原 著
倭蠣蔑、内冠、劉言〕
Bispeci負。抗体と：LAK（lymphokine−acitivated killer）
細胞により誘導されるCD13陽性急性非リソバ性
白血病細胞に対する細胞障害活性
東京女子医科大学 血液内科学教室（主任 カネ コ タ カ コ 金 子 多 香 子 溝口秀昭教授） （受付平成3年9月19日） Cytotoxic Activity for CD 13・posit量ve Acute Nonlymphocytic Leukemia Cells』Induced by Bispecific Antibody and Lymphokine・actiVated Killer（LAK）Cells Takako KANEKO Department of Hematology（Director：Prof． Hideaki MIZOGUCHI） Tokyo Womens’s Medical College The activity of a bispecif童。 antibody（BsAb）to enhance cytotoxic圭ty of lymphok三ne・activated killer （LAK）against patient acute nonlymphocytic leukemia（ANLL）cells was studied． Peripheral blood mononuclear cells were obtained from normal donors and leukemic patients， stimulated with interleukin 2 for 3 to 28 days， and used as LAK effector cells． LAK act呈vity was assayed by a 4・hour 51Cr−release test． Anti−CD13 Fab’×anti−CD3 Fab’BsAb added during the cytotoxicity assay was generated by a chemical binding method． The results are as folloWs． When LAK cells were derived from two normal donors， and assayed for their cytotoxicity agaist patient CD13−positive and CD13− negative leukemic cells， the BsAb was found to significantly enhance LAK activity against CD13− positive， but not CD13・negative， leukemic cells． When various concentratlons of the BsAb were added． during the cytotoxicity assay， higher concentrations of the BsAb induced higher藍evels of cytotox圭city． The optimal effector−to−target cell ratios to induce maximum level of cytotoxicity were 40：1 to 160：1． Stored leukemic ceHs were also found to be susceptible to lysis to LAK cells。 Even when a 100・fold excess of CD13−negative cells was added， CD13−positive cells were eff圭ciently lysed by LAK cells w童th addition of the BsAb． The BsAb was also found to enhance LAK activity against autologous leukemic cells． Taken together， these results suggest that the BsAb can be used for immunotherapy in patients with CD13−positive ANLL． 緒 言 インターロイキン2（IL2）はT細胞が産生す るサイトカインで，T細胞の増殖を促進するなど の多彩な作用を有する1）．リン．パ球をin vitroで IL・2を含んだ培養液で活性化すると，リンパ球が， 種々の標的細胞を主要組織適合抗原（malor his− tocompatibility complex：MHC）非拘束性に， 非特異的に障害する性質を得る2＞．このような細 胞を，lymphokine・activated killer（LAK）細胞 と呼ぶ．