肉月重細胞 対 す 温熱 化学 療 法 併 用効果 基礎的研究

9 74 金沢大 学十全医学 会雑 誌 第9 7巻 第5 号 974−^{9 8 8}く1 9 紬コ

肉月重細 胞^に対す^{る温熱 ． 化 学}療法併^{用 効 果 の基 礎 的研 究}

金沢大学 医学 部整 形外科 学講 座 く主任^二野村 進 数 粉

骨 竹 康 雄

く昭和^{6 3}年^{1 0}月1 7 日受 付う

温 熱 療 法^は， 単 独^にある^い は他^の治療 法と併用 し て癌の治療^に応用 さ れ^{つ つ}あ る^． しかし， 四 肢 の骨 軟 部 肉腰^に対し て は実 験 的^にも臨 床 的^にも報 告が少な く， 未だに ^一 般 的な治 療 法と な ^って いな^{い ．} 本 研 究で は， 肉 腫細 胞の温 熱 感 受 性な ら び^に温 熱と制癌 剤と の併用に対す る感 受 性を調^べ − 四肢の骨 軟 部 肉腫^への温熱 療 法^およ び温 熱 化 学 療 法^の導入^の可 能性を検 討す る^こと を目 的と し た^■ 材 料と し^ては肉 腫株 細 胞3株 くO S T株， H T ^．1 0 8 0軌 S^L1 8 0掛 と臨 床 新 鮮 材 料3 臓 体を 用^いた■ 効 果 判定には臨床 効 果 との相 関 性が高^い制 癌 剤 感受 性 試 験と し て注目さ れ て^いる h^{u m a n tu m o r c}lo n oge nic a s s ay くH T C Al を更に当教 室で改 良し た C ultiv ated H T C A を 用^いた^． 細 胞 浮 遊 液を恒 温 槽^にて加 温し同 時^に制 癌斉陀 接 触さ せ る と， 株 細 胞で は温 度 く3 7⁰C ^へ4 5⁰Cうの 上昇， 加温時 間 く3 0分^へ2 4 0 別 ^の延 長と と もに細 胞生 存 率は低 下し た． 3 株の A^{r r}he niu s プ^ロ ッ ト を比 較す る と O S T 株リ H T⁻1 0 8 0株^に比^べ S⁻1 8 0株の温 熱 感 受 性は低値を 示 し た^． 制 癌 剤と温 熱と を併用 し た場 合， ア ド リ ア^マイ^{シ ン} くad^ria m y^cin， A D Ml 一 シ スプ ラ チン く^cis⁻platin u m ，C D D Pl， サ イ ク^{ロ フ ォ ス フ ァマ}イ ドく^cyclopho spha mide，C P Al で は相 乗

効果を認め， ビンク リ^スチン くvin c ristin e，V C R，^では相 加 効 果を認め た． ま た その効 果 発 現^の温 度は株

細胞お よ び制 癌剤^によ り多 少 異な^った． 臨 床 新 鮮 材料^で感 受 性 判 定 可 能で あっ た 2 7検 体^{に お い}て ^{コ ロ}

ニ ^ー 形成 抑 制 率を み る と， 4 2⁰C加 温と制 癌 剤と を併 用し た場 合， 各制 癌 剤と も制 癌 剤 単 独の場 合と比べ

有 意に^{コ ロ ニ ー} 形成 抑 制 率が高まっ た くp く0^．0 5う^{ー 4}3^DC加 温と制 癌 剤との併用 の場合で は併用効 果は4 2

8C加 温の場合と比^べ更^{にコ ロ ニ ー}形 成 抑 制 率^が高まった くp く0^．0 5ト 以上 よ り， 温 熱 療 法， 特^に制 癌 剤 と併用し た温熱 化 学 療 法は肉 腫細 胞^{に おいて も}有 意な殺 細 胞 効 果が認め ら れ 了加温方 法^の問題が解 決さ れ れば臨 床 応用^にも充 分な期 待が も^てる ものと考え ら れ た^．

