博士(医学

氏

生年月日

本籍(国籍)

学位の種類

学位論文審査結果の報告書

名 中村文久

学位授与の条件 (博士の学位)

4召和>,・平成田

和歌山県

博士(医学

医第1270号

学位規程第5条該当

Cyclic compressive load血g activates angiotenS血Π type l receptor in articU1雛血ondrocyteS 釦d stimulates hypertr0血ic d iHerentiatlon through a G‑protein‑deP印deⅡt patl"阻y

(関節軟骨細胞に対する周期的圧迫負荷はアンギオテンシンⅡ1型受容体の

Gタンパク共役系を活性化し軟骨肥大分化を惹起する) 年6月

学位論文受理日 学位論文審査終了日

羽 日

審査委員

2018年 加W年

(主査)

(副主査)

(副主査)

(副査)

指導教員

15日 18日

磯貝典孝 有馬秀二 梶博史

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赤木將男

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学位記番号

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月月

W制

関節軟骨細胞に発現する angiotensin n type lreceptor (ATIR)の、機械刺激受容体としての機能を 明らかとすることを目的とした。

【方淘

8週齢雄のC57BL/6マウスの膝に、変形性膝関節症を誘発する標準的な外科的手技である destabilization of 血e medialmeniscuS手術を施行し、術後4週と 8週で安楽死させて、関節軟骨の変性 の程度を mod途ed Mankinscore を用いて組織学的に評価するとともに、 ATIRの発現を免疫組織学的に 評価し、inviv0における変形性関節症の進行と ATIRの発現の相関の有無を検討した。

ウシ関節軟骨初代培養細胞をアガロースゲルに包埋し8日問三次元培養した後に、周期的圧迫負荷 (20kpaの常時負荷に、 2秒間の20kpaの追加負荷を 1秒毎に追加)を 30分間加え、軟骨細胞の肥大分 イヒ進展の指1票とされる type x c0Ⅱagen (C01.X)の発現を quantitative reverse transcription polymerase Chain reaction (QRT・PCR)及び Western blot analysiS により評価し、 runt・related transcription factor 2 (RunX2)の発現を QRT・PCRで評価し、 ATIR下流のサイトカインのりン酸化を Bio、pleX を用いて定 量した。また、 ATIRの選択的阻害薬である olmesartan を同三次元培養に投与して、これらの測定項目 がどのような変化を受けるのかを評価し、関節軟骨細胞におけるATIRの機械刺激受容体としての機能 を in vitr0 で検討した。

【結果】

Modi6ed Mankinscoreと ATIRの免疫組織学的発現率に有意な相関を認め、変形性関節症の進行に 伴って関節軟骨細胞におけるATIRの発現が有意に増加することを確認した。

また、周期的圧迫負荷により C01.X と RunX2の発現量は有意に増加したが、 olmesartan を投与するこ とにより周期的圧迫負荷によるこれらの増加は有意に抑制された。 Bio、pleXによるサイトカインの測定で は、 JNK,src,STAT1のりン酸化が周期的圧迫負荷により有意な上昇を示したが、 olmesartanの投与に よりそのりン酸化が有意に抑制されたのはG蛋白依存経路のJNKのみであった。

【考察】

関節軟骨細胞においてATIRは変形性関節症の進行に伴って発現し、機械刺激受容体として機能して G蛋白依存経路を通じて軟骨肥大分化を促進するものと考察される。

【結論】

関節軟骨細胞に発現するATIRは機械刺激受容体として機能し、軟骨肥大分化を促進する。

文内容の要

‑ 10‑

旨論

ノ气、

2018年5月日公表予定 (doi:10.1002/22Ⅱ5463.12438) Cyclic compressive loading activates angiotensin 11 type l receptor in articular chondrocytes and Stimulates hypertrophic di丘erentiation through a G・protein・dependent pathway

表 年 月 日

ノ、

出版物の種類及び名称

文

博士学位論文 FEBs open Bio

V01.8 (1R 2.143)(inNess) 2018年5月日掲載予定

博士論文の印刷公表

1)学位論文の要旨

【目的】、{、̲、,ー 変形性膝関節症は、高血圧症を合併する割合が高いことが報告されている。しかし、変形性膝関節 症と高血圧症の関連にっいて、その詳細は明らかではない。従来の心筋細胞や卵巣細胞を用いた研 究では、機械的刺激により血圧の調整因子であるレニンアンギオテンシン系の主要受谷体である A昭iotensin n Type l Receptor (ATIR)力W舌性化することが知られている。近年、肥大分化過程

にある関節軟骨細胞においてもATIR発現することが報告されたが、その発現機序および変形性 膝関節症との関連は依然として不明である。そこで本研究では、①機械的刺激はATIRのりガン

ドとなりえるか(in vitro)、②関節軟骨細胞における灯IR発現機序(in vitro)および(2) ATIR発現と変形性膝関節症との関連性(invivo)を明らかとすることを目的とした。

【方法】、、̲、̲ Nケ h vi杠0:ウシ関節軟骨初代培養細胞をアガロースゲルに包埋し8日間三次元培養した後に、周期 的圧迫負荷(20kpaの常時負荷に、 2秒間の20kpaの追加負荷を1秒毎に追カロ)を30分間加えた0 軟