LAK細胞は，継代培養した細胞ぽかりで なく，新鮮な腫瘍細胞に対しても，キラー活性を 持っている．この性質を利用すると，悪性腫瘍の 養子免疫療法での効果が期待されることから，多 くの臨床試験が行われた．しかし，IL−2大量療法や，LAK／IL2療法は，いずれも重篤な副作用がみ られ，しかも期待した程の効果は得られなかっ た3）4）．このため，エフェクター細胞を，より腫瘍 特異的な細胞にするための試みが行われている． Rosenbergらは， tumor・infiltrating lymphocyte （TIL）を用いると，LAKより強力かつ選択的な抗 腫瘍効果が得られると報告している5＞．また腫瘍 細胞をリンパ球と混合培養して，より腫瘍抗原特 異的な細胞障害性Tリンパ球（CTL）を誘導し， これを養子免疫に用いるCTL療法も行われてい る．しかし，抗原性が比較的強いとされる悪性黒 色腫や腎細胞癌のような腫瘍以外でば腫瘍特異性 の強いCTLは誘導しにくい．さらに，この方法で は充分な量の細胞を手に入れるのは困難である． このような理由で，これらの方法は，まだ確立し たものではない6）． 造血器悪性腫瘍に対するLAK細胞の効果につ いて，Oshimiらは，急性白血病やリンパ腫の患者 の末梢血からIL−2でLAK細胞を誘導し，これが 自己の腫瘍細胞を障害するかどうかを51Cr放出 試験で調べた．その結果20例中18例の白血病また はリンパ腫の細胞が，自己のLAK細胞に感受性 があった．しかし，正常な細胞も自己のLAK細胞 によって，その程度は低いが，障害されたと報告 している7）． bisped丘。抗体（BsAb）は，2つの異なった抗 原決定基を認識する合成抗体で，化学的にあるい は細胞融合法によって作製される．キラーT細胞 においては，T細胞受容体での特異的抗原の認識 と同様に，CD3抗原への刺激が，細胞障害活性の引 金になる8）．さらにBsAbは，エフェクター細胞と 標的細胞を架橋する役割を持つ．このことから， 抗CD3モノクロナール抗体（mAb）と腫瘍抗原特
異的mAbを結合させたBsAbをT細胞に添加
すると，腫瘍細胞に対する特異的細胞障害活性が 誘導されると言われている9）即11）， Nittaらは，5，5ノ・dithiobis−2−nitro・benzoic acid （DTNB）化学結合法によって作製した抗glioma Fabノ×抗CD3 Fab〆BsAbを神経膠腫の患者10人 に局所的に投与した．その結果，8例で有効であ り，副作用は若干の発熱以外には見られなかった と報告している12》． Oshimiらは，抗CD3 Fab’×抗CD10 Fab〆BsAbを用いると， LAK細胞やCTLクローンに
よるCD10陽性の急性リンパ性白血病（ALL）細胞 に対するキラー活性を著しく増強できることを示 した13）．そして，この方法が臨床的には，自家骨髄 移植の際に，体外で腫瘍細胞を除去（パージング） するのに有効であろうと述べている． 成入では，ALLよりも，急性非リンパ白血病 （ANLL）の症例が多い．現在化学療法によって， 完全寛解への導入率は向上しているが，再発例も 多い．このため，寛解期での骨髄移植が長期生存 のための手段として，広く行われるようになった． 現在最も多く行われているのは，HLAの一致し た同胞からの同種骨髄移植である．HLAの一致 した同胞がいない症例では，一部縁者からの移植 が行われている．しかし，いずれの場合にも，移 植片対宿主病（GVHD）が問題になり，長期生存 率が改善されない原因となっている．このために， 白血病細胞を体外で，自分の骨髄から完全に取り 除くことができれぽ，GVHDの起こらない自家骨 髄移植がより有効にできると考えられる． ANLLの腫瘍細胞を， BALB／cマウスに免疫して得られた抗体であるMY7はCD13抗原と反
応するmAbである．CD13抗原は， FAB分類に関係なく全ANLLの79％，未分化なANLLの82％
に発現している14）．白血病細胞以外では，穎粒球， 単球にも発現しているが，正常骨髄細胞での陽性 率は，5％以下である．このように，CD13は，畑 鼠球系細胞の分化の途上で表現される表面マー カーで，mixed−1ineage progenitor cell（CFU・ GEMM）では発現していないことから15），体外 パージソグに用いる抗体として，適切であると考 えられる．また，白血病の予後と表面マーカーと の関係を調べると，CD13はCD14と同様に，陽性 の症例の方が，完全寛解に入りにくく予後不良と 言われている16）．このような理由から，著者は効率 的な自家骨髄移植を行うための第一歩として，DTNB化学結合法でMY7 Fabノ×OKT3（抗
CD3）Fab／BsAbを作製し， LAK細胞にBsAbを添加した場合の，CD13陽性ANLL細胞に対する
表 急性白血病患者のFAB分類，白血球数，白血病細 胞比率とCD13陽性率 FAB分類 i×109／L）白血球数 末梢血 P核球中の 柱剣a細胞 @（％） 末梢血 P核球中の