K ey ^{w o r}ds bo n e a nd s oft tis s u e s a r c o m a_， hu m a n tu m o r clo n og^{e n}ic a s s ay，h_{y p}e rthe r mia，the r m o s e n sitivi_{t y}，the r m o che m o s e n sitiv⁻

i_{t y}

近 年， 温 熱 療 法^を単 独^にあ る^いは他^の治 療 法と併用 し て悪性 腫 瘍の治療^に用^いること が注目さ れ， 実 験 的

．臨 床 的^に多く の報告が な さ れ^{つ つ}あ る^． し か し 四肢 の骨 軟 部悪性 腫 瘍 く肉 掛 ^に対し て は，

一 見， 温 熱療

法が行^い易^いと 思 わ れ るにも^かか わ らずほ と ん ど 用^い ら れ て^いな^い ． その大き な 理由は特^に四肢の長 管 骨で は， 骨 皮 質の電 気抵 抗が高^いた めに深 部^にま で有 効な 加 温が得ら れ な^{い こ}と や， 骨 髄 腫 内は血 液 環 流が豊 富 で熱が奪わ れ有 効な温 度を維 持^でき な^{い こ}と， ま た 四

肢^の骨 軟 部 肉 腫は 症例 数が少な^いた め 温熱療 法そのも のの有 効 性を 示 す ま と ま^った 基礎デ^ー タ ^ー が ない こ と な ど^によ る と思わ れ る^{． 一}方， 骨 軟 部 肉 腫^の 予後は最 近^の強 力な化 学 療 法^の導入^によ り し だ^{い に}改善さ れ^つ

っあ る が， 制 癌 効果を期 待す る あ ま り薬 剤^の投 与息 投 与 期 間を増す^こと^にな り， その副 作用のた^め投 与中 止 を余 儀な く さ れ る^こと も多^{い ．} し た が^{っ て}， 制 癌剤 の抗 腫 瘍 効 果を減 弱させること な く その投 与崖 を肖順 す る^こと^の可 能な他^の治 療 法と^の併用療 法^の研 究が 望

A b br e viatio n s こ A D M _， adria m y^ciⁿ_ニ C ^{D D P} ， Cis⁻plati_{n u 町} C ^x T ， c o n c e ntr atio n⁻tim e p^{r o}du ct i C P A ， Cy^Cloph o sph a mideニ E D T A ， eth_yle n edia min etet^{r a a c e}tic a cid _i F C S， f^etal

c alf s e r u 町 H I， he at⁻in a ctiv at^ed_ニ H T C A ， hu m a n tu m o r clo n og^{e n}ic a s s ay 三 M F H ，

肉腫細 胞^に対す る温 熱^一 化 学 療 法併用効 果

ま れ て^いる^．

当 教室^の T omi ta ら^{l ，}は． 骨 軟 部 肉腫^に対す る制癌 剤感受性 試験と し て， H a mbu rge r ら^{2 I}によ る Hu m a n

Tu m o r C lo n oge nic As s ay くH T C AJ を改 良し た

c ultiv at_ed H T C A を開発 し， これ が臨 床との相 関 性 の高^い方 法で あ る^こと を実証 し た．

そ^こで著 者は， こ の C ultiv ated H T C A を 用^い， 肉 腫培 義株 細 胞お よ び肉腫臨床 材 料に対す る温 熱 感受性 を温 熱と制 癌 剤と を併用 し た場 合^の感受性と 比^べ， 温 熱化 学療 法が骨 軟部 肉腫に対す る新し^い治 療 手段^{の 一}

つと な り う る^か ど うか に^つ いて検 討し た^． 材 料^およ び 方 法 王． 材 料

実験^に使用 し た材 料は， 株 細 胞と して 当 教 室で樹 立， 継 代培 養さ れ ている^と 卜骨 肉腫 由 来の培 養 細 胞 くO S T 株³り と，

ヒト線 維 肉 腫 由 来の培 養 細 胞 田T ⁻ 10 8 0 株ヤ1 くFlo w Labo r at_{o r}ie s， N o rth R_yde，

Au str aliaJ な ら びに ，

マ ウス肉腫由 来の培 養細 胞 くS⁻ 1 8 0 株⁵り げlo w Labr ato rie sl であ る^． ま た臨 床 新 鮮 材料と し て は 過去2 年間に当 教 室^にて 生検な ら びに手 術^にて得ら れ た骨 軟 部 肉腫 3 8検 体を 用し¹た^． そ^の内訳 は^， 骨 肉腰1 1例， 軟 骨 肉腰 6 例， 悪性 線 推 性 組 織 球 腫 5例， 脂 肪 肉腫 5 例，

