博 士 （ 医 学 ） 姜 綉 雲
学 位 論文 題 名
In Vitro Analysis of Cell Death of Spinal Oligodendrocytes inaRat Model for HTLV‑I Infecton (HTLV‑I 感 染に 伴 う ラ ット に お け る
脊 髄 オリ ゴ デ ン ドロ サ イ ト細胞 死の in vitro 解 析）
学 位 論 文 内 容の 要 旨
HTLVーI(humanTlymphocyte virus typeI）は1980年代初頭にヒトに感染するレト口 ウイルス として初めて分離同定され、その後成人T細胞自血病(adultTcell leukemia，
´皿1の 原 因ウイ ルスある ことが確認 された。HTLV−IはハrL以 外にも、 下肢の対 麻 痺を主徴とする慢性脊髄症（HnV‐IaSSOCiatedmyelopa也y／tropiCSpaStiCparapareSiS， HAM／TSP）や慢 性関節症 、ブドウ 膜炎、細気管支肺胞炎さらにシェーグレン症候群の 一部にも 病因的役 割を担う という証 拠が蓄積 されてきて いる。H1LV‐I感染による脊 髄 障 害 を 主 体 と し た 神 経疾 患 で あるHAM/TSPにつ い て は広 範 な 基礎 及 び臨 床 研 究 が行 わ れ てきた が、その 発症機構に 関しては 不明な点 が多く、 病因解明 の突破□ と して 動 物 モデル の開発が 強く望まれ てきた。 我々はHnV‐I関連疾患 モデル動 物の開 発に 向 け てH凡V‐I産 生 ヒ トT細胞 株MT−2を ラ ット に 接 種しHTLV−I持続感 染ラッ ト を 作 製 、7系 統 の ラ ッ ト の う ちWKAH系 ラ ッ ト に 約15ケ 月 の 潜 伏 期 を 経 て ヒ ト HAM／TSPに 類 似 す る下 肢 の対 麻 痺 を主 症 状 とす る 脊髄 症 を 発症 す るラ ッ ト （HAM ラ ッ ト ） を 樹 立 し た 。 神 経 病 理 学 的 に は 胸 髄 主 体 の前 側 索 周辺 帯 の髄 鞘 破 壊、
microglia/macrophageの浸潤、 空胞変性、アスト口グリオーシスで、リンパ球の浸潤 はほ と ん ど認め なかった 。経時的病 理所見で は、H孔V‐I接種後7ケ 月頃から 胸髄白 質に ア ポ トー シ ス細 胞 が 出現 し 、 病変 の 進行 と 共 にそ の 数が 増 加 した 。電顕に て oligodendrocyteのアポ 卜ーシス が確認さ れるととも に、TUNEL法と 免疫染色 によル アポ ト ー シス 細 胞の 多 く はoligodendrocyteであっ た。プ口 ウイルスDNAは感染後3 ケ 月 で 脊 髄 に 検 出 さ れ 、感 染 後7ケ 月に 急 激に 増 加 する 脊 髄 に選 択 的なHnV一IpX mRNAの発 現 が 認め ら れた 。 ま た、 こ の時 期 か らTNF‐Qの 発現 亢 進 も認 めるほか 、 アポ卜一 シス抑制 因子であ るbcl・2の強い発現抑制が確認された。PCR増幅後のinsim hybridizationと 免 疫 染 色 で は 、 脊 髄 で のHTLV‐Iプ 口 ウ イ ル ス は 少 な く と も microglia/macrophage系の 細 胞に 存 在 するこ とが確認さ れた。以 上より、HAMラッ ト病 の 発 症機 構 とし て 、TNF‐Qな ど への トラン ス活性化 能を持ちHTLV‐IpX領域に コー ド さ れるp40Taxの 局 所 での 発 現 増強 と それ に 伴 い産 生 され るTNF−Q、さらに bcl→2の抑制によるoligodendrocyteのアポトーシス誘導が重要であると想定された。
本研究で はこの機 構の可能 性を証明 するため 、HnVーI感染ラ ット脊髄からmicroglia やOligodendrOCyteを分離培養し、miCrogliaでのTNF‐Q産生やOIigodendrOCyteのTNF―Q
など細胞傷害因子に対する感受性を検討した。