@CD13
z性細胞 @（％） pt．1 M1 141．2 98 80．0 pt．2 M4E 79．7 67 86．2 pt．3 M2 43．7 95 70．2 pt．4 M1 110．0 96 91．0 pt．5 L2 15．0 89 0．9 細胞障害活性増強の効果について検討した． 対象および方法 1．対象CD13陽性ANLLの患者とCD13陰性のALL
の患者を対象とした（表）．患者白血病細胞は，末 梢1血に占める白血病細胞の割合が高い症例から得 た．白血病細胞を含む患者の末梢血を治療前にヘ パリン採」閉し，フィコールコンレイ比重遠心法に て分離し，これを凍結保存しておき，融解して実 験に用いた，凍結は，白血病細胞を10％dimethyl− sulfoxideを加えた90％ウシ胎児血清（FCS）に浮 遊させ，プログラムフリーザーで凍結し，液体窒 素の中で保存した．2．BsAbの作製
BsAbは化学結合法によって以下のように作製 した13）17）．OKT3（Ortho Pharmaceutical Corpo− ration）とMY7（Coulter Immunology）を，37℃の0．1M CH3COONa緩衝液中で，ペプシンでF
（abノ）2に分解した．この反応は0．02M NaH2PO4 を加えて停止させ，液体クロマトグラフィーで純 化した．OKT3のF（abノ）2部分は0，5mM dithioth− reitolで還：元し， F（ab’）・SHにした後， Sephadex G−25カラムで分離した．MY7も同様にF（ab’）2に 分解した後，DTNBで還元し， Fab−S−NBにし， Sephadex G−25カラムで分離した． OKT3 Fabノー SHとMY7 Fab〆一S−NBを1対1の比で混ぜて， 一晩反応させるとBsAbができた．これを，さらにTSKgel G3000SWXLで純化した．
3．LAK細胞の作製
正常人ドナーと，完全寛解中の患者の末梢血を ヘパリン採血し，フィコールコソレイ比重遠心法 で単核細胞に分離し，2回洗浄し，IL−21，000U／ m1，ペニシリン100U／ml，ストレプトマイシン10 μg／mlと，不活化したヒトAB血清を10％加えた RPMI 1640（Flow Laboratories）に浮遊させた． 2×106の単核球を2mlずつ24穴のtissue culture plate（Linbro Division， Flow Laboratories）に 入れ，37℃で5％CO2の培養器で培養した．3日か ら4週間の培養の後，細胞を1回洗浄してその細 胞障害活性を調べた． 4．51Cr放出試験による細胞障害活性の測定10％FCSを加えたRPMI．1640に浮遊させた
LAK細胞を，．エフェクター細胞とした．実験に用 いるエフェクター細胞対標的細胞比（E／T比）に応じて，必要な数のエフェクター細胞を96穴
round−bottom microculture plate（Linbro Divi− sion， Flow Laboratories）にtriplicateで入れた． 次にBsAbを0．1μg／ml加えた．細胞障害活性の 測定に用いる，標的白血病細胞は，融解した後300 から400μCiのNa251CrO4（日本アイソトープ協 会）で標識した．2時間の標識後，3回洗浄し， 10％FCS加RPMI 1640に浮遊させ，用意しておいたエフェクター細胞の入ったmicroculture
plateの各ウェルに5×103コ口入れた．4時間後 に上清中に放出された51Crを収穫し，その放射能 活性をガンマカウンターで測定した．％特異的 51br放出値は以下の計算式で求めた． 〔（experimenta151Cr release−spontaneous 51Cr release）／（maximum 51Cr release−spontaneous 51br release）〕×100． experimenta151Cr release は，エフェクター細胞に51Cr標識標的細胞を加え 4時間培養の後放出される51Crカウントである． maximum 51Cr releaseは，51Cr標識標的細胞か ら最大限放出される51Crカウントであり，蒸留水 にdetergent 7Xを5％加えた液をウェルに入れ， これに51Cr標識標的細胞を加え4時間培養の後 放出される51Crカウントである． spontaneous 51 Cr releaseはエフェクター細胞を加えないで51Cr 標識標的細胞を4時間培養の後自然に放出され る5・Crカウントである． BsAb単独では51Cr標識 標的細胞のspontaneous 51Cr releaseセこは影響を 与えなかった．結果は，％特異的51Cr放出値の平均値で表した．ほとんどの実験で標準偏差値は 5％を超えなかった． 結 果 1．CI）13＋AN正し細胞に対するLAK活性に及