ユ ー イング肉腫3 例， 平 滑 筋 肉 腫 2 例， 悪性 神 経 鞠脛 2 例， 悪性 骨 巨細 胞腫， 横 紋 筋 肉腫， 類上皮 肉 腫， 滑 膜 肉腫各1 例^であ る^．

H ． 株 細 胞の培養 条 件及 び単 離 細 胞 浮 遊 液^の調 製法 株細 胞は^， プラ スチック製^フラ^{ス コ} くC o ming， 東 京，

辞2 5，10 0 ま た は群25，1101 内で1 5％he at⁻in a cti．

V ated くH Il fetalc alf s e r u m CF C Sl ^およ び1 ％^ペニ

シリ^ン． スト^レプトマイ^{シ ン} くpe nicillinl^{str e}p to my⁻ Cin s olutio n，P S 1 ¹0，0 00 ^{u n}its くG i bc o， Ne w Y o rk，

U S A l を含む Ro s w ell Pa rk M e mo rial In stitute

Med ia⁻1640 くR P M r⁻ユ64 0j 培 養 液を 伺^いて 単層 培 養 維 持を続け た^． これ を温 熱処 理 ならびに制 癌 剤と接触さ せる際^には， 0．025％ ト リ プシ ンと O ^．0 2％^eth_yle n e⁻

diami n etet_{r a a c e}tic a cid ほ D T Al によ り単離 細 胞 浮遊液の状 態^にして用^いたく図¹ ト

m ． 臨 床新 鮮 材 料からの単 離細 胞 浮 遊 液^の調 製法 腫瘍 材 料を P S を含む培 養 液 仁M cCoy^，s 5A くG ib⁻

C OI w a shj 内^で ， でき る だ け速やか に無 菌 的^にハ サミ で細_{切 し た}． その後， 酵 素^{カ ク}テ^ル しHa nk^，s bala n−

9 75

C ed s alt s olut io n くG ibc oj ＋ コ ラゲ ナ ^ー ゼ _{t y p}e I くS igm a， St． Lo uis， U S A l O ．2 m gノ^ml， D N ^{a s e} くS igm al O ^．2m gJ

lml， プロナ ^ー ゼ く科研 製 薬， 東 京1 0^．5m gノ^mlj ^にて 3 7⁰C ， 3 0分 間処理 し た後， ステ^{ン レ} ス製^メッシュ く鮒 メッシ ^ュI ^にて材 料を ろ過し て単 離 細 胞 浮 遊 液を作 成し た^．

肉腫 細 胞は H T C A において^{コ ロ ニ ー} 形 成 率が低^い と^いう欠点を補う た めに_， 肉腫細 胞を ^一 旦単 層 培 養 系

に 移 行^{して c ell} p^op^ulatio n を増 加さ せ た う え で H T C A を行った く^{c u}ltiv ated H T C Al ^． ま ず単 離腫 瘍 細 胞を ^一 旦 プラ スチック製^フラスコ 内に5 Xl O^3旬 5

Xl O⁴個 播 種し^， R P M I^．16 4 0 培 養 液 く1 5％ H I⁻F C S ＋ 1 ％P Sl を 用^{い て}，3 7⁰Cで単 層 培 養し た^． 1 ^へ 2 回 の 継 代 培 養^によ り腫 瘍 細 胞が^シー ト状^になった時 点で_， 0，0 2 5％ト リ プシ ンと 0^．0 2％E D T A によ り再び単 離 細 胞 浮遊 液を作 成し た く図¹J ^．

1 V． 腫瘍 細 胞^に対する温熱 処理 法

Il ． 工I工に て得ら れ た浮遊 細 胞^{を 3 X lO6} 個ノml の細 胞 浮 遊 液と し， これの0．5ml に0^．15ml の制 癌 剤ま た

は対照液と して の生 理的 食 塩 水と McCoy

，

s 5 A

W a Sh O^．8 5 ml を加え キャ ッ プ付 試 験 管 くCo r ning，

せ2 5 3川 中で恒温槽 B T⁻2 3 型 くヤ^マ ト科 乳 東 京， 温 度 調 節 精 度^士0^．02 ^へ0^．0 8⁰CJ 浸浴に て加温^を行^っ た．