抗p40Tax抗 体を用 いたHAMラッ ト病 脊髄 の免疫 染色 では 、白 質や 灰白 質にp40Tax 蛋 白 の 発 現 細 胞 を 証 明 し た 。 さ ら に 、HAMラ ッ ト 病 を 発 症 す るWKAH系 感 染ラ ッ ト で のp40Tax蛋白発 現細 胞数 は非 発症 系2系統の 感染 ラッ トに 比ベ 、多 数存 在す る ことを確認した。oligodendrocyteとmicrogliaの分離はバーコール密度勾配法で行い、
約95％ の純 度で それ ぞれ の分離 細胞 を得 た。 この 分離 細胞 を用 いてHTLV‑I pX mRNA の 発現 をRTーPCR法で 検索 する と、 コント口ールとして[3‑actinの発現を基準にした と き 、pX mRNAの発 現は 相対 的にoligodendrocyteよ りmicrogliaで 高い 傾向 にあ っ た 。TNF‑aの 産生 につ いて は中 枢神 経系 でそ の代 表的 産生細 胞で あるmicrogliaの分 離 培養 細胞 を用 いて 検討 をした 。感 染後10ケ 月で は感 染ラ ット と同月齢の非感染ラ ッ トか ら分 離し たmicroglia細 胞培 養上 清中 のTNF‑a産 生に 差は なかったが、18ケ月 では感染ラットに有意な産生量の増加を認めた。次に、分離した脊髄のoligodendrocyte のTNF‑aに 対 する 感 受 性 を 検 討 し た 。 そ の 結果 、TNF‑aの 添加 はHTLV‑Iの感 染の 有 無 に 関 わ ら ず 、 ま たHAM発 症 系WKAH系 ラ ッ ト の み な ら ず 非 発 症 系 で あ るACIや LEW系 ラ ッ ト でも 濃 度 依 存 性 に 死 細 胞 数 の 増 加 を 誘 導 し た 。 そ の 中 で も特 にWKAH 系 ラッ トのoligodendrocyteは 他系 統ラットに比ぺてその感受性は高く、HILV‑I感染 は さ ら に そ の 感 度 を 増 加 さ せ た 。TNF‑aに よる アポ トー シス 細胞 死に はTNFR1を 介 し た シ グ ナ ル が 重 要 で あ る こ と が 知 ら れ て お り 、TNFR1のmRNA発 現 をRT‑PCR法 で 検索 した。その結果、分離oligodendrocyteおよびmicrogliaの両方で確認された。
一 方、 以前 から 知ら れて いる血 清中 に含 まれ る細 胞傷 害因 子に 対するHTLV‑I感染ラ ッ トのoligodendrocyteへ の効 果を 検討した。5％FCS添加培養液と無血清培養液を用 いて、oligodendrocyteの細胞死を比較した結果、血清の存在下でoligodendrocyteに多 数 の 細 胞 死 を 認 め た 。 特 にWKAH系 は 非 発 症系 よ り 死 細 胞 数 が 多 く 、HTLV−I感 染 は こ の 細 胞 死 も 増 加 さ せ た 。 さ ら に 、 正 常 ラ ッ ト 血 清 で もFCSと 同 レ ベ ル の oligodendrocyteの細 胞死 を誘 導し た。 この ラッ ト血 清の細 胞傷 害因子はIgG除去し て も、 ある いは56℃30分 で非動 化し ても 、そ の効 果に 変化 はな かった。このラット 血 清を 分子 量で 分画 する と、そ の細 胞障 害活 性は 約l00‑‑‑300Kdaの分画に確認され た 。 こ の 細 胞 傷害因 子はTNF‑aに よるoligodendrocyte傷 害に 加え 、HAMラッ ト病 変 の 進 行 に 伴 い 血 液 脳 関 門 の 破 壊 が 生 じ た 場 合 に は 血 清 成 分 と と も に 流 入 し 、 oligodendrocyteの傷害を増強し、病変をさらに進行させる可能性があると考えられた。
一 方、 中枢 神経 のグ リア 細胞系 で重 要なアポトーシス抑制因子として働き、且つHAM ラ ット 脊髄 でそ の発 現抑 制が確 認さ れているbcl‑2の発現について、分離細胞を用い て 半 定 量 的 競 合RT‑PCR法 で 検 討 し た 。HTLV‑I感 染WKAHラ ッ ト のoligodendrocyte で は 感 染 後7、9、12ケ 月 で ほ と ん ど 完 全 に発現 の抑 制を 認め た。18ケ 月で 発現 量 の 回復 傾向 を見 たが 、9ケ 月齢 の正 常ラットの半分以下であった。一方、この感染ラ ットのmicrogliaでは発現の低下は認めなかった。
