パ ー} T細胞が強 く 関 与し て^いる と ともに , 口腔 扁 平^上皮 癌^に対す^る有 効^な免疫 化 学 療 法^にな^る

こと が臨 床 応 用 例^での成 繚と併せ て 示唆され た^.

K ey ^{w o r}d^s O K‑^{4 32,bleo m}ycin,im m u no che m othe r ap y, M eth^‑A fibro sa r c o m a

口腔 粘 膜 癌^に対 する本 邦^{で の}化 学 療 法^の歴 史^の中で, 1 9 6 6年

Um e z a w a ら^{l )2 )} に よ っ て見^い 出さ れ た ブ レ オ ^マ イ シ ン

(^{ble o m}ycin, B L M) ^の登場^ほ, 癌 化 学 療 法 単 独^で治 癒を期 待^で

きる抗 癌 剤と して新しい時 代を開くも^のであ^った^. し か し, そ の効 果^を期 待 す^るあ^{ま り}, 投 与 量^が増 加^し肺線 維症^を惹 起^せし め た苦^い経 験 もしてきた^. そ^の後^{, シ ス} プラ チ ンな ど^口腔 粘膜 癌^にも 有 効な抗 癌 剤を中心^に幾 多^の多 剤 併 用療 法が試み ら れ,

奏 効 率^ほ向^{上 し た が}, そ れ が 必ず^しも 生 存 率^の向上^にほ貢 献し

て いない のが現 状^である^{3 ト 5).} そ^の理由と し て, 抗癌 剤^の腫 瘍制

御^が麒 著^に認^{め ら れて}も, 宿^主の全 身 的^な免疫 機 能^の低 下^によ り^, 免 疫 的 監 視 機 構^が弱ま ること が考え ら れ る^. こ の こと はl

治 療 効 果や患 者の日常 生活^の質 (q^uali_{t y} of life, Q O L) ^を考^{え る} 上 で, 決し て望ま し^い現象^{と は}言え な^い. した がって, 癌 化 学 療 法を行う際^に, 腫 瘍 局所^に対 する効 果だけでなく, 免 疫 能な ど を含^{め た}宿 主 側^の反 応をも 十 分^に考 慮 する^こと が 必要と な る^.

こ のよ うに, 多 く^の抗癌 剤^{は 一}般 的^{に は}免 疫 抑制 作 用を 示す と考え ら れ ている が, 抗癌 剤^の種 類t 投 与 量, 投与 期 間, 投 与

時 期な どによってほ, 担 癌 生 体^の抗 腫 瘍 免疫^を増 強 すること が 報 告さ れ て^いる^{6 ).} 筆 者らも, 日常^の臨 床^におい て, 少 量^の抗癌 剤 投 与^のみで十 分な腫 瘍 縮 小 効果^が認め ら れ た症 例を し ば し ば 経 験して いる^. そ れ ら^の症 例^に対 する抗 癌 剤^の投 与 量か ら考え て , 抗 癌 剤^には直接 的 効 果^のみ な らず, 宿主介 在性^の抗腫 瘍 効 果^の関 与が 示唆さ れ る^. こ のよ う な抗 癌 剤^の免 疫 増 強 作用, す な わ ち, 抗 癌 剤^の生 物 反 応 修 飾 物 質 (^bioIogic al r e spo n s e m odifie r, B R M ) 様作 用は癌 化学 療 法の治 療 効 果の向上に寄 争 するも^のと考え ら れ る^.

一方, 癌化 学 療 法^の効 果 増 強を意 図し^て, 非 特 異 的 免疫 療 法 剤と抗 癌 剤を併 用 する免 疫 化 学療 法が臨 床 的^にも試み られる よ うにな った. そ れ ら免 疫 化 学 療法^{の1 つ と して}, O ka m oto ら^T) によ る溶 連菌^の乾 燥菌 体 製 剤^である^{ピシバ ニ ー ル} (O K^‑43 2) と B L M を併用^{した B O} 療 法^が考 案^{さ れて}臨 床^{におい て}試行^{さ れ}

て いる^8). 本 併用 療 法は, サブ ^レ ッ サ ^ー T 細 胞 (s up pr e s s o r T

C ell) ^に対 する抑 制 効 果^によ り免 疫 賦 清 作 用^を有 す^{る と さ れ る} B L M^{9 )}に, 種^{々の サイ トカイン}を誘 導 する O K‑^{4 32川)を併用し},

両 薬 剤^の免疫 能 増 強作 用を相 乗 的^に得ようとするも^{の で}ある^.

