博 士 論 文 概 要

早稲田大学大学院 先進理工学研究科

博 士 論 文 概 要

論 文 題 目 蛍光プローブを用いた

微生物増殖ドロップレットの検出技術の開発 Development of a detection method of droplets

containing growing bacteria by use of a fluorescent probe

申 請 者

大田 悠里

Yuri OTA

生命医科学専攻 環境生命科学研究

2019 年 12 月

No. 1

本 論 文 の 構 成 は 第 1 章 緒 論 ， 第 2 章 実 験 方 法 ， 第 3 章 結 果 と 考 察 ， 第 4 章 結 言 と 展 望 か ら 成 る 。

微 生 物 は 我 々 の 生 活 に 密 接 に 関 与 し て お り ， こ れ ら の 微 生 物 の 機 能 や 性 質 を 知 る た め ， ま た そ の 機 能 を 利 用 す る た め に は 微 生 物 の 培 養 が 必 須 と な る 。 微 生 物 の 培 養 方 法 と し て ， 近 年 マ イ ク ロ デ バ イ ス を 用 い た 微 小 空 間 に お け る 培 養 が 注 目 さ れ つ つ あ る 。 微 細 加 工 チ ッ プ を 用 い た 培 養 で は ， 固 定 し た 細 胞 を タ イ ム ラ プ ス 観 察 す る こ と で シ ン グ ル セ ル レ ベ ル で の 遺 伝 子 変 異 の 出 現 頻 度 の 解 析 や 抗 生 物 質 耐 性 試 験 ，表 現 型 の 解 析 等 が 実 施 さ れ て き た 。ま た ，区 画 化 さ れ た ウ ェ ル あ る い は ， 微 生 物 細 胞 と 同 じ 幅 の 流 路 を 持 つ デ バ イ ス が 分 離 培 養 に 利 用 さ れ て き た 。 し か し な が ら ， 一 度 に 数 十 〜 数 千 程 度 の 培 養 場 し か 用 意 で き な い た め ス ル ー プ ッ ト の 低 さ が 課 題 で あ っ た 。 微 生 物 培 養 の ハ イ ス ル ー プ ッ ト 化 と し て 初 め て 提 案 さ れ た の は ゲ ル ド ロ ッ プ レ ッ ト を 用 い た 方 法 で あ る 。 数 十 万 〜 数 百 万 単 位 で 作 製 で き る ゲ ル ド ロ ッ プ レ ッ ト に 環 境 微 生 物 を 封 入 す る こ と で 様 々 な 種 類 の 微 生 物 が 獲 得 さ れ て き た も の の ， ゲ ル 化 プ ロ セ ス が 細 胞 の 生 存 に 与 え る 影 響 や ゲ ル 環 境 が 細 胞 の 増 殖 に 与 え る 影 響 を 注 意 深 く 考 慮 す る 必 要 が あ る 。 そ こ で 完 全 液 相 系 で あ る w at er - i n- oi l ド ロ ッ プ レ ッ ト に 着 目 し た 。w at er -i n -oi l ド ロ ッ プ レ ッ ト と は ， 連 続 相 で あ る オ イ ル 中 に 分 散 さ せ た 水 滴 （ 分 散 相 ） の こ と で あ り ， 界 面 活 性 剤 が 一 つ 一 つ の 水 滴 を 安 定 化 さ せ る 。 