ぼす各種mAbの影響
51Cr放出細胞障害試験時に各種の抗体を加え， 細胞障害活性の増強効果の有無を調べた，1週間 培養の正常ドナーのLAK細胞をエフェクター細 胞にし，2症例のCD13陽性白血病細胞を標的細 胞にした．抗体を入れないコントロールのLAK 活性は，7％から17％であったが，BsAbを加える と30％から42％と細胞障害活性が有意に増加した （図1）．pt．2の白血病細胞に対しては， OKT3を 加えた場合にも細胞障害活性が有意に増加した． しかし，OKT3F（ab〆）2では活性の増加がみられな Donor A ％Cytotoxicity O 25 50 0 25． 50 （一） BsAb OKT3 MY7 0KT3十MY7 0KT3 F（ab’）2 MY7 F（ab’）2 0KT3 F（ab’）2 十MY7 F（ab’）2 Donor B． ＊ ’「arge電＝ pt．1 ＊ 1’arget： 垂煤D 2 ％Cytotoxbity 25 50 0 25 50 かった．このことから，OKT3による活性の増加 は，標的細胞に用いた白血病細胞がFcγ一receptorを持っており，これとOKT3のFc部分が結合し
て，anti−CD3−redirected cytotoxicityの機序によ る細胞障害活性が起こったためであると考えた． 各抗体のF（ab’）2を加えた場合にはコントロール と比べて細胞障害活性に変化はなかった． 2．細胞障害活性に対するBsAbの濃度の影響 51Cr放出細胞障害試験時に種々の濃：度のBsAb を加え，正常ドナーのLAK活性に対する影響を 調べた（図2）．pt．1を標的細胞にした場合には 0．001μg／mlのBsAbでも細胞障害活性を増強す る効果が見られたが，pt．3を標的細胞にした場合 には0．01μg／mlの濃度のBsAbで初めて細胞障 害活性を増強することができた．いずれの場合に も，検討し得た1μg／mlまでの濃度のBsAbでは 細胞障害活性はプラトーには達しなかった．しか し，現在の時点では，BsAbの量に限界があるた め，以下の実験では，ほとんどの場合に0。1μg／m1 0 （一） BsAb OKT3 MY7 0KT3十懐Y7 0KT3 F（ab’）2 MY7 F（ab’）2 0Kτ3 F（aげ）2 十MY7 F（ab’）2 ＊ ’「arget＝ pt，1 ＊＊＊ 2 Target l 垂煤D 書50 ・婁40 §30 き20 獣10 Target＝pt． 1 ノ／♂ ！ ノ ！ノ1 〆！ ノ’ 〆ノ ’’ ’ 窪’” ●一●Donor A o・一つDonor B ＊P〈0．05 図1 CD13＋ANLL細胞に対するLAK活性に及ぼ す各種mAbの影響 51Cr放出試験に以下の抗体を加えた． BsAb＝MY7 Fab’×OKT3 Fab’BsAb O．1μg／ml OKT3＝OKT3（抗CD3mAb）1μg／ml MY7＝MY7（抗CD13mAb）1μg／m1 0KT3 F（ab’）2＝OKT3 F（ab’）2 0．1μg／ml My7 F（ab’）2＝MY7 F（abり20．1μg／m1 エフェクター細胞は，正常ドナーの1週培養の LAK細胞で， E／T比は20：1． 50 書 ・婁40 §30 ぎ20 獣10 0 0．00010。001 0．01 0，1 量 Target：pt．3 ！ 一一一く」鴫一陶4 ’’ ノ ！ ノ ノ ！ 、〆’ ，ノ臣 0 0．00010．001 0．01 0，1 1 Concentration of BsAb （μ9／ml） 図2 細胞障害活性に及ぼすBsAbの濃度の影響 エフェクター細胞は，正常ドナーの2週培養のLAK 細胞で，E／T比は10：1．の濃：度でBsAbを用いた． 3．至適E／幽幽の検討 51Cr放出細胞障害試験で，正常ドナーから得た エフェクター細胞と標的白血病細胞の比を0．6： 1から160：1まで変えて，細胞障害活性が最も強 い至適E／T比を調べた（図3）．標的細胞をpt．1 にした場合には，160：1でもまだプラトーに達し なかったが，標的細胞をpt．2にした場合には， 40：1でプラトーに達した．このように，最大の キラー活性はE／T比が少なくとも40：1の場合 に得られた．しかし，以下の実験では，ほとんど の場合10：1または20：1のE／T比を用いた．こ れは細胞の準備に限界があるためである． 4．凍結保存した白血病細胞の感受性に関する 検討 標的細胞として用いる白血病細胞を凍結保存し た場合と，採血してすぐに用いた場合とで，正常 ドナー由来のLAK細胞に対する感受性が異なる 60 ξ5・ 蚕4。 §・・ 駅20 10 1’arget＝pt． 1 。。…A｛よ＝：鴇A臨Ab D。m・B｛謡器A島Ab 一一か．一一←．．．炉…」一一搗ｽ全属略 0．6：1 2．5：1 10：1 40：1 160：1 1．25：1 5：1 20：1 80：1
60
50