本 研 究 の 結 果 か ら 、HTLV‑I感 染WKAHラ ッ ト の 脊 髄 で は 感 染microgliaでのpX の 発現 増強 に伴 うTNF‑aの 産生 やそ の他 の細 胞傷 害因 子の発 現が 、bcl‑2の発現抑制 に よル アポ トー シス 細胞 死への 抵抗 性の低下したoligodendrocyteにアポトーシスを 誘 導 し 、HAMラ ット 病の 発症 へと 進行 して いく可 能性 が考 えら れる 。さ らに 、こ の 研 究 成 果 は ヒ トHAM/TSPの 発 症 機 構 の 解 析 モ デ ル と な る の み な ら ず 、 ヒト 免疫 不 全 ウ イ ル ス(HIV‑1） 感 染 に よ るAIDS脳 症 やHAM/TSP類 似 の 髄 鞘 の 破 壊 を 主体 と す る病 理像 を示 すそ の他 の中枢 神経 傷害 の発 症機 構解 析に も役 立っものと期待され る。
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学位論文審査の要旨
学位論文題名
In Vitro Analysis of Cell Death of Spinal Oligodendrocytes inaRat 、MOdelfo rHTLV ‐ IInfecton （ HTLV ・ I 感 染 に 伴 う ラ ッ ト に お け る 脊髄オリゴデンドロサイト細胞死の invitro 解析）
HTLV‑I (humanTcell leukemla vlrusぢpeI） は 成 人T細 胞 自 血 病 （adultTcen leukemia， パrL）の 原因 ウイ ルス であ るほ か、 下肢 の対 麻痺 を主 徴 とす る慢 性脊 髄 症（HTLV‐Iassociatedmyelopathy／troplcspasticparaparesis，HAM／TSP）や慢性関節 症 な ど の 病 因 と し て も 注 目 さ れ て き て い る 。 し か し 、 そ の 発 症 機 構 に 関 し て は 不 明 な 点 が 多 く 、 病 因 解 明 の 突 破 □ と し て 動 物 モ デ ル の 開 発 が 強 く 望 ま れ て き た 。 申 請 者 の 教 室 で は1992年 にHTLV‐I感 染 ラ ッ ト を 作 製 し 、WKAH系 ラ ッ ト の み に ヒ トHAM/TSPに 類 似 す る 脊 髄 の 脱 髄 性 病 変 を 主 体 と す る 慢 性 進 行 性 脊 髄 症 （HAMラ ッ ト 病 ） を 発 症 さ せ る こ と に 成 功 し た 。 一 連 の 研 究 に よ りHAM ラ ッ ト 病 の 脱 髄 機 構 と し て 脊 髄 で のbcl‐2の 強 い 発 現 抑 制 とHTLV−ITaxの 発 現 に よ る 直 接 的 、 あ る い は 間 接 的 にHTLV−I感 染 細 胞 か ら 産 生 さ れ るTNF‐aを 介 し た オ リ ゴ デ ン ド 口 サ イ ト の ア ポ ト ー シ ス 誘 導 が 重 要 で あ る こ と を 示 唆 し て き た 。 本 研 究 はHnV‐I感 染 ラ ッ 卜 脊 髄 で の オ リ ゴ デ ン ド 口 サ イ ト の 細 胞 死 の 機 序 解 明 を 目 指 し 、HnV‐I感 染 ラ ッ ト 脊 髄 か ら オ リ ゴ デ ン ド 口 サ イ ト や ミ ク 口 グ リ ア を 高 純 度 分 離 培 養 し 、 免 疫 染 色 や 分 子 生 物 学 的 手 法 及 びTNF‐aや 血 清 に対する感受性などを検討した。