ド ロ ッ プ レ ッ ト 培 養 に お い て 連 続 相 と し て よ く 使 用 さ れ る フ ッ 素 系 オ イ ル は ガ ス 溶 解 度 が 高 い こ と か ら ， 気 相 を 制 御 す る こ と で ， メ タ ン な ど の 水 に 溶 け に く い ガ ス を 必 要 と す る 微 生 物 や 嫌 気 性 微 生 物 を 培 養 で き る 。ま た ， ド ロ ッ プ レ ッ ト の 区 画 化 効 果 に よ り 複 数 種 の 微 生 物 を 含 む サ ン プ ル か ら 単 一 種 を 獲 得 で き る 。 逆 に 複 数 種 の 微 生 物 を ド ロ ッ プ レ ッ ト に 封 入 す る こ と で 細 胞 間 相 互 作 用 の 解 析 が 可 能 で あ り ， さ ら に ド ロ ッ プ レ ッ ト 内 共 培 養 は 特 定 の 微 生 物 の 増 殖 を 促 進 あ る い は 阻 害 す る 微 生 物 の ス ク リ ー ニ ン グ に も 応 用 さ れ て い る 。 以 上 の よ う に 培 養 空 間 の 区 画 化 や ガ ス 環 境 の 制 御 等 に よ り ， 様 々 な 環 境 微 生 物 の 培 養 に 有 効 で あ る と 期 待 さ れ る 。 し か し な が ら ， こ こ で 課 題 と な る の が ， 微 生 物 が 増 殖 し た ド ロ ッ プ レ ッ ト の 検 出 で あ る 。 濁 度 や 散 乱 光 等 に 基 づ く 検 出 で は 感 度 が 低 く ， ド ロ ッ プ レ ッ ト 内 部 に 細 胞 が 高 密 度 に 存 在 す る 必 要 が あ る 。 そ こ で 高 感 度 検 出 に 向 く 蛍 光 プ ロ ー ブ に 着 目 し た 。 低 分 子 の 蛍 光 プ ロ ー ブ と し て よ く 使 用 さ れ る レ サ ズ リ ン は 細 胞 の 代 謝 活 性 に 反 応 し て 蛍 光 を 発 す る 。 し か し ， 本 蛍 光 色 素 は ド ロ ッ プ レ ッ ト 間 を 通 過 す る た め ， 増 殖 活 性 の 有 無 に 関 わ ら ず 数 時 間 で ド ロ ッ プ レ ッ ト の 蛍 光 強 度 が 一 様 と な り ， 増 殖 速 度 の 遅 い 微 生 物 を 含 む 環 境 微 生 物 の 検 出 に は 不 向 き で あ る 。 本 研 究 で は ド ロ ッ プ レ ッ ト 間 を 通 過 し な い 蛍 光 核 酸 プ ロ ー ブ の 使 用 を 着 想 し ， 安 定 性 の 高 い R N ase を 検 出 対 象 と し た 。 両 端 が 蛍 光 分 子 で 修 飾 さ れ た 短 鎖 R NA か ら 成 る 蛍 光 R NA プ ロ ー ブ は 通 常 ，F l uo r es c en c e R e son an c e En er gy Tr an sf e r (F R E T) に よ り 消 光 し て お り ，R Na se に よ り 切 断 さ れ る と 蛍 光 を 発 す る 。 本 蛍 光 R NA プ ロ ー ブ を 微 生 物 と と も に ド ロ ッ プ レ ッ ト 内 に 封 入 す る と ， 微 生 物 が 増 殖 す る 過 程 で 産 生 さ れ る R N as e を 検 出 で き る 。 本 手 法 を “F NAP -so rt