言 屋40 量30 む 獣 20 10 0 f「ﾟ｛ご§：A自、Ab 鵯。，｛慧§：A書。A、グ
×．ク1
．ク！ ！：二粟 1．3：1 2．5：1 5：1 10：1 20：1 E：T ratio 図4 凍結保存白血病細胞の感受性に関する検討 エフェクター細胞は，正常ドナーの3週培養のLAK 細胞で，標的細胞は，pt．1の白血病細胞． BsAbの濃：度は0．1μg／ml， E／T比は20：1． 60 老50 ・婁 040 ぢ 二30 む 獣20 10 0．6：1 2．5：1、 10：1 40：1 160：1 1．25：1 5：1 20：1 80：1 E ： T ratio 図3 至適E／T比の検討 エフェクター細胞は，正常ドナーの1週培養のLAK 細胞で，BsAbの濃度は0．1μg／ml． か否かを検討した（図4）．この結果，凍結保存し た細胞を標的細胞として用いると，E／T比が20： 1の場合は，わずかではあるが感受性の低下が認 められた．しかし，他のE／T比では，有意差を認 めなかったため，今後の実験には，保存細胞を使 用した． 5．LAK細胞誘導のための培養日数の影響正常ドナーのLAK細胞を3日から28日培養し
て，BsAbによって誘導される細胞障害活性の違 いを検討した（図5）．その結果，ドナーと標的細 胞の組合せによって，細胞障害活性のピークが3 日または7日にあることが分かった．また，正常 ドナーAの細胞障害活性は，14日めに低下し，21 日以降には回復した．今回の実験では，主に7日 培養のLAK細胞をエフェクター細胞に用いた． 6．LAK細胞誘導に与える血清の影響 LAK細胞誘導時に，自己血清， AB血清および FCSを培養液にそれぞれ10％加えて，1血清の違い による細胞障害活性誘導の違いについて検討した （図6）．この結果，正常ドナーAでは標的細胞が pt．1の場合にも， pt．3の場合にも，自己血清で最 も強いLAK活性を誘導することができた．正常 ドナーBでは，いずれの標的細胞でもAB血清で 最も強いLAK活性を誘導することができた．どちらの場合でもFCSは3種類の血清の中では最
Target＝pt．1 60 喜50 §40
§ll〈
1・撃P＼＼
…。・A｛＝＝腎含A畠，A、 ・。・。・B｛護腎ΣA自，A、 ％Cytotoxicity O 25’ 50 rA aロto AB FCS rB auto AB FCS ’「arget： pt．1 0 60 あ50 嚢、。 §、。 δ20 駅10 0 3 7 14 21 28 1’arget：pt．2037
14 21 28
Days in Culture 図5 LAK細胞誘導のための培養日数の影響 エフェクター細胞は，正常ドナー2名のLAK細胞で， BsAbの濃度は0．1μg／m1， E／T比は10：1． も低い細胞障害活性しか誘導できなかった．この 結果から以下の実験では，AB血清を用いること にした． 7．非標識的細胞による競合阻害試験 CD13陽性の白血病細胞を51Crで標識して，細 胞障害試験の標的細胞とし，CD13＋， CD13一の非標 識標的細胞を標的細胞の100倍まで加えて，非標識 細胞が細胞障害活性へ与える影響を調べた（図 7）． CD13陽性の非標識細胞を加えると， BsAbで誘 導されたLAK細胞の細胞障害活性は，添加した 非標識細胞の数に比例して，著しく抑制された． CD13陰性の非標識細胞を加えると， BsAbで誘導 されたLAK細胞の細胞障害活性は，添加した非 標識細胞の数には影響されなかった．この結果か らLAK細胞は， BsAbの存在下ではCD13陰性細 胞が多数混在していても，選択的に，CD13陽性細 胞を障害できると考えられた． Donor B 0 25 50 rA auto Targe pt． 3 AB FCS rB auto AB FCS口
no囮BsAb
図6 LAK細胞に血清の影響 auto＝自己血清を10％加えた培養液を用いて1週培 養したLAK細胞 AB＝AB血清を10％加えた培養液を用いて1週培養 したLAK細胞 FCS＝ウシ胎児血清を10％加えた培養液を用いて1週 培養したLAK細胞 BsAbの濃度は0．1μg／ml， E／T比は20：1． 8．各種白血病細胞に対するBsAbの作用 正常ドナーのLAK細胞をエフェクター細胞にし，各種白血病細胞に対する細胞障害活性に
BsAbが与える影響を調べた（図8）． pt．1からpt．4のCD13陽性ANLL細胞に対する細胞障害活性
は，BsAbを加えることによって，有意に増加した．CD13陰性ALL細胞を標的細胞にすると，
LAK細胞の細胞障害活性は， BsAbの添加には影 響されなかった．9．自己白血病細胞に対するLAK細胞と
BsAbの作用