A b br evi atio n s : B L M , ble om y^cin ; B R M , biologi^{c al res}p^{o n s e m} odifie r; D M S O, dim ethyls ulfo xide; F C S ,fetal

C alf s e r u m ; F I T C, fluo res c ein is othio cy^{an a}te;IL ^‑1, inte rle ukin l _;Ⅰ.R.,inhibitio n r atio; M T T, 3^‑(⁴ふ^{dim eth}yl^‑ thia z ol^‑2^‑_yl)‑^2,5‑diph^{e n}_yltetr a z oliu m br o mide; N K , natu r al kill_{e r ;} P B S, pho sphate^‑buffe r ed salin e; P E,

ph_{yc o ery t}hrin; Q ^{O L}, q^{u a}lit y ^of life; R P M I, Ro s w e11 Pa rk M e m o rial In stitute

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筆者らも, こ の考 え^に基^づき 巨魁織 学 的に低 悪 性 度^{の 口}腔 粘膜 癌症 例^に対し て, 本 療 法を試 行L , そ^の有 効 性^を認^{めて い る1 1 ).} し か し, その抗 腫 瘍 効 果 発 現^の機 序, 両 薬 剤^の至 適 投 与 法な ど 不明 な点^が多^い. そこ で_, 両薬 剤^の併 用 効 果を明ら かにする目 的で, 基礎 的 実 験^を行^い検 討^{し た.} さ らに, そ れ ら^の結 果に基 づく 薬剤 投 与 法^{によ り}臨 床 応用 を試み た^.

材 料および 方 法 l ^. 基 礎 的 検 討

1 . 実 験 動 物

6適 齢 雌 性^の B A L B/^{c マウス}, C 3 H/^{He マ}ウスお よ び ヌ ^ー

ド^マ ウス [^{B A L B}/^c(^{n u}/^{n u})】を 用いた. これら^のマ ウ^スは 日本

チ_ャ ^ー ルズ リ^{バ ー}社 ( 厚 木) よ り購入 し た^{. マ}ウスは無 病 原 体 飼 育条 件 下(spe cific p^athoge nfr e e, S P F) ^で滅 菌 飼 料^{お よ び}滅 菌 水 道 水^が自 由^に摂 取できる ように L て飼 育^し実 験^に用^いた^.

2 ^. 腫 瘍 細 胞

1) ^{M eth}‑^{A 線 維 肉腫 (M eth}‑^A)

B A L B/^{c マ ウス に}対し て同系 腫 瘍^である^{メ チ} ル コ ラ ン ト レ ン誘 発 線 維 肉魔^{の M eth}‑^A 細 胞を用^いて抗 腫 瘍 性 試 験を行 っ

た^. M^eth^‑A 細 胞ほ B A L B/^{c マウス の}腹 腔 内で継 代 維 持し た.

実験^に際し て ほ,

マ ウス 腹 腔 内^{よ り}腫 瘍 細 胞を無 菌 的^に採 取 後, 細 胞 浮遊 液を作 製し て用いた^.

2) Y A C‑^{1 リソ パ腫 (Y A C}‑¹⁾

A/^{Sn ▼マ ウス にM olo n e}y 白血病^ウィ ルス で誘 発し たリン パ腫

Y A C^‑1 細胞をナ チ ュ ラ ルキラ ^ー (n atu r al k ille r, N K) 細 胞 活 性

の標 的細 胞^{と して}用^{いた. Y A C}‑^{1 細 胞は1 0% 非 働 化ウシ}胎 児 血清 (^fetal c alf s e ru m , F C S) (G I B C O , G la nd Isla nd,

U^.S^.A) と ダル ク ミ ソ (^日水, 束 京) ^を含^{ん だ Ro s w ell Pa rk} Me m o rial In stitute‑^{1 6 4 0 (R P M I‑1 6 4 0}) 培 地 (^{ニ プロ} , 大 阪) 中

で_, 3 7 ℃よ 5% C O2 で培 養 継 代した.