No. 2

(F l uo r es c en c e n u cl ei c a ci d p rob e i n dr opl et s fo r ba ct e ri al so rt i ng )” と 名 付 け た 。 本 研 究 で は 市 販 の ド ロ ッ プ レ ッ ト 作 製 装 置 を 使 用 し て 直 径 約 12 0 µ m の ド ロ ッ プ レ ッ ト を 作 製 し た 。 連 続 相 と し て フ ッ 素 系 界 面 活 性 剤 P i c o -su r f 1 を 含 む フ ッ 素 系 オ イ ル Nov e c7 500 を 使 用 し た 。 ド ロ ッ プ レ ッ ト の 安 定 性 を 確 認 す る た め に ド ロ ッ プ レ ッ ト の サ イ ズ を 経 時 的 に 測 定 し た 結 果 ，42 日 後 に は 多 少 サ イ ズ が 小 さ く な る も の の ， ド ロ ッ プ レ ッ ト 間 で の サ イ ズ の ば ら つ き は 小 さ く ， 均 一 性 は 維 持 さ れ た 。 次 に モ デ ル 純 菌 株 を 用 い て ド ロ ッ プ レ ッ ト 内 で の 培 養 試 験 を 行 っ た 。 モ デ ル 純 菌 株 と し て Es ch er i c hi a col i, Ba ci l l us su bt i l i s, St rep t om y c es a ureof aci en s, お よ び Brad y rhi zob i um j apo ni cum を 使 用 し た 。各 種 微 生 物 細 胞 を シ ン グ ル セ ル レ ベ ル で ド ロ ッ プ レ ッ ト に 封 入 し ， 経 過 観 察 を 行 っ た と こ ろ ， ド ロ ッ プ レ ッ ト 内 部 で の 細 胞 増 殖 が 確 認 さ れ ， 微 生 物 の 種 ご と に 増 殖 形 態 の 違 い が 観 察 さ れ た 。 ま た 顕 微 鏡 観 察 画 像 を 用 い て ド ロ ッ プ レ ッ ト 内 で の 細 胞 増 殖 を 定 量 的 に 評 価 し た 結 果 ，E . co l i の 増 殖 は 培 養 5 .5 時 間 後 か ら 確 認 さ れ た 。 ド ロ ッ プ レ ッ ト 内 で の 細 胞 増 殖 が 確 認 で き た の で ， 細 胞 増 殖 ド ロ ッ プ レ ッ ト の 分 取 を 試 み た 。 セ ル ソ ー タ ー を 用 い る こ と で ド ロ ッ プ レ ッ ト の 高 速 な 分 取 が 可 能 と な る が ， 一 般 的 な セ ル ソ ー タ ー は シ ー ス 液 と し て 使 用 で き る 液 体 が 制 限 さ れ て お り ，w at er -i n- oi l ド ロ ッ プ レ ッ ト を そ の ま ま 使 用 で き な い 。 そ こ で ， 連 続 相 と し て 使 用 し た オ イ ル を シ ー ス 液 と し て 利 用 で き る マ イ ク ロ 流 路 式 セ ル ソ ー タ ー を 使 用 し た 。 ま ず 対 象 物 の 密 度 を 反 映 す る 側 方 散 乱 光 (S i d e s ca t t er, S S C ) の 大 き さ に 基 づ い て E. co l i 封 入 ド ロ ッ プ レ ッ ト の 分 取 を 実 施 し た 。 培 養 5 時 間 後 の S S C に 基 づ く 分 取 後 に は ， 空 ド ロ ッ プ レ ッ ト が 40%程 度 混 在 し て い た 。培 養 1 日 後 に も 同 様 に S S C に 基 づ い て 分 取 し た 結 果 ，8 5%

以 上 が 微 生 物 増 殖 ド ロ ッ プ レ ッ ト と な っ た 。 ド ロ ッ プ レ ッ ト 内 で 細 胞 が 高 密 度 に 増 殖 す れ ば S S C を 指 標 と し て 精 度 よ く 分 取 で き た が ，培 養 初 期 の 低 密 度 の と き に は 分 取 の 精 度 が 低 か っ た 。 こ れ を 改 善 す る た め に 上 述 の 蛍 光 を 用 い た 高 感 度 な 手 法 で あ る F NAP -so rt を 適 用 し た 。

F NAP -s ort の 原 理 を 実 証 す る ポ ジ テ ィ ブ コ ン ト ロ ー ル と し て ，蛍 光 R NA プ ロ ー ブ と 市 販 の R N as e A を 反 応 さ せ ， ド ロ ッ プ レ ッ ト 内 で R N ase 反 応 が 進 行 す る こ と ， お よ び R N ase 活 性 を 蛍 光 に よ り 検 出 で き る こ と を 確 か め た 。 本 実 験 よ り ， 蛍 光 R NA プ ロ ー ブ 20 0 nM を 使 用 し て R N a se A 50 f g/ µ L (2 ,1 90 分 子/ d ro pl et ) 以 上 が 検 出 さ れ た 。 ま た ，R N as e A と は 異 な る 種 類 の R Na se や そ の 他 様 々 な 分 子 も 含 む 微 生 物 の 培 養 上 清 と 蛍 光 R NA プ ロ ー ブ を 反 応 さ せ た 場 合 に お い て も 蛍 光 強 度 の 増 大 が 確 認 で き た 。 つ ぎ に E. col i と 蛍 光 R NA プ ロ ー ブ を ド ロ ッ プ レ ッ ト に 封 入 し て 経 過 観 察 を 行 っ た 。培 養 4 時 間 後 か ら 蛍 光 強 度 が 増 大 し 始 め ，培 養 18 時 間 後 に は 空 ド ロ ッ プ レ ッ ト と E . co l i 増 殖 ド ロ ッ プ レ ッ ト の 蛍 光 強 度 は は っ き り と 区 別 が つ い た 。E. col i の 増 殖 に 関 し て は 約 4 ,240 細 胞 以 上 を 蛍 光 検 出 で き る こ と が 示 唆 さ れ た 。 同 様 に B . sub t i l i s，S . aureof a ci ens， お よ び B. j a po ni c um に 関 し て