免 疫 組 織 化 学 的 検 索 に よ り 、HAMラ ッ ト 病 変 脊 髄 の 白 質 や 灰 白 質 でTax蛋 白 の 発 現 細 胞 を 確 認 し た 。 さ ら に 、 こ のTax陽 性 細 胞 数 は HAM発 症 系WKAH ラ ッ ト でHAM非 発 症 系 の LEWやACIの ラ ッ ト に 比 ベ 多 数 を 認 め た 。 次 に 、 HAM発 症 に 密 接 に 関 わ っ て い るH孔V―IpXmRNA発 現 に つ い て 、 分 離 し た ミ ク 口 グ リ ア と オ リ ゴ デ ン ド 口 サ イ ト に つ い てRT‐PCR法 に よ り 検 討 を 行 っ た 。 その結果、相対的にミク口グリア に強い発現を認めた。
ELISA法 に よ りH孔V―I感 染 ラ ッ ト と 正 常 ラ ッ ト の ミ ク 口 グ リ ア 培 養 上 清 に お け るTNF‐aの 産 生 を 検 討 す る と 、10ケ 月 齢 か ら14ケ 月 齢 で はHTLV−I感 染 ラ ッ ト と 正 常 ラ ッ ト 間 で 有 意 な 差 は 認 め ら れ な か っ た が 、17ケ 月 齢 か ら 感 染 ラ ッ ト で 有 意 な 高 産 生 を 認 め た 。 培 養 脊 髄 オ リ ゴ デ ン ド 口 サ イ ト のTNF‐aに 対 す る 細 胞 傷 害 感 受 性 を 検 討 し た 。TNF‐aの 添 加 はHTLV‐Iの 感 染 の 有 無 に か か
敬光 郎 利和 木出 嶋 吉上 長 授授 授 教教 教 査査 査 主副 副
わらず全ての系統に濃度依存性に死細胞数が増加を誘導した。さらにHAM発 症WKAH系 ラットのオ リゴデンド口サイトは他系統ラットに比べその傷害感 受性は高く、HTLV−I感染はその感受性を亢進した。TNF receptorlのメッセー ジは H'I‑LV−I感染の有無を問わずオリゴデンドロサイトとミク口グリア両方に 確認された。一方、FCSやラット血清によるオリゴデンド口サイ卜への細胞傷 害性について検討すると、血清の存在はオリゴデンド□サイトに細胞死を誘導 した。なかでもWKAH系は非発症系より死細胞数の割合が多く、HTLV−I感染 はこの細胞死も増加させた。ラット血清を用いて血清内の細胞傷害因子を検討 した結果、IgGや補体で代表される熱不安定の因子と細胞死の関係を認めなか った。また、その細胞障害因子の蛋白サイズは約100〜300kDaであると想定さ れた。最後に、中枢神経で重要なアポトーシス抑制因子であるbcl‑2の発現の 変化 について検 討した。HILV‑I感染WKAHラットのオリゴデンド□サイトで は7〜12ケ月齢で高度なbcl‑2発現抑制を認めた。18ケ月齢では発現量の回復傾 向を見たが、9ケ月齢の正常ラットの半分以下であった。一方、この感染WKAH ラッ トのミク口 グリアでは正常WKAHラッ卜に比べは有意な低下は認めなか った。
以上 、HAMラ ット病発症 にはpXやTNF‑aの発現のほ かオリゴデ ンド口サ イ ト の bcl‑2の 発 現 抑 制 が 深 く 関 わ っ て い る こ と を 示 し た 。 申請者の学位論文内容の発表後、副査の上出利光教授からミク口グリア細胞 同定法やTNF‑aに対する細胞感受性の系統差についての質問があった。また、
なぜ脊髄のオリゴデンド口サイトだけ特異的に傷害されるのかについて質問が あった。次いて、副査の長嶋和郎教授から大脳のオリゴデンド口サイ卜との比 較や感染細胞の同定についてin situ PCRでの結果と分離したミク口グリアとオ リゴデンド口サイトのRT‑PCRによる検出結果の相違について質問があった。
また、bcl−x，baxやcaspaseなど最近の研究動向について質問があった。最後、
この実験のモデルから、ヒトのHAMの発症機構に対して、どのようなことが わかったかと質問があった。最後に、主査の吉木からこの動物モデルの今後の 研究や応用について質問、助言があった。
申 請 者 は 自 分 の 実 験 結 果 や 過 去 の 文 献 を 引 用 し 適 切 に 回 答 し た 。 この 研 究は 今 後、 ヒ トH AM/TSPの も なら ずHIV脳 症やMSを含む 原因不 明の脱髄性疾患の発症機構の解明や新しい治療法の開発に貢献すると期待され る。
審査員一同は、これらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑚や取得 単位なども併せ申請者が博士（医学）の学位を受けるのに充分な資格を有する ものと判定した。