3 . 使 用薬 剤

B L M (日本 化 薬, 東 京), O K^‑4 3 2( 中外 製 薬▲ 東 京) ^は蒸 廃 水

に て種^々の濃度^にて溶解^{ま た は}懸濁^し, マウス ^一 匹 あた り 0^.1

r山 投 与^{し た.}

4 . 培 養細 胞^{に よ る}効 果 判 定

Meth‑^{A 細 胞を 1 8 0}F^Llの1 0% F C S 加R P M IT^{1 6 4 0 中に1 04 個}

と な る よう^に調 整 し, 9 6 ウ^{ニ ル マ} イ ク^ロ ウ^ェ ル プ レ ^ー ト (^{Nu n c}, Ro skilde, De n m a rk) ^の各ウ^エ ル に 1 8 0F^Ll ず^つ 分 注 し た ^. 最 終 濃 度が 0 ^.1 K E/ ^{mト1 K E}/^{r nl に な る よ}う 調 整^{し た} O K‑^{4 3 2} お よ び B L M を各^{々 1 0}F^Ll 分 注し た^. な お, B L M の濃 度ほ M eth^‑A 細 胞^に対し て 4 0 ^‑ 6 0% ^の増 殖 抑 制 率を 示す 3 0 0/^Jg/ ^{血 と し た. 3 7 ℃}, 5 % ^{C O}2 で 7 2時 間培 養 後, 各^{ウニ ル}

に 0^.1 5 M リ^ン酸緩 衝 生理食 塩 水 (pho sphate‑^{buffe r ed s alin e,}

P B S) で溶解した 2 m g/^mlの濃 度^{の 3}‑(⁴,5^‑ジメチル チ ア ゾ ^ー ル^ー2 イ ル)^‑2 ふ ジフ ェ ニ ルテ トラゾ リ ウ^ム ブ ^ロ ミ ド [3^‑(4 ふ dim ethylthia z ol‑^{2‑yl)‑2,5‑di}phe nyltet_{r a z o}liu m br omi de] (^{M T T}) (^Sigm a, St･Lo uis, U. S. A). を 25F^Ll 分 注し, 4 時 間 培養^し

た^. 各ウ^ェ ル の M T T ホ ル ^マザ ソ結 晶 懸 濁 液を 1 .5ml 遠 心

チ ュ

ー ブ(^Ep pe ndo rf, Ha mbr ug, Ge r m a ny) ^に移 ^し換え ,

1 5,0 0 0r叩^l に て1 0分 遠 心 後, 上浦^を静か に吸 引し, ジメチル ス ル フ _ォ キシ ド(d im ethyls ulfo xide, D M S O) (和 光 純 薬, 大 阪) 2 0恥1 を加 え, M T T ホ^{ル マ}ザソ結晶を溶 解し た^, 十 分に溶 解し た後, 再び元^のウ^ェ ルに移し換 え, 各^{ウェル の 5 4 0n m にお}け る吸 光 度を I^{m m} u n o r e ade r NJ^{‑2 0 0 0}(日本イ^ン タ ^ー メ ッ ド, 束

京) ^を用いて測 定^した.

効 果 判 定は , 測 定し た吸 光 度よ り次 式^に て増 殖 抑 制 率 (inh ibitio n r atio_,Ⅰ^･R^･) を算 出^し評価^{し た.} 相 乗 効 果お よ び相 加

効 果^の判 定^ほ, Vale riote ら^{1 2 )の}方 法^に準じ た^.

Ⅰ^. R^.(%) ⁼(¹‑ ^T/^C) ^{×1 0 0} T ^:薬 剤 投 与 群の吸 光 度^の平 均 C : 対照 群^の吸光 度^の平 均 5 ^{. マ} ウ^ス固 形 腫 瘍碇 よ る効 果 判 定

生理食塩水で2 ^×1 0⁷ 個/^{ml に}調 製^{し た M eth‑A} 細 胞 浮 遊 液 0.0 5ml を B A L B/^{c マウス の}右 鼠 径 部皮 下^に移 植し, 担 癌^マ ウ

スと し た^. 単 独 投 与 実 験で は, 移 植6 日後 も^しくは 8 日後^に,

O K^‑4 3 2 は 5 0 K E/^kg の投 与 量で腹 腔 内投 与^{ま た ほ}腫 瘍 内投 与 を, B L M は 3 0m g/^kg ま た ほ 1 0 0m g/^kg の投 与 量^で静 脈 内 投 与を行^{っ た.} 単 独 投 与^にて ∴至 適 投 与^{ル ー} ト お よ び至 適 投 与^量 を判 定 後, その投 与 法^での併 用 効 果を判定し た.