No. 3

も 蛍 光 R NA プ ロ ー ブ と 一 緒 に ド ロ ッ プ レ ッ ト に 封 入 し た と こ ろ ， 培 養 日 数 に 違 い は あ る が ， 細 胞 が 増 殖 し た ド ロ ッ プ レ ッ ト の 蛍 光 強 度 が 増 大 し ， 空 ド ロ ッ プ レ ッ ト と 識 別 で き た 。 セ ル ソ ー タ ー を 用 い て 蛍 光 強 度 の 高 い ド ロ ッ プ レ ッ ト を 分 取 す る こ と で 細 胞 増 殖 ド ロ ッ プ レ ッ ト の 分 取 精 度 を 評 価 し た 。E . co l i と 蛍 光 R NA プ ロ ー ブ を 封 入 し た ド ロ ッ プ レ ッ ト を 5 時 間 培 養 し た 後 お よ び 1 日 培 養 し た 後 に 蛍 光 強 度 の 高 い ド ロ ッ プ レ ッ ト を 分 取 し た 結 果 ， い ず れ も 99%以 上 の ド ロ ッ プ レ ッ ト 内 で 細 胞 が 増 殖 し た 様 子 が 観 察 さ れ ，S S C を 用 い た 分 取 よ り も 精 度 よ く 分 取 で き る こ と が 確 認 さ れ た 。 ま た ，B . su bt i l i s，S. a ureof a ci e ns， お よ び B. j a poni cu m に F NAP - so rt を 適 用 し た と こ ろ 、 そ れ ぞ れ 培 養 時 間 は 異 な る も の の ， 内 部 で 増 殖 が 見 ら れ た ド ロ ッ プ レ ッ ト を 濃 縮 で き た 。 本 実 験 で は 少 な く と も 6 日 間 の 培 養 後 に 微 生 物 増 殖 蛍 光 ド ロ ッ プ レ ッ ト と 空 の 非 蛍 光 ド ロ ッ プ レ ッ ト を は っ き り と 区 別 で き た 。 さ ら に ， 分 取 後 の ド ロ ッ プ レ ッ ト 内 に 含 ま れ る 細 胞 の 生 存 評 価 を 行 っ た 。 LI VE/ DEA D 染 色 の 結 果 か ら 死 菌 は 0 .9 %程 度 し か 含 ま れ ず ， ま た ， 寒 天 培 地 に 播 種 し た と こ ろ コ ロ ニ ー 形 成 が 確 認 さ れ た こ と か ら ， 細 胞 を 生 き た ま ま 回 収 で き た こ と が 示 さ れ た 。

最 後 に 環 境 サ ン プ ル と し て 土 壌 由 来 の 微 生 物 に 対 し て F NAP -so r t を 適 用 し ， 微 生 物 増 殖 の 検 出 お よ び 分 取 を 行 っ た 。 土 壌 微 生 物 の 培 養 効 率 を 算 出 し た と こ ろ ， ド ロ ッ プ レ ッ ト 培 養 で は 全 細 胞 の 0 .06 %程 度 が 培 養 可 能 で あ っ た 。 複 合 系 で あ る 土 壌 微 生 物 に 対 し て F NAP -so rt を 実 施 し た 結 果 ， 分 取 後 に は 97 %程 度 が 細 胞 増 殖 ド ロ ッ プ レ ッ ト と な り ，S S C に 基 づ く 分 取 後 の 細 胞 増 殖 ド ロ ッ プ レ ッ ト の 割 合 が 88%程 度 だ っ た こ と と 比 較 す る と ， よ り 高 精 度 に 微 生 物 増 殖 ド ロ ッ プ レ ッ ト を 分 取 で き た こ と が 示 さ れ た 。 分 取 さ れ た ド ロ ッ プ レ ッ ト の 菌 叢 を 解 析 し た 結 果 ， 培 養 日 数 ご と に 異 な る 菌 叢 が 得 ら れ た 。 特 に 培 養 7 日 後 に 分 取 さ れ た ド ロ ッ プ レ ッ ト に お い て ， 新 規 性 が 高 い と 予 想 さ れ る O pe ra tio na l Ta xon omi c Unit（OT U） が 他 の サ ン プ ル と 比 較 し て 高 い 割 合 で 検 出 さ れ た 。 ま た ， 培 養 7 日 後 に 得 ら れ た 非 蛍 光 ド ロ ッ プ レ ッ ト の 菌 叢 は 分 取 さ れ た 蛍 光 ド ロ ッ プ レ ッ ト の 菌 叢 と は 大 き く 異 な っ た 。 さ ら に ， バ ル ク 培 養 で 検 出 さ れ た 菌 叢 と 比 較 す る と ， ド ロ ッ プ レ ッ ト 培 養 に よ り 得 ら れ た 菌 叢 は 多 様 で あ り ， か つ 菌 叢 の 構 成 も 異 な っ た こ と か ら ド ロ ッ プ レ ッ ト 培 養 に よ る 区 画 化 の 効 果 も 示 さ れ た 。