加 温の温 度 範 囲^は， 株 細 胞で は3 7 ^ん43⁰C のl ^OC毎^に く温 熱 単独で は3 7^へ45⁰Cン， 臨 床材 料では 4 2⁰Cおよ び 43⁰C^の2 点と し た ． ま た加 温^の時 間は． 株 細 胞で は 3 0，6 0， 12 0 ，1 8 0，240 分間と し， 臨 床 材料で は6 0分 間 と し た^■ なお恒 温 槽^に入 れ た後 試 験 管 内^の浮 遊 液が 4 3

0Cに達す るには約5 分間を要し た^．

V ト腫瘍 細胞 と制 癌 剤と^の接触 及 び 温熱と^の併用方 法

使用 し た制 癌 剤は， 骨 軟部 肉腫^の化 学療 法^に頻用 さ れてい るアド リアマイ ^{シ ン} くad^ria mycin，A D M J ． シ ス プ ラ チ ン くci_s⁻platin u m ，C D D P l， サ イク ロ フ_ォ ス フ ァ マイ ドくcyclopho spha mide，C P Al ， ビ ン クリス チ^ン くvin c ristin e， V C R l であ る^． Ma sked c o m ^．

po u nd で あ る C P A は 活 性 型 4^．hydr ope r o xy

CyClopho spha mide く40 H⁻C P Al を 用^いた^． 制癌 剤 濃 度は， 通 常 臨 床 的に投 与^{さ れ た}時^の最 高血 中 濃度およ び C ^x T くc o n c e ntr atio n⁻tim e pr odu ct， 血 中 濃 度と時 間の横1 の約1 0％と し た． す な わ ち A D M O^．0_{4 J}^L_gノ^ml_， C D D P O．2 0_JL glml， C P A 3 ^．0 0 m ali_{gn a nt}fibrous histio cy t^{o m a}三 40 H ⁻C P A ，4⁻h_ydr op^{e r ox}y ^cy^clopho spha midei P E， plating efficie n cy 三 P S， p^{e n}icillin⁻Strep t^{O m} y^Cin s olutio nニ R P M I^N1 640

， R o s w ell Pa rk M e m o rial I_{n st}itute M edia⁻1 64 0 _三V C R

， Vin c ristin e．

97 6

E stab Iished C ^eII Lin e s O S T

く1 つ H T ⁻1 0 80 S ⁻1 80

嘩 妄 ヨ

く5つ

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Clinic al M ate rials

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く2 つ

く3つ

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F 卜e Sh tu r11 0 r

CモI I pr epa r at io n

N bcha nic al E n zym at ie

l

C ul t iv ate tu m o r c el ls in R P M 1 1 6 40 ^{m ed ia}

wi t h 1 5 ％ F C S

一 ^項

忘ヨ

Ha r v e st a s sing le C el l s u spe n si_{o n}

くTry psin＋E D T Aつ

T

l

Dr ug in c ubat 良 he at ing

C 10 n Og^{e n}ic A s s ay

F ig^．1^． Methods of the r m o che m o s e n sitivit y te st fo r bo n e a nd s oft tis s u e

1^． Established c ell lin e s w e r e kep tin R P M I⁻16 4 0 m ediu m with 1 5％fetal

C alf s e ru m くF C Sl^．

2^． Fr e sh tu m o r sp^{e c}im e n s w e r e obtain ed fr o m b iop^sy ^{o r s u r}ge ry^．

3^． A singl^{e c ell s u s}p^{e n s}io n w a s pr epa r ed b_y m e cha nic al a nd e n zym atic

d is r up tio n ofthe tu mo r．

4． T he tu m o r c ells w e r e c ultu r ed iⁿ R P M I⁻1 6 4 0 m ed iu m with 1 5％fetalc alf

s e r um くF C Sl u ntil a c e11 she etfo r m ed in the bot tle．

5． T he c ells w e r e ha r v e sted a s a r efin ed single c ell s u spe n sio n b_y try p^sin

6． T he tu mo r c ells w er^{ein c ubated in te st tube s with o r witho ut dr ugs a nd} he ated byim m e r sio n l n p^{r e C}isio n the r m o static ally c o ntr olled w ate rbath．

7^． T he the r m o che mo s e n sitivit y ^of the tu m o r c ells w a s e v alu ated by hu m a n tu mo r clo n og^{e n}ic a s s ay^．