骨細胞の肥大分化進展の指標とされるWpe x c0Ⅱ昭即(C01.X)の発現を、 QRT‑PCR及びWestem

blot 肌alysiSにより評価し、さらにRunX2 (r如t‑related tr釦Scription factor 2)の発現を QRT‑PCRで評価した。また機械的刺激(周期的圧迫負荷)がATIR下流の細胞内シグナル伝達に及ぼ す影響を検討するため、 Bio‑pleXを用いてGタンパク依存経路(J NK)および非依存経路(src

(SRC)、 STAT I)の発現を検討した。次に、 ATIRの選択的阻害薬(肌B)である01鵬Sart肌 を同三次元培養に投与して、これらの経路の発現がどのように変化するのかにっいて検討した。

Invivo:8週齢雄のC57N/6マウスの膝に、変形性膝関節症を誘発する標準的な外科的手技である destabilization of the 鵬dial meniscuS ΦMM)手術を施行し、術後4週と8週における関節軟骨 の変性の程度を組織学的に評価した。さらにATIRの発現を免疫組織学的に評価し、 ATIRの発現と変

形性関節症の進行の相関を検討した。

【結果】、、ず

(1) 1nvitr0の結果:機械的刺激(周期的圧迫負荷)により、アガロースゲルに包埋された関 節軟骨細胞のC01.XおよびR如X2の発現量は有意に増加した。一方、 ATIRの選択的阻害薬01鵬Sart肌 の投与により、これらの増加は有意に抑制された。また酎0‑H餓を用いた細胞内シグナル伝達の検 討より、機械的刺激(周期的圧迫負荷)により、 JNK、 SRC、 STAT1の発現量は有"思な上昇を示し た。一方、0鵬Sart釦の投与により有意に発現抑制された経路は、 Gタンパク依存経路 qN玲のみ であった。これらの結果から、機械的刺激(周期的圧迫負荷)によって発現するATIRの細胞内伝

達シグナルは、 Gタンパク依存・非依存性の両経1各で伝達され、 olmesart肌の投与により、 Gタン

パク依存経路σN玲が抑制されることが明らかとなった。

(2) 1n viv0の結果: Modified Mankin scoreを用いた組織学的検討より、変形性膝関節モデル における軟骨変形は、病態の進行に伴いスコアの上昇傾向が観察された。さらに免疫組織学的枝討 より、 Modified M肌Mn score とAT1即昜性細胞の発現率に間に有意な相関力靖忍められた。この結 果、変形性関節症の病態進行に伴い、関節軟骨細胞のATIR発現が有意に増加することを確認した。

【考察および結論】本研究結果より、関節軟骨細胞では変形性膝関節症の進行に伴いATIRが機械刺 激受容体として発現し、Gタンパク依存・非依存経路を通じ,て関節軟骨細胞の肥大分化が惹起され る機序が明らかとなった。今後、 ATIRの選択的阻害薬(A郎)は変形性関節症の治療において有効

な手段となり得ることが示唆された。

関節軟骨細胞の肥大分化過程は、主に山発生過程の成長軟骨線に認められる骨形成、②骨折部位 での骨再生、③関節軟骨の老化変性において観察される。しかし、どのような調節を受けて軟骨 細胞が肥大分化し、その後アポトーシスへ向かうのか、その機序は未だ不明である。近年、高血圧 症と運動器疾患の関連が疫学的に示されており、レニンアンギオテンシン系の主要な受谷体である アンギオテンシンΠ一型受容体(ATIR)が関節軟骨細胞の肥大分化に関与することが報告された。

本論文では、invHr0および血 Viv0の両実験系を用いて、①関節軟骨細胞において、機械的刺激 (周期的圧迫負荷)がATIRのLi部ndとして機能する②細胞内シグナル伝達は、非りガンド依存性 に、Gタンパク依存経路および非依存経路の両者を介して行われる③機械的刺激(周期的圧迫)に よるATIRの細胞内シグナル伝達は、 ATIRの選択的阻害薬(態B)の投与により抑制される、ことを 明らかとした。本論文の結果から、関節軟骨細胞の肥大分化の調節において、ATIRが大切な役割を 担うことが明らかとされ、今後、変形性膝関節症の治療法としてATIRの選択的阻害薬(凪B)の投 与が有効な手段となり得る可能性が期待される。本研究は、ATIRに着目した関節軟骨細胞の肥大変 性の調節に関する独創的研究であり、 originaliWの高い研究論文と思われる。

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2)論文審査結果の要旨

これらの多方面にわたる質問に対して、著者は、具体的な例をあげながら極めて的確に応答した。

また、論文内容から変形性膝関節症に対する整形外科的治療の知識、技術などにっいても卓越した 見識を持っことが確認された。したがって、主査・副査は合議の上、提出され戸学位論文が確かに 中村文久氏の研究成果であること、学位授与にふさわしい外科的知識や能力を合わせて持っものと

判断し最終試験を合格と判定した。

3)最終試験の結果:合格 4)学位授与の可否:可

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験査

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