完全寛解中のpt．2とpt．4から，維持療法を行う 直前に末梢血を採取し，IL・2で1週間培養して LAK細胞を誘導し，自己の白血病細胞に対する 細胞障害活性をみた（図9）．pt．2は， BsAbを加 えない場合のLAK活性が低く，これに， BsAbを、：： 嚢、。 量，。 嚢，。 tO Unbbeled lnhibitor：CD13＋ANLL cells ％Cytotoxicity Donor O 25 50 ・。・。・A｛：＝腎：A畠、A、 ・。・。・B｛雌器A昌、A、 ●一一一一●「齢一円r」r軸 。『一一中一一く」一一‡ニ＝ ＝＝司 Pt．2 Pt．4 Normal Donor A Normal Donor B 、ll 嚢、。 豊，。 窯，。 10 0：1 韮：1 3：量 10：1 30＝1 100：1 Unlabeled lnhibitor：CD13−ALL ce胴s 0一一辱一〇一一一一〇鴨、 一一〇一 一〇一 一〇 ●一一一一＿＿申一一一一一一一9一 噂 0；1 1；1 3：1 10：1 30＝1 訂00：1 Unlabeled inhibito【＝target 図7 非標識標的細胞による競合阻害試験 CD13陽性の白血病細胞を51Crで標識し，細胞障害試験 の標的細胞とした．CD13＋， CD13一の非標識白血病細胞 を細胞障害活性試験時に標的細胞の100倍まで加えて， 細胞障害活性への影響を調べた． エフェクター細胞は，正常ドナーの1週間培養の LAK細胞で， BsAbの濃度は0．1μg／ml， E／T比は 20：1． Donor B ％Cりtoto剛city O 25 50 ％Cytotoxicity Donor O 25 50 4 pt． pt． 2 NormalDonor A NormaI Donor B Target＝ pt．2 Pt，闘。、 of τarget cells O Donor A ％Cytotoxicity 25 50 1 ＊ 2 ＊ 3 ＊ 4 ＊ 5 ＊ ＊ ＊ ＊
口
noBsA 囮コBsAb ＊P〈0．05 図8 各種白血病細胞に対するBsAbの作用 エフェクター細胞は，正常ドナーの1週培養のLAK： 細胞で，BsAbの濃度は0．1μg／m1， E／T比は20：1． 加えると細胞障害活性が増強した．p七．4は自己白 血病細胞に対するLAK活性がかなり高く，BsAb を加えると，細胞障害活性は軽度に増強したが， この差は，有意ではなかつた．pt．4によって誘導 Target＝ pt．4 口no BsAb 囮BsAb 図9 自己白血病細胞に対するLAK細胞とBsAbの 作用 エフェクター細胞は，患者および正常ドナーの1週 培養のLAK細胞で， BsAbの濃度は1μg／m1， E／T 上ヒをよ20 ： 1． されたLAK細胞では， pt．2の白血病細胞に対する細胞障害活性もBsAbによってあまり増強で
きなかった． 考 察 BsAbを作製する方法には，化学結合法と細胞 融合法とがある．化学結合法は，合成効率は良く ないが，より純粋なBsAbが作製できる利点があ る．細胞融合法ではいろいろな組合せの抗体が作 られるため，その分離精製が問題になる．化学結合法によって作製したBsAbは，ポリ
マーができやすく，ポリマー体は，肺や網内系組 織で捕捉され易いので，代謝が早いことが臨床投 与の問題であった．そこで，mAbのFc部分を除 去したF（ab’）2から， DTNBを用いて純粋なF （abノ）2 monomer BsAbを作製する方法が考案さ れた15）．Nittaらは， F（ab’）2 monomer BsAbが， Fab’polymerや，（F（ab’）2）2 dimerとくらべる と，最も強い細胞障害活性誘導作用があることを 示した17）．このため，今回著老はこの方法で抗 CD3×抗CD13 F（ab’）2 BsAbを作製することに した．このF（abつ2抗体は， Fc部分がない．ので，Fcレセプターのある細胞に対して細胞障害作用 を示さず，より選択的に標的細胞を障害すると考 えられる．従って，生体内への直接投与の場合に アは，正常細胞への障害作用が少ないという利点が ある．
図1に示すように，LAK細胞をエフェクター
にし，各種の抗体を添加して，51Cr放出試験を 行った．LAK細胞を加えない各抗体単独の添加 では，細胞障害活性がないことをあらかじめ確認 した．抗体を加えない場合と比べて，BsAbを加え ると有意に細胞障害活性が増加した．ほかのF （ab’）2の抗体を加えても，細胞障害活性は，影響を うけなかった．しかし，OKT3を加えると細胞障害活性が有意に増加した．これは標的に用いた
ANLL細胞にFcγreceptorがあるために， anti・ CD3・redirected cytotoxicityの機序で細胞障害 活性が誘導されたためであると考えられた． このBsAbを用いると， BsAbの濃度は，1μg／ mlまでの実験では，濃度が高いほど細胞障害活性 を誘導する作用が強い（図2）．E／T比は標的細胞 によって若干の違いが見られたが，40：1から 160：1がもっとも適当という結果であった（図 3）．しかし，実際に作製したBsAbの量に限界が あり，用意できるLAK細胞の数にも限りがある． このために多くの実験では，0．1μg／m1のBsAb を用い，さらに20：1のE／T比を用いた．1μg／mlのBsAbを用いて40：1から160：1のエフェク