以 上 ， 本 論 文 で は ， ド ロ ッ プ レ ッ ト 内 の 細 胞 増 殖 を 高 感 度 に 検 出 す る 手 法 と し て R Na se 活 性 を 指 標 と し た F N AP - so rt を 開 発 し た 。 本 手 法 に よ り ， ド ロ ッ プ レ ッ ト 内 で の 微 生 物 増 殖 を ハ イ ス ル ー プ ッ ト に 検 出 し ， 精 度 よ く 分 取 で き る こ と を 示 し た 。 今 後 ， 本 技 術 は ，R N as e 活 性 以 外 の 酵 素 活 性 の 検 出 や ， 抗 生 物 質 等 の 特 定 の 分 子 を 検 出 す る 手 法 等 と 組 み 合 わ せ る こ と で ， 環 境 中 か ら 様 々 な 機 能 を 持 つ 微 生 物 を 探 索 す る 技 術 と し て さ ら に 発 展 す る こ と が 期 待 さ れ る 。

Ｎｏ.1

早稲田大学 博士（工学） 学位申請 研究業績書

氏 名 大田 悠里 印

（2020年 2月12現在）

種 類 別 題名、 発表・発行掲載誌名、 発表・発行年月、 連名者（申請者含む）

a 論文

○ <1> Y. Ota, K. Saito, T. Takagi, S. Matsukura, M. Morita, S. Tsuneda, N. Noda. “Fluorescent nucleic acid probe in droplets for bacterial sorting (FNAP-sort) as a high-throughput screening method for environmental bacteria with various growth rates.” PLOS One,14, e0214533 (2019).

Ｎｏ.2

早稲田大学 博士（工学） 学位申請 研究業績書

種 類 別 題名、 発表・発行掲載誌名、 発表・発行年月、 連名者（申請者含む）

c 講演 <1> 大田悠里，斉藤加奈子，髙木妙子，松倉智子，森田雅宗，常田聡，野田尚宏，「RNase

活性を指標とした微生物増殖 water-in-oil ドロップレットの検出法 “FNAP-sort” の 確立」第71回日本生物工学会大会，1Hp05，岡山，2019年9月 (口頭)

<2> 大田悠里，斉藤加奈子，髙木妙子，松倉智子，森田雅宗，常田聡，野田尚宏，「W/O

ドロップレットを用いた環境微生物培養の基盤技術 “FNAP-sort” の開発」環境バイ オテクノロジー学会2019年度大会，O-02，大阪，2019年6月 (口頭)

<3> 大田悠里，斉藤加奈子，髙木妙子，松倉智子，森田雅宗，常田聡，野田尚宏，「ハイ

スループット培養を目指した散乱光および蛍光に基づく微生物増殖 W/O ドロップ レットの検出」日本農芸化学会2019年度大会，1C4a11，東京，2019年3月 (口頭)

<4> 大田悠里，斉藤加奈子，松倉智子，髙木妙子，森田雅宗，常田聡，野田尚宏，「water-

in-oilエマルションを用いた微生物の培養および検出技術の構築」第70回日本生物工

学会大会，1Mp01，大阪，2018年9月 (口頭)

<5> 大田悠里、斉藤加奈子、松倉智子、髙木妙子、常田聡、野田尚宏、「water-in-oilエマ

ルションを用いた微生物培養技術の開発」、第69回日本生物工学会大会、3P-I179、東 京、2017年9月 (ポスター)

Ｎｏ.3

早稲田大学 博士（工学） 学位申請 研究業績書

種 類 別 題名、 発表・発行掲載誌名、 発表・発行年月、 連名者（申請者含む）

e その他

(特許) <1> PCT/JP2018/037257（国外），「water-in-oilエマルション培養における蛍光を用いた細

胞増殖検出方法」大田悠里、斉藤加奈子、髙木妙子、常田聡、宮本龍樹、森田雅宗、

松倉智子、野田尚宏、2018年10月