一 群⁶ 匹を使

用 し, 効果 判 定ほ ‥ 睦瘍 移 植^{3 5 日}後, 移植 部^に形 成^した固形 腫 瘍^を摘 出^し, 対 照 群と薬 剤 投 与 群^の平 均腫 瘍重 量よ り次 式^にて 腫 瘍 増 殖抑 制 率を算 出した. さ らに, 体 重^を測 定 す^{ることによ} り毒 性^の検 討 も 行った.

Ⅰ^. R^.(%) ⁼(1 ^‑ T/^{C)×1 0 0}

T : 薬剤 投 与 群^の腫 瘍 重 量^の平 均 C ^: 対照 群^の腫 瘍 重 量^の平 均

6 . O K^‑4 3 2 と B L M 併 用に よ る免 疫 能^に与え る影 響 1) 免疫 能 欠 如^マ ウス における効 果 判定

O K^‑4 3 2 と B L M の併用効果^の及 ぼす 宿主^の免 疫 能^の影響を 検 討 する た めに_, 以 下^の実 験を行った^. ヌ^ー ド^マウス お よ び抗

アシ アロ G M l( 和 光 純 薬) ^{ま た はシリカ}(^{L i C hr o s o rb⑧} si 6 0) (^{M e r ck} , Da r m stadt_, Ge r m a ny) を投 与し た B A L B/^{c マウス}を 用^いて それ ぞれ^の併用効 果における T 細胞, N K 細 胞, マ ク^ロ

フ ァ ^ー ジの影 響を検 討した^. 抗ア シ ア^ロ G M l は P B S にて 2

mg/^{ml に}溶 解し,

一匹 あた り 0^.1ml を腫 瘍移 植⁵ , 8 , 1 1,

1 4 日後^に尾 静 脈よ り静 脈 内投 与し た^. シ リ^カは蒸 留 水^{に て} 2 5mg/^{ml に}懸濁し,

一匹 あた り 0^.1ml を腫瘍 移 植5 日後^に静 脈 内 投 与し た. 効 果 判 定^{はヌ ー ドマ ウス}を用^いた実 験で ほ腫 瘍 移 植21 日後と し, B A L B/^{c マ ウスを 用いた}実験^では3 5 日後と し た^.

2) 脾 細 胞^の分 離

マ ウ^ス よ り無 菌 的^に脾 臓を摘 出し_, ピン セ ッ トに て機 械 的^に 細 切し, ス テン レス メッ シ ュを通 過さ せ単細 胞 化^{し た.} 赤血球 除 去 用ト リ^ス緩 衝 液 (0^.83% 塩 化^{ア ンモ ニ}ウム :0^.1 5 M ト リス

ヒドロ キ^シメ チ ル ア ミ ノ メ タン pH 7.6 5 ⁼ 9 : 1) ^にて 37 ℃,

5 分 間処理 し^て赤血球を除 き, 脾リ^{ン パ}球 浮遊 液を得た^.

3) ^カニ ンガム法^{1 3 )}を用^いた脾 細 胞^の抗 体産 生能^の測 定

補 体^{の モ ル モ} ッ ト 血清 (^Ceda rla n e Lab^., Onta rio, C an ada) は, あらか じめ水 冷 下で等 量^の羊 赤血球 (^デソカ生 研, 東 京) ^と 3 0分 間混 和^し, モ ル モッ ト 血清 中^の正常抗 羊赤血球 溶血素を吸

収し て おき, 遠心分 離して 上清を補 体と し て用^いた.

A Is e rv e r 溶 液 中^に保 存^{さ れ ている}羊赤血球を P B S に て洗 浄

後, 1 0% に調 整し た羊 赤血球を B A L B/^{c マ ウス の}腹 腔 内に 0.1ml 投 与し, 感 作を行っ た. 感 作⁴ 日後^{にマウス の}脾 臓を摘 出 ∴ 膵臓1 ^つに^つき2 ml の^ハ ン クス 液 (Ha nks bala n c ed s alt Sdlutio n) に脾リンパ球を浮 遊さ せ, 氷 水 中^に保 存^{し た. こ の}脾