ター対標的細胞比で実験を行えば，より強いキ ラー活性が得られると考えられる．また同様に， 標的細胞も冷凍保存しない新鮮細胞を用いた方 が，細胞障害活性はより高値になることが予想さ れる（図4）．通常培養10日目でのLAK細胞はearly LAK
と呼ばれ，2週以上培養したものは，Iate LAKと 呼ばれている．early LAKにはNK細胞が多く含 まれ，late LAKはT細胞が主体となっていると 考えられている．またLAK細胞の培養日数によ る細胞障害活性の変化についてはこれまでにも報告があるが，5日培養から1週間培養のLAK細
胞の細胞障害活性がもっとも高く，2週間以後の 培養では，かなり低下する7）18）．今回の実験でも， BsAbを加えた場合も加えない場合も細胞障害活性は3日培養から1週間培養のLAK細胞で最も
高かった．BsAbを加えた時の細胞障害活性の誘導は，2から4週間培養のLAK細胞でも1週間
培養のLAKと比べて，同じか，時にはより強かっ た（図5）．これは，．T細胞型のLAK細胞がlateLAKでは増加しているためであると考えられ
る． 白血病細胞において，CD13の発現が必ずしも 100％ではない可能性がある．しかし，LAK細胞が選択的にANLL細胞を障害するという報告も
あり19＞，CD13を発現していない細胞があっても， LAK細胞単独で障害できる可能性が期待できることから，1週間培養のLAK細胞をエフェク
ターとして用いることが適当であると考えた．将 来，臨床的に自家骨髄移植の際のパージングに， BsAbを用いることを想定した場合も，1週間培 養のLAK細胞がエフェクターとして用意しやす いものと思われる． 将来の臨床応用の可能性を考え，LAK細胞の 細胞障害活性誘導に与える培養液中の血清の影響 を調べた．図6にみられるように，BsAbを加えな い場合は，FCSを加えた時に細胞障害活性はもっ とも高くなるが，BsAbを加えると自己血清また はAB 1血清を用いた方が強い細胞障害活性を誘 導できることが分かった． 自家骨髄移植での応用を考えると，寛解期の骨 髄細胞の中にわずかに残っている残存白血病細胞をこのBsAbを用いた方法で選択的に障害でき
るかが問題になる．そこで，CD13陰性のALL細 胞と51Crで標識したCD13陽性細胞とを様々な割 合で混ぜて，細胞障害試験を行った（図7）．下の 段の図にあるように，CD13陰性のALL細胞を標 的細胞の100倍混ぜても，CD13陽性細胞に対する 細胞障害活性には，影響を与えなかった．したがっ て，LAK細胞とBsAbを組合わせて用いると，骨 髄中に，1／100しか残存していない白血病細胞でも 効率的にパージングできる可能性が示された． 自家骨髄移植のパージングの場合には，エフェ クター細胞として，患者自身の末梢血から誘導し たLAK細胞を用いる必要がある．このことを検回した結果が図9である．完全寛解の患老の末梢 血から単核細胞をとり，正常人と全く同じ方法で LAK細胞を誘導して，エフェクター細胞に用い た．標的とする白血病細胞によって，その結果は少 し異なり，pt．2を標的細胞にすると，自己のLAK 細胞はBsAbなしでは差がないが， BsAbを加え ると，他の白血病患者のLAK細胞よりも自分の 白血病細胞に対して細胞障害活性を強く示した． Pt．4では，自己のLAK細胞は， BsAbな．しでは最 も強い細胞障害活性を持つが，BsAbを加えても その活性はあまり増加しなかった．一般に，自血
病患者のLAK活性やNK活性は低下していると
いわれている20）21）．このために，正常ドナーに比べ て強い活性が誘導されにくい可能性が考えられ る．正常ドナーに比べて，IL−2ではBsAbを加えた 場合のエフェクター細胞であるT細胞が増加し にくい可能性もある．これについては，今後症例 を増やして検討する必要がある。 以上の結果から，抗CD 13 Fab〆×抗CD3 Fab／BsAbが， LAK細胞によるCD13陽性ANLL細
胞に対する細胞障害活性を増強する作用があるこ とが分かった．今後，より一層強い細胞障害活性 を誘導するためには，エフェクター細胞の誘導に 工夫の余地があると考えている。IL−2単独ではな く，他のサイトカインを併用して，LAK細胞より 強い細胞障害活性を持つエフェクター細胞を現在 検討中である． 結 論 抗CD13 Fabノ×抗CD3 Fab’BsAbを加えるこ とにより，LAK細胞によるCD13陽性白血病細胞 に対する細胞障害活性を増強できることを示し た．さらに，BsAb添加によるLAK活性増強のた めの至適条件を検討した．今後臨床的には，LAK 細胞とBsAbを併用する方法が， ANLLの自家骨 髄移植の際の，白血病細胞のパージングに利用で きる可能性があることを実験的に示した． 稿を終えるにあたり，御指導，御校閲を賜りました 溝口秀昭教授，押味和夫助教授に深謝いたします．ま た，抗体を作製して下さいました，日本化薬株式会社 高崎研究所生物工学研究所 角井康彦氏，二四幸博氏 に感謝いたします．快く患者白血病細胞を提供してく ださいました，泉二登志子講師に感謝いたします． 文 献 1）Ruscetti FW， Gallo RC：Human T− lymphocyte growth factor：Regulation of growth and function of T lymphocytes． Blood 57：379−394， 1981 2）Herberman RB， Hisemdt J， Vujanovic N et a1：Lymphokine・activated k量11er cell activity： Characteristics of effector cells an（ユtheir pro− genitors in blood and spleen． Immunol Today 8：178−181， 1987 3）Rosenberg SA， Lotze MT， Muul LM：Aprog− ress report on the treatment of 157 patients with advanced cancer using lymphokine・ activated killer cells and interleukin−20r high dose interleukin−2 alone． N Engl J Med 316： 889−897， 1987 4）Rosenberg SA， Lotze MT， Muul LM：Obser・ vations on the systemic administration of autologous lymphokine−activated killer cells and recombinant lnterleukin−2 to patients with metastatic cancer。 N Engl J Med 313： 1485−1492， 1985 5）Rosenberg SA， Spiess P，1、afreRiere R：A new approach to the adoptive immunotherapy of cancer with tumor infiltrating lymphocytes． Science 233：1318−1321， 1986 6） Belldegrurn AI∠，］MIuul I」M， Rose皿berg SA： Interleukin−2 expanded tumor infiltrating Iymphocytes in human renal cell cancer． Can− cer Res 48：206−215，1988 7）Oshimi Kg Osh至mi Y， Akutsu H et al： Cytotox童city of interieukin 2−activated lymphocytes for leukemia and lymphoma cells． Blood 68：938−948，1986 8）Staerz UD， Ka雄agawa O， Bevan MJ： Hybrid antibodies can target sites for attack by T cells． Nature 314：628−631，1985 9）Perez P， Ho∬man RW， Tirus JA：Speci丘。 targeting of human peripheral blood T cells by heteroaggregates containing anti−T3 crosslin・ ked to anti・target antibodies． J Exp Med 163： 166−178， 1986 10）Liu MA， Klranz DM， Kumick JT et al： Heteroantibody duplexes target cells for lysis by cytotoxic T lymphocytes． Proc Natl Acad Sci USA 82：8648−8652，1985 11）Jung G， Honsik CJ， Reisfeld RA et a1： Activation of human peripheral blood mononu− clear cells by anti・T3：Killing of tumor targetcells coated with anti-target-anti-T3 gates. Proc Natl Acad Sci USA 83 : 4479-4483, 1986
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